(推荐)核酸的物理化学性质
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核酸理化性质讲义
核算理化性质-讲义目录1.一般物理性质；2.核酸的紫外吸收；3.变性；4.复性；5.杂交；教学目的：了解核酸的一般物理性质及DNA序列的测定方法，掌握核酸的紫外吸收特性、变性和复性及核酸的分离、提纯和定量测定。
教学重点：核酸的紫外吸收及变性和复性；教学难点：核酸的变性和复性1.一般物理性质1.1形态DNA —— 白色纤维状固体 RNA —— 白色粉末状固体1.2溶解性微溶于水；不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；用乙醇可以沉淀核酸。
RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L NaCl溶液；DNP可溶于1~2mol/L的NaCl溶液；RNA在碱性溶液中不稳定； DNA在碱性溶液中稳定。
显色反应：利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。
核糖与地衣酚（3,5-二羟甲苯）试剂反应呈鲜绿色。
脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。
1.3粘度DNA溶液粘度极高 (因其分子直径小而长度大)RNA溶液粘度要小得多★核酸变性或降解后，粘度降低1.4两性解离概念：核酸为两性电解质，因核苷酸含有磷酸基与碱基，磷酸基和碱基可以解离，在不同pH条件下解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子，表现为两性离子状态，通常表现为酸性。
效果：由于磷酸基团的酸性很强，所以pI（等电点）较低，整个分子相当于多元酸。
应用：利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。
2. 紫外吸收性质2.1机理：嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。
2.2性质1：在260nm处有最大吸收峰。
对于纯的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其核酸含量。
A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
性质2：纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.02.3.定义：增色效应(hyperchromic effect)是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。
第5章核酸的化学 第四节 核酸的性质
食品生物化学
图5-15 RNA紫外吸收曲线
波长nm
食品生物化学
四、核酸的变性与复性
当核酸在某些理化因素（如有机溶剂、酸、碱、尿素、加 热及酰胺等）作用下，互补碱基对间的氢键断裂，双螺旋结构 松散，变成单链的过程称为变性(denaturation)。变性使核酸的 二级结构、三级结构改变，但核苷酸排列顺序不变。变性后的 核酸理化性质改变，生物学活性丧失。
核酸是相对分子质量很大的高分子化合物，高分子溶液比 普通溶液黏度要大得多，高分子形状的不对称性愈大，其黏度 也就愈大，不规则线团分子比球形分子的黏度大，线形分子的 黏度更大。由于DNA分子极为细长，因此即使是极稀的溶液也 有极大的黏度，RNA的黏度要小得多。
二、核酸的酸碱性质
核酸和蛋白质一样，也是两性电解质，在溶液中发生两性 电离。因磷酸基的酸性比碱基的碱性强，故其等电点偏于酸性。 利用核酸的两性解离能进行电泳，在中性或偏碱性溶液中，核 酸常带有负电荷，在外加电场力作用下，向阳极泳动。利用核 酸这一性质，可将相对分子质量不同的核酸分离。
DNA的变性是可逆的。变性DNA在适当条件下，变性的两 条互补链重新结合，恢复原来的双螺旋结构和性质，这个过程 称为复性(renaturation)。热变性的DNA经缓慢冷却（称退火处 理）即可复性。最适宜的复性温度比Tm值约低25℃，这个温度 又叫退火温度。
食品生物化学
图5-16 两种不同来源的DNA在260nm的吸收值与温度变化的关系
食品生物化学
