第14章_核酸的物理化学性质
15 核酸的物理化学性质-王镜岩生物化学(全)
（3）低盐变性：<0.01mol/l时，由于 磷酸基的静电斥力，可以配对的碱 基无法相互靠近。 （4）变性剂：尿素 、甲醛 ，可以打 开氢键
2. 核酸变性的特点
• （1）一系列物化性质也随之发生改变 ： 紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密 度升高，酸碱滴定曲线改变等 • （2） 变性作用发生在一个很窄的温度 范围内 。 • 通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去 一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温 度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在82— 95℃之间
(3) 限制性内切酶
限制性核酸内切酶：存在于细菌体内的，专门降
解外源 DNA ，是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种
特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内 切酶。 往往与一种甲基化酶同时成对地存在。识别相 同的碱基序列，当内切酶作用位点上的某一些碱基
被甲基化修饰后，限制酶就不能再降解这种DNA了。
1. 引起核酸变性的因素
（1）热变性：加热使氢键断裂，碱基分子内 能升高，碱基堆积力减小，使用最广泛。缺 点是高温可能引起酯键断裂，得到长短不一 的单链DNA；80～100℃ （2）酸碱变性：在pH<4.5或pH>11即可引起变 性。在制备单链DNA时优先采取pH=11.3的碱 变性，全部氢键都被淘汰。
（2）、有足够的温度以破坏无规则的
链内氢键，但又不能太高，否则配对碱 基之间的氢键又难以形成，一般用比Tm低
20--25℃的温度。
将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能
复性。缓慢冷却时，可以复性---退火。
（3）、DNA的性质也影响复性
DNA的片段越大，复性越慢。
DNA的浓度越大，复性越快。
重复序列越多，复性越快。
核酸的理化性质
线
尿嘧啶核苷酸
pK1 = 1.0 第一磷酸基
pK3 = 6.4 第二磷酸基
烯醇式羟基
21
pH
由于核苷酸含磷酸与碱基，为两性电解质，它们在不 同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离 子。
在第一磷酸基和含N环解离曲线的交叉处，带负电荷的 磷酸基与带正电荷的含N环数目相等，此时pH即为核苷酸 的等电点：
完全水解 完全水解
嘧啶碱回收率高
6
二、碱水解
RNA的磷酸酯键对碱敏感、因此RNA易被碱水解， 产生核苷酸。 在室温，0.3～1mol/L KOH，24h，就可将RNA完全水 解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。
DNA无2′-OH，因此对碱有一定抗性：
生理意义： DNA更稳定 ，是遗传信息的载体。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
3.链球菌脱氧核糖核酸酶类
是一个内切酶，作用于DNA，产物为5’磷酸为末端的碎片，长度 不一，最适PH为7，需镁离子参与。
Dase只作用于DNA 12
4.限制性内切酶：
在细菌中发现有这类酶，主要降解外源DNA，第一个发现的限制 性内切酶是从大肠杆菌(E.coli.)中发现的(1968年)。
限制性内切酶的命名（以EcoR I 为例）：
7
三、酶水解
（一）核酸酶的分类
①按底物专一性分类：
RNase（核糖核酸酶） DNase（脱氧核糖核酸酶）
核酸内切酶 ②按对底物作用方式分类： 核酸外切酶
小球菌核酸酶：内、外切均可 ③按磷酸二酯键断裂方式分类：
3′-OH与磷酸基之间断裂 如 蛇毒磷酸二酯酶
5′-OH与磷酸基之间断裂 如 牛脾磷酸二酯酶
磷酸基（含两个羟基）的解离
王镜岩《生物化学》第三版考研笔记(提要版本071页)
王镜岩《生物化学》第三版考研笔记（提要版本071页）内容提要：1、氨基酸与蛋白质氨基酸分类：常见蛋白质氨基酸，不常见蛋白质氨基酸，非蛋白氨基酸；氨基酸的酸碱化学，氨基酸两性解离，氨基酸的等电点；氨基酸的旋光性和紫外吸收。
蛋白质的共价结构：蛋白质的化学组成和分类，蛋白质功能，蛋白质的形状和大小，蛋白质构象和组织层次。
肽：肽键结构，肽的物理化学性质，活性多肽。
蛋白质一级结构测定：Sanger试剂，DNS及Edman降解，二硫桥位置确定。
蛋白质的三维结构：XRD原理；稳定蛋白质三维结构的作用力，肽平面和两面角；蛋白质的二级结构：α-螺旋，β-折叠片，β-转角；超二级结构和结构域；球状蛋白的三级结构；亚基缔合和四级结构。
蛋白质结构与功能的关系：肌红蛋白和血红蛋白的结构与功能，镰刀状细胞贫血病；免疫球蛋白。
