核酸的物理化学性质
核酸理化性质讲义
核算理化性质-讲义目录1.一般物理性质；2.核酸的紫外吸收；3.变性；4.复性；5.杂交；教学目的：了解核酸的一般物理性质及DNA序列的测定方法，掌握核酸的紫外吸收特性、变性和复性及核酸的分离、提纯和定量测定。
教学重点：核酸的紫外吸收及变性和复性；教学难点：核酸的变性和复性1.一般物理性质1.1形态DNA —— 白色纤维状固体 RNA —— 白色粉末状固体1.2溶解性微溶于水；不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；用乙醇可以沉淀核酸。
RNA核蛋白体(RNP)易溶于0.14mol/L NaCl溶液；DNP可溶于1~2mol/L的NaCl溶液；RNA在碱性溶液中不稳定； DNA在碱性溶液中稳定。
显色反应：利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。
核糖与地衣酚（3,5-二羟甲苯）试剂反应呈鲜绿色。
脱氧核糖与二苯胺试剂反应生成蓝色化合物，而核糖无此反应。
1.3粘度DNA溶液粘度极高 (因其分子直径小而长度大)RNA溶液粘度要小得多★核酸变性或降解后，粘度降低1.4两性解离概念：核酸为两性电解质，因核苷酸含有磷酸基与碱基，磷酸基和碱基可以解离，在不同pH条件下解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离子，表现为两性离子状态，通常表现为酸性。
效果：由于磷酸基团的酸性很强，所以pI（等电点）较低，整个分子相当于多元酸。
应用：利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的pH来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。
2. 紫外吸收性质2.1机理：嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。
2.2性质1：在260nm处有最大吸收峰。
对于纯的DNA或RNA，可以通过测得A260来推测其核酸含量。
A260/ A280值可以反映核酸的纯度。
性质2：纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.02.3.定义：增色效应(hyperchromic effect)是变性后DNA 溶液的紫外吸收作用增强的效应。
第5章核酸的化学 第四节 核酸的性质
食品生物化学
图5-15 RNA紫外吸收曲线
波长nm
食品生物化学
四、核酸的变性与复性
当核酸在某些理化因素（如有机溶剂、酸、碱、尿素、加 热及酰胺等）作用下，互补碱基对间的氢键断裂，双螺旋结构 松散，变成单链的过程称为变性(denaturation)。变性使核酸的 二级结构、三级结构改变，但核苷酸排列顺序不变。变性后的 核酸理化性质改变，生物学活性丧失。
核酸是相对分子质量很大的高分子化合物，高分子溶液比 普通溶液黏度要大得多，高分子形状的不对称性愈大，其黏度 也就愈大，不规则线团分子比球形分子的黏度大，线形分子的 黏度更大。由于DNA分子极为细长，因此即使是极稀的溶液也 有极大的黏度，RNA的黏度要小得多。
二、核酸的酸碱性质
核酸和蛋白质一样，也是两性电解质，在溶液中发生两性 电离。因磷酸基的酸性比碱基的碱性强，故其等电点偏于酸性。 利用核酸的两性解离能进行电泳，在中性或偏碱性溶液中，核 酸常带有负电荷，在外加电场力作用下，向阳极泳动。利用核 酸这一性质，可将相对分子质量不同的核酸分离。
DNA的变性是可逆的。变性DNA在适当条件下，变性的两 条互补链重新结合，恢复原来的双螺旋结构和性质，这个过程 称为复性(renaturation)。热变性的DNA经缓慢冷却（称退火处 理）即可复性。最适宜的复性温度比Tm值约低25℃，这个温度 又叫退火温度。
食品生物化学
图5-16 两种不同来源的DNA在260nm的吸收值与温度变化的关系
食品生物化学
DNA的解链过程发生于一个很窄的温度区内，DNA的变性 过程是爆发式的，有一个相变过程，把A260达到最高值的一半时 对应的温度称为该DNA的解链温度或融解温度，用Tm表示。 Tm值大小与DNA碱基组成有关，由于G-C之间的氢键联系要比 A-T之间的氢键联系强得多，故G＋C含量高的DNA其Tm值越高。 通过测定Tm值可知其G＋C碱基的含量。