DNA的解链过程发生于一个很窄的温度区内，DNA的变性 过程是爆发式的，有一个相变过程，把A260达到最高值的一半时 对应的温度称为该DNA的解链温度或融解温度，用Tm表示。 Tm值大小与DNA碱基组成有关，由于G-C之间的氢键联系要比 A-T之间的氢键联系强得多，故G＋C含量高的DNA其Tm值越高。 通过测定Tm值可知其G＋C碱基的含量。
核酸化学PPT课件
DNA与RNA结构特点
DNA结构特点
DNA是一种长链生物聚合物，组成单 位为四种脱氧核苷酸，由碱基、脱氧 核糖和磷酸构成。
RNA结构特点
RNA由核糖核苷酸经磷酸二酯键缩合而 成长链状分子。一个核糖核苷酸分子由 一分子磷酸、一分子核糖和一分子含氮 碱基构成。
碱基互补配对原则
碱基互补配对原则是指在DNA分子结构中，由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变，使得碱基配 对必须遵循一定的规律，这就是A（腺嘌呤）一定与T（胸腺嘧啶）配对，G（鸟嘌呤）一定与C（胞嘧啶）配对，反之亦然。
多肽。
基因编辑技术
如CRISPR-Cas9等，可对基因组 进行定点编辑，实现基因敲除、
敲入、突变等操作。
05
核酸药物设计与应用
抗病毒药物设 利用病毒基因序列中的特异性区域，设计与之互 补的核酸药物，通过阻断病毒基因复制或表达， 达到抗病毒效果。
靶向病毒关键蛋白的药物设计 针对病毒生命周期中的关键蛋白，设计能够与之 结合的核酸药物，从而阻止病毒的组装、释放等 过程。
RNA转录过程及调控
RNA转录的基本过程 转录起始、链延长、链终止与释放
RNA转录的酶学 RNA聚合酶、转录因子等
RNA转录的特点
模板链的选择性、转录的不对称性、 转录后加工等
RNA转录的调控
转录起始的调控、转录延伸的调控、 转录终止的调控
核酸酶作用及降解产物
核酸酶的种类与特性
01
核酸内切酶、核酸外切酶等
核酸的降解过程
02
核酸酶的切割作用、降解产物的生成与性质
核酸降解产物的应用
03
用于核酸序列分析、核酸检测等
03
核酸性质与功能
3 核酸性质
离心机示意图
2.2核酸的沉降特性
2.3沉降系数（沉降常数）
概念：指单位离心力场的沉降速度。对于一个特定的分子而 言是一个定值： 沉降速度 S= 沉降系数和 离心加速度 分子量之间 可以进行换 算（沈同、王
镜岩« 生物化学 » 200-204页），
在表示分子 大小时常用 沉降系数表 示。如：
3核酸的紫外吸收 3.1原理 嘌呤和嘧啶碱基含有共轭双键结构，因而核酸有紫外吸收 特性，最大吸收波长为260nm。 3.2分光光度计的原理 光源 待测物质溶液 检测系统
5.2 电泳 带电粒子在电 场中向与自身所 带电荷相反的电 极移动的现象. 移动速度与分 子的大小和形状 等因素有关.
负 极
1 2 3 4 5
正极 介质 缓冲溶液
样品
6核酸的提取
植物基因组DNA提取---CTAB法 1） 称取0.6-0.8克样品，加液氮，迅速研磨成细粉末，转入10毫 升离心管。 2） 向离心管中加入3毫升经65℃预热的提取缓冲液，混匀。 3） 65℃水浴30分钟，其间不时颠倒混匀样品。 4） 4℃，12000rpm离心20分钟，取上清液。 5） 上清液中加入等体积的氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀， 12000rpm离心15分钟，取上清液。 6） 上清液中加入2倍体积的-20℃的无水乙醇，轻轻混匀，室温静 置30分钟，可见DNA析出。 7） 用去尖枪头轻轻将白色絮状DNA挑出，放入1。5毫升离心管， 70%乙醇清洗沉淀2次。 8） 沉淀室温干燥，500μL 1×TE充分溶解，无色透明。4℃储存备 用 9） 质量和浓度检测
第三节 核酸的性
1一般物理性质 质 DNA为白色纤维状固体,RNA为白色粉末状固体,都微溶于 水,但钠盐在水中的溶解度较大。不熔于乙醇、乙醚和氯仿等 有机溶剂。两种核蛋白在盐溶液中溶解度不同。 A B C 2沉降特性 2.1离心技术 离心时，大于溶液密度的 组分如细胞碎片、大分子等 向离心管底部移动（沉降）。 由于各组分的分子大小、 形状等不同，造成沉降速度 不同，经过一段时间后不同 组分实现分离。
15 核酸的物理化学性质-王镜岩生物化学(全)
（3）低盐变性：<0.01mol/l时，由于 磷酸基的静电斥力，可以配对的碱 基无法相互靠近。 （4）变性剂：尿素 、甲醛 ，可以打 开氢键