蛋白质的分离、纯化和表征：蛋白质分子量测定，沉降分析及沉降系数，沉降系数单位，凝胶过滤及SDS-PAGE法测分子量；蛋白质的沉淀；电泳：区带电泳、薄膜电泳、等电聚焦电泳、毛细管电泳。
2、酶和辅酶酶催化作用特点：反应温合、高效、专一、可调节控制；酶活性调节控制：调剂酶浓度、激素调节、反馈抑制调节、抑制剂激活剂调节、别构调控、酶原激活，可逆共价修饰；酶的化学本质及其组成，辅酶和辅基，单体酶，寡聚酶和多酶复合体。
酶的命名和分类：习惯命名法；国际系统命名法及酶的编号，六大类酶的特征。
酶的专一性：“锁与钥匙”学说；诱导楔合假说；过渡态理论，过渡态类似物与医药和农药的设计，催化抗体。
酶的活力测定：酶活力单位，比活力。
酶工程：化学修饰酶，固定化酶，人工模拟酶。
酶促反应动力学：底物浓度与酶反应速度，酶促反应动力学方程式及推导，米氏常数的意义和求法。
酶的抑制作用：不可逆抑制和可逆抑制及动力学判断，一些重要的抑制剂，有机磷农药和磺胺药作用机制。
温度、PH、激活剂对酶反应影响。
酶的作用机制：酶活性部位及研究方法；影响酶催化效率的有关因素：临近和定向效应、底物形变和诱导契合、酸碱催化、共价催化、金属离子催化、多元催化和协同效应、微环境影响；溶菌酶作用机制和胰凝乳蛋白酶。
核酸的性质
核苷酸的紫外摩尔吸 收值最高
单链核酸紫外摩尔吸 收值其次
双螺旋核酸紫外摩尔 吸收值最低（双螺旋 结构使碱基对的p电子 云发生重叠而减少了 紫外光吸收）
核酸的变性、复性和杂交
DNA的热变性（熔解）过程是突变性的，它在很 窄的温度区间内完成。
将紫外吸收的增加量达最大量一半时的温度称熔解 温度，用Tm表示。 一般DNA的Tm值在70-85C之间。DNA的Tm值 与分子中的G和C的含量有关 G和C的含量高，Tm值高。测定Tm值，可反映 DNA分子中G, C含量，可通过经验公式计算： （G+C)%=(Tm-69.3)*2.44
核酸的物理化学性质
核酸的水解 核酸的磷酸二酯键和糖苷键可 以被水解
室温条件下，DNA在碱中变性， 但不水解，RNA水解，水解产物为 2’-和3’-核苷酸的混合物。
在稀酸中，DNA容易脱嘌呤， RNA稳定；加酸加热条件下， DNA和RNA能完全水解
核酸的酶水解
核酸水解酶的分类 根据底物：
核糖核酸酶（ribonuclease, RNase） 脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase）
将热变性的DNA骤然冷却至低温时，DNA不 能复性（淬火）。变性的DNA缓慢冷却时可复 性，称为“退火” 影响复性的因素： DNA的浓度 ，DNA片段 的大小，温度，片段复杂性（重复序列数目）
复性的速度以Cot1/2来衡量，指复性完成一半 时的Cot值（Co是DNA的浓度，t是时间）
核酸的杂交
指不同来源的单链核酸之间可通过碱基互补形 成双螺旋结构 利用核酸杂交可检测特定的核苷酸片段或研究 同源性等 Southern 杂交（Southern bolting）： DNA-DNA Northern 杂交（Northern bolting）： DNA-RNA
《生物化学》核酸的物理化学性质
的寡聚核苷酸，细菌中发现的这类酶，主要是降解外源的 DNA ，具有很严格的碱基序列专一性。如 EcoRⅠ，不需要ATP，只需要镁离子，专一性很 强，能识别DNA上6对碱基组成的序列，交错切割，
9.8
N
N
H
NH
N
NH
H
O O
HN
NH+
pK1' 3.2
N
HN
H
H2N
N
NH
H2N
N
NH
N
N
N-
pK
' 2
9.6
H
鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上
O
O
N-
NH+
pK3' 12.4
N-
N
H2N
N
H
NH
H2N
N
N-
3、核苷酸的解离：
由于核苷酸含有碱基和磷酸基，为两性电解质，在 不同的pH溶液中解离程度不同，在一定条件下可以形成 兼性离子。核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离， 核酸的酸碱性质与此有关。
质(如核酸、蛋白质、细胞结构等)的性质或物理状态的一类标记 分子。
探针技术是在核酸杂交的基础上发展起来的一种用于研究和
诊断的非常有用的技术，已在遗传性疾病诊断上开始应用。
例如诊断地中海贫血或血红蛋白病，可以由已确诊的病人白细胞中提取 DNA，这就是诊断探针。用诊断探针检查，不但可以对有症状患者进行确诊，还 可以发现一些没有症状的隐性遗传性疾病。如从胎儿的羊水可以提取到少量DNA 后，再用探针技术对此进行产前诊断各种遗传性疾病已在临床上开展。
核酸的理化性质
限制性内切酶
原核生物(及病毒)中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中 4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列， 并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末 端，这类酶称为限制性内切酶（ristriction endonuclease）。 山东落花生花落东山 帘卷晚晴天，天晴晚卷帘 Was it a cat I saw?