2. 核酸变性的特点
• （1）一系列物化性质也随之发生改变 ： 紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密 度升高，酸碱滴定曲线改变等 • （2） 变性作用发生在一个很窄的温度 范围内 。 • 通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失去 一半时的温度称为该DNA的熔点或熔解温 度，用Tm表示。DNA的Tm值一般在82— 95℃之间
(3) 限制性内切酶
限制性核酸内切酶：存在于细菌体内的，专门降
解外源 DNA ，是一类能够识别双链 DNA 分子中的某种
特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内 切酶。 往往与一种甲基化酶同时成对地存在。识别相 同的碱基序列，当内切酶作用位点上的某一些碱基
被甲基化修饰后，限制酶就不能再降解这种DNA了。
1. 引起核酸变性的因素
（1）热变性：加热使氢键断裂，碱基分子内 能升高，碱基堆积力减小，使用最广泛。缺 点是高温可能引起酯键断裂，得到长短不一 的单链DNA；80～100℃ （2）酸碱变性：在pH<4.5或pH>11即可引起变 性。在制备单链DNA时优先采取pH=11.3的碱 变性，全部氢键都被淘汰。
（2）、有足够的温度以破坏无规则的
链内氢键，但又不能太高，否则配对碱 基之间的氢键又难以形成，一般用比Tm低
20--25℃的温度。
将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可能
复性。缓慢冷却时，可以复性---退火。
（3）、DNA的性质也影响复性
DNA的片段越大，复性越慢。
DNA的浓度越大，复性越快。
重复序列越多，复性越快。
核酸的理化性质
线
尿嘧啶核苷酸
pK1 = 1.0 第一磷酸基
pK3 = 6.4 第二磷酸基
烯醇式羟基
21
pH
由于核苷酸含磷酸与碱基，为两性电解质，它们在不 同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离 子。
在第一磷酸基和含N环解离曲线的交叉处，带负电荷的 磷酸基与带正电荷的含N环数目相等，此时pH即为核苷酸 的等电点：
完全水解 完全水解
嘧啶碱回收率高
6
二、碱水解
RNA的磷酸酯键对碱敏感、因此RNA易被碱水解， 产生核苷酸。 在室温，0.3～1mol/L KOH，24h，就可将RNA完全水 解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。
DNA无2′-OH，因此对碱有一定抗性：
生理意义： DNA更稳定 ，是遗传信息的载体。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
3.链球菌脱氧核糖核酸酶类
是一个内切酶，作用于DNA，产物为5’磷酸为末端的碎片，长度 不一，最适PH为7，需镁离子参与。
Dase只作用于DNA 12
4.限制性内切酶：
在细菌中发现有这类酶，主要降解外源DNA，第一个发现的限制 性内切酶是从大肠杆菌(E.coli.)中发现的(1968年)。
限制性内切酶的命名（以EcoR I 为例）：
7
三、酶水解
（一）核酸酶的分类
①按底物专一性分类：
RNase（核糖核酸酶） DNase（脱氧核糖核酸酶）
核酸内切酶 ②按对底物作用方式分类： 核酸外切酶
小球菌核酸酶：内、外切均可 ③按磷酸二酯键断裂方式分类：
3′-OH与磷酸基之间断裂 如 蛇毒磷酸二酯酶
5′-OH与磷酸基之间断裂 如 牛脾磷酸二酯酶
磷酸基（含两个羟基）的解离
生物化学—核酸的性质
第五节 核酸的性质
一、核酸的水解
（一）酸水解
对酸敏感性： 糖苷键 磷酸酯键 嘌呤碱糖苷键 嘧啶碱糖苷键
（二）碱水解
DNA一般对碱稳定。
RNA 的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸混 合物。
（三）酶水解
（1）底物专一性 ribonuclease， RNase deoxyribonuclease，DNase
应用：
是否存在同源基因;
基因拷贝数多少;
基因片段大小…
Northern blot 是一种将变性RNA转移到滤膜上，利用分子杂 交原理研究基因表达规律的分析技术.
Western blot 将蛋白质转移到滤膜上,根据抗原与抗体可以结 合的原理进行的蛋白质分析鉴定方法.
（二）核酸变性的因素 1. 过酸、过碱 2. 变性剂 (尿素，甲醛) 3. 热变性
特点：爆发式
Tm（melting temperature）
称为核酸解链温度(或融解温度)。即加热变性 使DNA双螺旋结构丧失一半含量
C-G%=(Tm-69.3) X 2.44
2. DNA的均一性 3. 介质中的离子强 度
（三）核酸复性（renaturation）
变性DNA在适当条件下，可使两条彼此分开 的链重新结合成为双螺旋结构，使其物理、化 学性质及生物活性得到恢复，这一过程称为复 性。
DNA复性后紫外吸收降低称为减色效应 （hypochromic effect）。
=40 g/ml RNA 测纯度：OD260/OD280
DNA(1.8), RNA(2.0)
四、核酸的变性、复性 （一）核酸变性定义
天然核酸在某些物理或化学因素作用下， 双螺旋区的氢键断裂, 变成单链。其紫外吸收 增高，黏度下降，生物活性全部或部分丧失。 这种现象称为核酸的变性。
一、核酸的水解
（一）酸水解
对酸敏感性： 糖苷键 磷酸酯键 嘌呤碱糖苷键 嘧啶碱糖苷键
（二）碱水解
DNA一般对碱稳定。
RNA 的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸混 合物。
（三）酶水解
（1）底物专一性 ribonuclease， RNase deoxyribonuclease，DNase
应用：
是否存在同源基因;
基因拷贝数多少;
基因片段大小…
Northern blot 是一种将变性RNA转移到滤膜上，利用分子杂 交原理研究基因表达规律的分析技术.
Western blot 将蛋白质转移到滤膜上,根据抗原与抗体可以结 合的原理进行的蛋白质分析鉴定方法.
（二）核酸变性的因素 1. 过酸、过碱 2. 变性剂 (尿素，甲醛) 3. 热变性
特点：爆发式
Tm（melting temperature）
称为核酸解链温度(或融解温度)。即加热变性 使DNA双螺旋结构丧失一半含量
C-G%=(Tm-69.3) X 2.44
2. DNA的均一性 3. 介质中的离子强 度
（三）核酸复性（renaturation）
变性DNA在适当条件下，可使两条彼此分开 的链重新结合成为双螺旋结构，使其物理、化 学性质及生物活性得到恢复，这一过程称为复 性。
DNA复性后紫外吸收降低称为减色效应 （hypochromic effect）。
=40 g/ml RNA 测纯度：OD260/OD280
DNA(1.8), RNA(2.0)
四、核酸的变性、复性 （一）核酸变性定义
天然核酸在某些物理或化学因素作用下， 双螺旋区的氢键断裂, 变成单链。其紫外吸收 增高，黏度下降，生物活性全部或部分丧失。 这种现象称为核酸的变性。
核酸的理化性质PPT
由于磷酸基团的酸性很强，所以pI较低 ，整个分子相当于多元酸。
利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶
液的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸
。
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5
三. 紫外吸收性质
嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸 收紫外光。在260nm处有最大吸收峰。对于纯 的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其核 酸含量。
核酸的理化性质
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1
一.一般的物理性质
1. 形 态
➢ DNA —— 白色纤维状固体 ➢ RNA —— 白色粉末状固体
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2
一.一般的物理性质
2. 溶 解性
➢ 微溶于水
➢ 不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂
➢ RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L的NaCl溶液
这是由于变性的DNA双螺旋解体，藏于螺旋内 部的碱基暴露出来。
增色效应常可用来衡量 DNA变性的程度。
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4. 热变性曲线(熔解曲线)
(一) 变 性
在DNA发生热变性的过程中，A260随温度的变化曲线。
变性百分率 A260
不 同 DNA 的 熔 解
100
曲线不同，但很
类似。都是 —
A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.0
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(一) 变 性
1. 变性的概念
四.变性与复性
核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空 间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生 物活性的降低或丧失。