二、核酸的酸碱性质
1、碱基的解离
2、核苷的解离
3、核苷酸的解离
结合及释放 质子的能力
第 1、碱基的解离 14 章 碱基：含氮碱基，杂环化合物（很多生物碱的结构） 核 1）、具有芳香环的结构特征，呈平面或近乎平面 酸 含有共轭双键体系，紫外区有吸收（260nm）。 的 物 2）、氮原子位于环上或取代氨基上 弱碱性来自于环上氮原子，pKa约9.5，倾向于接受H 理 取代氨基（或曰碱基环外的氨基）碱性很弱，生理 化 条件下不能被质子化。 学 性 质
核酸的物理化学性质
一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收性质 四、核酸的变性、复性及杂交
一、核酸的水解
（一）酸水解 糖苷键比磷酸二酯键 更易被酸水解 嘌呤碱基的糖苷键比 嘧啶碱基的糖苷键对 酸更不稳定
NH 2
酯键
O
N N O
N 9 N
5' HO P O CH2 O
-
糖苷
1' H H 2' OH
H
H OH
腺苷酸
（二）碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱 水解，产生核苷酸。 由于RNA的核糖上有2’OH基，在碱作用下形成 磷酸三酯。 磷酸三酯极不稳定，随 即水解产生，产生 2’,3’-环磷酸酯，再水 解成2’-核苷酸及3’-核 苷酸
大学《物理化学》14.高分子溶液
4. Z均相对分子质量 均相对分子质量
MZ
ω ω
B
M
Z
=
∑ ∑
B B
M M
2 B
B
B
•
相对分子质量大的级分对 大于
MZ
的贡献
Mm
•
通过超离心沉降平衡法测得
说明： 说明： 1）对多级分体系 ）
M Z > M m > Mη > M n
2) 分子越不均匀 即相对分子质量分布越宽 它们的 分子越不均匀, 即相对分子质量分布越宽, 差别就越大
由于高分子主链上常连有侧链或其它基 团，将会对高分子链的内旋转造成阻碍，此 将会对高分子链的内旋转造成阻碍， 时，溶液中的高分子链的内旋转常以若干个链 节为一个旋转动力单元。 节为一个旋转动力单元。
此动力单元称为------ 链段 此动力单元称为
2） 链段 -------主链上独立运动的小单元 ） 链段: 主链上独立运动的小单元. 主链上独立运动的小单元 一般一个链段含多个链节。链段越多, 一般一个链段含多个链节。链段越多 分子在空 间的构象就越多， 间的构象就越多，分子在每时每刻表现的形态则各不 相同，此时分子的柔顺性越好； 相同，此时分子的柔顺性越好； 若一个链段只含一个链节时, 若一个链段只含一个链节时 分子的柔顺性达到 最大； 最大； 分子越柔软，卷曲就越厉害， 分子越柔软，卷曲就越厉害，因此高分子在溶液 中的常见形态是----------- 无规线团 中的常见形态是
PH值: 影响高分子电解质，等电点处，分子的柔顺性 值 影响高分子电解质，等电点处， 差，在酸、碱侧，柔顺性增强。 在酸、碱侧，柔顺性增强。
二． 高分子化合物的溶解过程
首先溶剂分子由于扩散作用而陆续渗入高分子链 段间的空隙，使分子体积不断澎大， 段间的空隙，使分子体积不断澎大，链段间的相互作 用逐渐减弱，链段的运动越来越自由， 用逐渐减弱，链段的运动越来越自由，----------- 溶胀 溶胀后的高分子在溶剂中进一步相互分离， 溶胀后的高分子在溶剂中进一步相互分离，溶剂 与高分子相互扩散， 与高分子相互扩散，最后形成高分子溶液 -----------溶 溶 解（或无限溶胀） 或无限溶胀）
15-核酸的理化性质和研究方法