A260值升高 粘度下降
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24
DNA变性
25
5、DNA热变性的特征
变性过程是“跃变式”的，而非渐 变
➢解链曲线：连续加热DNA，以温度对
A260作图，所得的曲线称为解链曲线。
26
➢ Tm：DNA变性时，OD260达 到最大值的50%时的温度称 为DNA的解链温度或融解温 度(Tm)。
➢大小与G+C含量成正比。
• 指增色效应达50%时的温度
5
核酸的酶水解
水解核酸的酶种类很多。非特异性水 解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒 磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解 核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有 非特异水解糖苷键的糖苷酶。
6
核酸酶的分类Ⅰ
➢按底物专一性分类：作用于RNA的称为RNA酶 （ ribonuclease ，RNase） ； 作 用 于 DNA 的 称 为 DNA酶（deoxyribonuclease，DNase）。
ON H
H
ON H
O
NH
ON H
O
CH3
pK1' 9.9N-
CH3
H
ON H 10
N H 2
N H 2
N H 2
H N +
N pK 1 ' 4.15N
N pK2 ' 9.8 N
N
H
N
N H
O
H N
+
HN
H2N
N
NH
N
N H H
O
p
K
' 1
3.2
HN
H
H2N
N
N
N -
N
p
K
' 2
9.6
H
NH
鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(annealing) 。
30
DNA复性
31
32
• 分子量越大复性越难； • 浓度越大，复性越容易； • DNA复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列DNA，复性快）。
4
核酸的碱水解
RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA 的核糖上有2’－OH，在碱作用下形成磷酸三酯。 磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2’，3’ －环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2’－核苷 酸和3’－核苷酸。
DNA一般对碱稳定，若在1mol/L NaOH中加 热至100℃ 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷 酸。
第15章 核酸物理化学性质
1
一、核酸的水解
核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键， 其中糖苷键更易被水解。
2
5′端 3′端
C A G
3
核酸的酸水解
嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳 定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷 键。DNA在pH1.6于37℃对水透析可完全除去嘌呤 碱；在pH2.8于100℃加热1h，也可完全除去嘌呤碱。
O
O
N-
H N
+
p
K
' 3
12.4
N-
N
H2N
N
H
NH
H2N
N
N-
11
2、核苷的解离
•戊糖可增强碱基的酸性解离 •核糖中的羟基也可发生解离
3.核苷酸的解离
•磷酸基使核苷酸具有很强的酸性
12
O p K 1 ' 0 .7 1 .6
ROP OH
R
O
- p K 2 ' 5 .9 6 .5
OP O
➢按 对 底 物 作 用 的 方 式 可 分 为 核 酸 内 切 酶 （ endonuclease ） 和 核 酸 外 切 酶 （ exonuclease ） 。 少数核酸酶既可内切又可外切。
7
核酸酶的分类Ⅱ
核酸外切酶有5’→3’方向切割的，也有3’→5’方向 切割的，分别称为5’→3’外切酶和3’→5’外切酶。 还有对特定核苷酸序列部位进行切割的。如:限制 性核酸内切酶
2.判断核酸样品的纯度
– DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 – RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 – 含杂蛋白及苯酚，降低
3.判断DNA是否变性
17
四、核酸的变性、复性与杂交
(一) 核酸的变性（denaturation） 1、DNA的变性：
在某些理化因素作用下，DNA双链解 开成两条单链的过程。
R
O OP O -
H
OH
H
OH
O -
CH 2 O
N
-
OH
O
O P OH
O
CH 2 O
N
pK
' 1
1 .5
H
CH 2 O
N
-
OH
O
O P O-
O
CH 2 O
N
OH
OH
13
• DNA等电点为4～4.5； • RNA等电点为2～2.5
14
三、核酸的紫外吸收
• 碱基含有共轭双键
• 最大吸收峰260nm左右