1Biochemistry. LuJie陆婕Lujie.jane@华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与生物化学研究所生物化学BiochemistryBiochemistry. LuJieChapter 15Nucleic Acids:Properties and Techniques核酸的理化性质和研究方法2Biochemistry. LuJie核酸的化学结构和作为高聚物决定其理化性质：核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解；磷酸基和碱基：酸碱性质；碱基：紫外吸收特性；双螺旋结构：变性和复性。
3Biochemistry. LuJie核酸的性质溶解度：溶于水酸碱性：生理pH带负电荷分子量和形状：DNA 108~1012，d/l=10-7，“柔性棒”——高黏度不对称性——正旋光性紫外吸收——260nm有最大光吸收核酸的离心沉降DNA 的变性与复性4Biochemistry. LuJie一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性及杂交五、核酸的分离和纯化六、核酸序列的测定七、核酸的化学合成八、DNA微阵技术5Biochemistry. LuJie（一）酸水解糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解，产生嘌呤和嘧啶碱（二）碱水解: RNA→2’-核苷酸，3’-核苷酸RNA的磷酸酯键更易被碱水解（RNA的核糖上有2’-OH，在碱作用下形成磷酸三酯，极不稳定易水解，产生核苷2’，3’-环磷酸酯，继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸）（三）酶水解（消化）专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为核酸酶(nuclease)。
能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）。
67Biochemistry. LuJie限制性DNA 内切酶: 专一性的核酸内切酶，能识别双链DNA 分子的特定序列，并可在该位置或其附近同时切断双链DNA 。
Biochemistry. LuJie核酸外切酶（endonuclease）：从多核苷酸链的末端开始,逐个将核苷酸切下的酶，如：♦3’→5’外切酶(蛇毒磷酸二酯酶)：在3’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）；♦5’→3’外切酶(牛脾磷酸二酯酶)：在5’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。
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核酸嘌呤碱的 N9 和嘧啶碱的 N1 与戊 糖的C1形成N－糖苷键。磷酸基与2种戊 糖分别形成核糖磷酸酯和脱氧核糖磷酸 酯。所有这些糖苷键与磷酸酯键都能被 酸，碱和酶水解。
N-糖苷键
（一）酸或碱水解
核酸中的磷酸二酯键可在酸或碱性条件下水解切断，但 DNA和RNA对酸或碱的耐受程度有很大差别。 如：在0.1mol/L NaOH溶液中，RNA几乎可以完全水解， 生成 2 ’－或 3 ’－磷酸核苷， DNA 在同样条件则不受影响。 这种水解性能上的差别与 RNA 核糖基上 2 ’－ OH 的邻基参与 作用有很大的关系，在 RNA 水解时， 2 ’－ OH 首先进攻磷酸 基，在断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯，再在碱的作用 下形成水解产物。 但在酸性条件下，DNA的糖苷键比 RNA的糖苷键易水解， 嘌呤碱基比嘧啶碱基易水解，如 DNA 的嘌呤碱在 pH2 以下 即可脱落而使DNA成为无嘌呤酸。
核酸的溶液的紫外吸收又可以用摩尔磷的吸光度 ε（ P ）表示： A ε（ P ）＝ cL
其中A为吸光值，c为每升溶液中磷的摩尔数，L为比色杯内径。摩尔 磷即相当于摩尔核苷酸.