8
二、核酸的酸碱性质
1、碱基的解离
具有芳香环结构特点 • 能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变 • 嘌呤和嘧啶碱基ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ具有弱碱性
______主要是环内氨基的贡献
9
胞嘧啶中
NH2 HN+
ON H
NH2
NH2
pK1' 4.6 N H
ON H
pK2' 12.5N
H
O- N H
尿嘧啶及胸腺嘧啶中
O
O
NH pK1' 9.5N-
21
4、变性后理化性质变化
OD260增高 比旋度下降
粘度下降 浮力密度升高
酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失
RNA变性：从螺旋到线团之间的转变
RNA的变性引起的性质变化没有DNA明显
22
23
完全变性后核酸紫外吸收值增加： • 天然DNA 25－40%、RNA 约1.1% • 实质：碱基暴露
由于变性或降解引起紫外吸收增加的现 象称增色效应
• 一般DNA Tm 值在85 - 90 C之间
27
28
Tm值大小与下列因素有关：
（1）DNA的均一性： （2）G－C含量：
经验公式： XG+C＝（Tm－69.3）×2.44
（3）介质中的离子强度：
29
(二)核酸的复性（renaturation）
• 变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的 单链重新缔合成双链——复性。
15
核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔 磷即相当于摩尔核苷酸。
（P）＝30.98A
WL
ε：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径
16
• OD260的应用： 1. DNA或RNA的定量
– OD260=1.0相当于 • 50μg/ml双链DNA • 40μg/ml单链DNA（或RNA） • 20μg/ml寡核苷酸
18
2、变性的实质
某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变
19
DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 降解：核苷酸骨架上3’，5 ’-磷酸二酯键的断裂
20
3、变性因素
高温（一般＞75℃）— 热变性 强酸、碱 — 酸碱变性 甲醛（Agarose中RNA ） 尿素（PAGE中DNA ）
DNA变性
25
5、DNA热变性的特征
变性过程是“跃变式”的，而非渐 变
➢解链曲线：连续加热DNA，以温度对
A260作图，所得的曲线称为解链曲线。
26
➢ Tm：DNA变性时，OD260达 到最大值的50%时的温度称 为DNA的解链温度或融解温 度(Tm)。
➢大小与G+C含量成正比。
• 指增色效应达50%时的温度
5
核酸的酶水解
水解核酸的酶种类很多。非特异性水 解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒 磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解 核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有 非特异水解糖苷键的糖苷酶。
6
核酸酶的分类Ⅰ
➢按底物专一性分类：作用于RNA的称为RNA酶 （ ribonuclease ，RNase） ； 作 用 于 DNA 的 称 为 DNA酶（deoxyribonuclease，DNase）。
ON H
H
ON H
O
NH
ON H
O
CH3
pK1' 9.9N-
CH3
H
ON H 10
N H 2
N H 2
N H 2
H N +
N pK 1 ' 4.15N
N pK2 ' 9.8 N
N
H
N
N H
O
H N
+
HN
H2N
N
NH
N
N H H
O
p
K
' 1
3.2
HN
H
H2N
N
N
N -
N
p
K
' 2
9.6
H
NH
鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上
热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性， 这一过程称为退火(annealing) 。
30
DNA复性
31
32
• 分子量越大复性越难； • 浓度越大，复性越容易； • DNA复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列DNA，复性快）。
4
核酸的碱水解
RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA 的核糖上有2’－OH，在碱作用下形成磷酸三酯。 磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2’，3’ －环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2’－核苷 酸和3’－核苷酸。
DNA一般对碱稳定，若在1mol/L NaOH中加 热至100℃ 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷 酸。
第15章 核酸物理化学性质
1
一、核酸的水解
核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键， 其中糖苷键更易被水解。
2
5′端 3′端
C A G
3
核酸的酸水解
嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳 定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷 键。DNA在pH1.6于37℃对水透析可完全除去嘌呤 碱；在pH2.8于100℃加热1h，也可完全除去嘌呤碱。
O
O
N-
H N
+
p
K
' 3
12.4
N-
N
H2N
N
H
NH
H2N
N
N-
11
2、核苷的解离
•戊糖可增强碱基的酸性解离 •核糖中的羟基也可发生解离
3.核苷酸的解离
•磷酸基使核苷酸具有很强的酸性
12
O p K 1 ' 0 .7 1 .6
ROP OH
R
O
- p K 2 ' 5 .9 6 .5
OP O
➢按 对 底 物 作 用 的 方 式 可 分 为 核 酸 内 切 酶 （ endonuclease ） 和 核 酸 外 切 酶 （ exonuclease ） 。 少数核酸酶既可内切又可外切。
7
核酸酶的分类Ⅱ
核酸外切酶有5’→3’方向切割的，也有3’→5’方向 切割的，分别称为5’→3’外切酶和3’→5’外切酶。 还有对特定核苷酸序列部位进行切割的。如:限制 性核酸内切酶
2.判断核酸样品的纯度
– DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 – RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 – 含杂蛋白及苯酚，降低
3.判断DNA是否变性
17
四、核酸的变性、复性与杂交
(一) 核酸的变性（denaturation） 1、DNA的变性：
在某些理化因素作用下，DNA双链解 开成两条单链的过程。
R
O OP O -
H
OH
H
OH
O -
CH 2 O
N
-
OH
O
O P OH
O
CH 2 O
N
pK
' 1
1 .5
H
CH 2 O
N
-
OH
O
O P O-
O
CH 2 O
N
OH
OH
13
• DNA等电点为4～4.5； • RNA等电点为2～2.5
14
三、核酸的紫外吸收
• 碱基含有共轭双键
• 最大吸收峰260nm左右
8
二、核酸的酸碱性质
1、碱基的解离
具有芳香环结构特点 • 能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变 • 嘌呤和嘧啶碱基ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ具有弱碱性
______主要是环内氨基的贡献
9
胞嘧啶中
NH2 HN+
ON H
NH2
NH2
pK1' 4.6 N H
ON H
pK2' 12.5N
H
O- N H
尿嘧啶及胸腺嘧啶中
O
O
NH pK1' 9.5N-
21
4、变性后理化性质变化
OD260增高 比旋度下降
粘度下降 浮力密度升高
酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失
RNA变性：从螺旋到线团之间的转变
RNA的变性引起的性质变化没有DNA明显
22
23
完全变性后核酸紫外吸收值增加： • 天然DNA 25－40%、RNA 约1.1% • 实质：碱基暴露
由于变性或降解引起紫外吸收增加的现 象称增色效应
• 一般DNA Tm 值在85 - 90 C之间
27
28
Tm值大小与下列因素有关：
（1）DNA的均一性： （2）G－C含量：
经验公式： XG+C＝（Tm－69.3）×2.44
（3）介质中的离子强度：
29
(二)核酸的复性（renaturation）
• 变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的 单链重新缔合成双链——复性。
15
核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度表示，摩尔 磷即相当于摩尔核苷酸。
（P）＝30.98A
WL
ε：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径
16
• OD260的应用： 1. DNA或RNA的定量
– OD260=1.0相当于 • 50μg/ml双链DNA • 40μg/ml单链DNA（或RNA） • 20μg/ml寡核苷酸
18
2、变性的实质
某些理化因素破坏了氢键和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变
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DNA变性的本质是双链间氢键的断裂 降解：核苷酸骨架上3’，5 ’-磷酸二酯键的断裂
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3、变性因素
高温（一般＞75℃）— 热变性 强酸、碱 — 酸碱变性 甲醛（Agarose中RNA ） 尿素（PAGE中DNA ）