研究发现， DNA 双螺旋结构可使 碱基对堆积，造成π 电子云重叠， 产生低吸收效应，如变性破坏 DNA 的碱基对，则可使紫外线吸收增加 大约25 ％，此现象称增色效应。据 此我们可判断 DNA 制剂是否发生 变化。 如 DNA 的 摩 尔 磷 紫 外 吸 收 ε （ P ）约为 6000 ， 变性后变为 10000。
2）结果： A、增色效应：260nm紫外吸收增加；
B、粘度下降、浮力密度上升；
C、生物学性能部分或全部丧失。
3）引起变性的因素：
温度、pH、尿素（测定DNA序列时常用的变 性剂）、甲醛（测定RNA分子大小时常用的变性 剂）等。
2、核酸变性示例——热变性与Tm
1 ） Tm 定 义 ： 当 DNA 的 稀盐溶液加热到 80 ～ 100 度时，双螺旋结构解体， 形成无规则线团，研究发 现， DNA 的变性是爆发式 的，变性作用发生在一个 很窄的温度范围内，有一 个相变的过程，通常把加 热变性使 DNA 的双螺旋结 构失去一半时的温度称为 该 DNA 的熔点或熔解温度 （ melting temperature), 用 Tm 表示。 DNA 的 Tm 一般 在82－95°C之间。
（二）酶水解
• 生物体内存在多种核酸水解酶。这些酶可以催化水解分类 以DNA为底物的DNA水解酶（DNases）和以RNA为底物的 RNA水解酶（RNases）。 2、按磷酸二酯键断裂方式分：作用于3’－磷酸酯键（降解 核苷酸带5’－磷酸）；b、作用于5’－磷酸酯键（降解核苷 酸带3’－磷酸）。
三、核酸的紫外吸收
1、原理： 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键， 使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240 －290nm的紫外波段有一强烈的吸收 峰，最大吸收值在260nm附近。
DNA
2、应用
1）不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光光度计进行 定性、定量测定。 A值为1相当于：50μg/ml DNA 40μg/ml 20μg/ml RNA Nt(寡核苷酸）
作用点为3’－鸟苷酸与其相邻核苷酸的5‘－OH之间的 连键，产物为3’－鸟苷酸或以3’－鸟苷酸为结尾的寡 核苷酸）； 核糖核酸酶T2（其作用位点为Ap残基，可以将tRNA完 全降解为3’－腺苷酸结尾的寡核苷酸)。
RNaseⅠ
2）脱氧核糖核酸酶
• （ 1 ）牛胰脱氧核糖核酸酶（ DNase Ⅰ），此酶断开双 链DNA或单链DNA成为5’－磷酸为末端的寡核苷酸，平 均长度为4个核苷酸； • （2）牛脾脱氧核糖核酸酶（ DNase Ⅱ），此酶只降 解DNA成为3’－磷酸末端的寡核苷酸，平均长度为6核 苷酸; • （3）链球菌脱氧核糖核酸酶，其只作用于DNA，产物 为5’－磷酸为末端的碎片，其长度不一，需Mg2+。
对于不纯的核酸可用琼脂糖凝胶电泳分离出区带之后， 经EB染色后在紫外灯下粗略的估计其含量。
2）确定所提取的核酸是否纯品。
1）DNA： ≈ 1.8 纯品 OD260/OD280 ＞ 1.8 RNA 污染 ＜ 1.8 protein污染 2）RNA： OD260/OD280 ≈ 2.0 纯品
3）判断DNA制剂是否发生变形或降解
3）内切酶
二、核酸的酸碱性质
核酸的碱基、核苷、核苷酸均能发生解离，因此核酸是两 性电解质。 与蛋白质相似，核酸分子中既含有酸性基团（磷酸基）也 含有碱性基团（氨基），因而核酸也具有两性性质。 由于核酸分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱性（氨 基）是一个弱碱，所以核酸的等电点比较低。如DNA的等电点 为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5。 RNA的等电点比DNA低的原因，是RNA分子中核糖基2′-OH 通过氢键促进了磷酸基上质子的解离，DNA没有这种作用。
• 3、根据作用方式又分作两类：核酸外切酶和 核酸内切酶
•
•
1）核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端 （3′-端或5′-端）开始，逐个水解切除核苷酸；
2）核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从 多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。
4、常用核酸酶
1）核糖核酸酶 牛胰核糖核酸酶（简称RNaseⅠ，其作用点为3’－ 嘧啶核苷酸与其它核苷酸之间的连键，产物为3’－嘧 啶核苷酸或以3’－嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸）； 核糖核酸酶T1（其有比RNaseⅠ更高的专一性，它的
四、核酸的变性、复性及杂交
• （一）DNA变性
1、概念：它是指 DNA 双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并 不涉及共价键的断裂。 如多核苷酸骨架上共价键断裂则称为核酸的降解，降解 可使核酸相对分子量降低。
1）核酸变性后形态的改变
双螺旋DNA和具双螺旋区的RNA氢键断裂，空间结构被
破坏，形成单链无规则线团状的过程。
2）DNA Tm值的影响因素
• （1）DNA的均一性
均 质 DNA 如 一 些 病 毒 的 DNA， 人工合成的多聚腺嘌呤－胸腺 嘧啶脱氧核苷酸熔解过程发生 在一个较小的温度范围之内， 异质 DNA 熔解的过程发生在一 个较宽的温度范围之内，所以 Tm 值可作为衡量 DNA 样品均一 性的标准。