核酸的理化性质
线
尿嘧啶核苷酸
pK1 = 1.0 第一磷酸基
pK3 = 6.4 第二磷酸基
烯醇式羟基
21
pH
由于核苷酸含磷酸与碱基，为两性电解质，它们在不 同pH的溶液中解离程度不同，在一定条件下可形成兼性离 子。
在第一磷酸基和含N环解离曲线的交叉处，带负电荷的 磷酸基与带正电荷的含N环数目相等，此时pH即为核苷酸 的等电点：
完全水解 完全水解
嘧啶碱回收率高
6
二、碱水解
RNA的磷酸酯键对碱敏感、因此RNA易被碱水解， 产生核苷酸。 在室温，0.3～1mol/L KOH，24h，就可将RNA完全水 解，得到2′-或3′-核苷酸的混合物。
DNA无2′-OH，因此对碱有一定抗性：
生理意义： DNA更稳定 ，是遗传信息的载体。 RNA是DNA的信使，完成任务后迅速降解。
3.链球菌脱氧核糖核酸酶类
是一个内切酶，作用于DNA，产物为5’磷酸为末端的碎片，长度 不一，最适PH为7，需镁离子参与。
Dase只作用于DNA 12
4.限制性内切酶：
在细菌中发现有这类酶，主要降解外源DNA，第一个发现的限制 性内切酶是从大肠杆菌(E.coli.)中发现的(1968年)。
限制性内切酶的命名（以EcoR I 为例）：
7
三、酶水解
（一）核酸酶的分类
①按底物专一性分类：
RNase（核糖核酸酶） DNase（脱氧核糖核酸酶）
核酸内切酶 ②按对底物作用方式分类： 核酸外切酶
小球菌核酸酶：内、外切均可 ③按磷酸二酯键断裂方式分类：
3′-OH与磷酸基之间断裂 如 蛇毒磷酸二酯酶
5′-OH与磷酸基之间断裂 如 牛脾磷酸二酯酶
磷酸基（含两个羟基）的解离
核酸的理化性质
限制性内切酶
原核生物(及病毒)中存在着一类能识别外源DNA双螺旋中 4-8个碱基对所组成的特异的具有二重旋转对称性的回文序列， 并在此序列的某位点水解DNA双螺旋链，产生粘性末端或平末 端，这类酶称为限制性内切酶（ristriction endonuclease）。 山东落花生花落东山 帘卷晚晴天，天晴晚卷帘 Was it a cat I saw?
二、核酸的酸碱性质
1、碱基的解离
2、核苷的解离
3、核苷酸的解离
结合及释放 质子的能力
第 1、碱基的解离 14 章 碱基：含氮碱基，杂环化合物（很多生物碱的结构） 核 1）、具有芳香环的结构特征，呈平面或近乎平面 酸 含有共轭双键体系，紫外区有吸收（260nm）。 的 物 2）、氮原子位于环上或取代氨基上 弱碱性来自于环上氮原子，pKa约9.5，倾向于接受H 理 取代氨基（或曰碱基环外的氨基）碱性很弱，生理 化 条件下不能被质子化。 学 性 质
核酸的物理化学性质
一、核酸的水解 二、核酸的酸碱性质 三、核酸的紫外吸收性质 四、核酸的变性、复性及杂交
一、核酸的水解
（一）酸水解 糖苷键比磷酸二酯键 更易被酸水解 嘌呤碱基的糖苷键比 嘧啶碱基的糖苷键对 酸更不稳定
NH 2
酯键
O
N N O
N 9 N
5' HO P O CH2 O
-
糖苷
1' H H 2' OH
H
H OH
腺苷酸
（二）碱水解 RNA的磷酸酯键易被碱 水解，产生核苷酸。 由于RNA的核糖上有2’OH基，在碱作用下形成 磷酸三酯。 磷酸三酯极不稳定，随 即水解产生，产生 2’,3’-环磷酸酯，再水 解成2’-核苷酸及3’-核 苷酸
15-核酸的理化性质和研究方法
1Biochemistry. LuJie陆婕Lujie.jane@华中科技大学生命科学与技术学院生物物理与生物化学研究所生物化学BiochemistryBiochemistry. LuJieChapter 15Nucleic Acids:Properties and Techniques核酸的理化性质和研究方法2Biochemistry. LuJie核酸的化学结构和作为高聚物决定其理化性质：核酸的糖苷键和磷酸二酯键：可被水解；磷酸基和碱基：酸碱性质；碱基：紫外吸收特性；双螺旋结构：变性和复性。
3Biochemistry. LuJie核酸的性质溶解度：溶于水酸碱性：生理pH带负电荷分子量和形状：DNA 108~1012，d/l=10-7，“柔性棒”——高黏度不对称性——正旋光性紫外吸收——260nm有最大光吸收核酸的离心沉降DNA 的变性与复性4Biochemistry. LuJie一、核酸的水解二、核酸的酸碱性质三、核酸的紫外吸收四、核酸的变性、复性及杂交五、核酸的分离和纯化六、核酸序列的测定七、核酸的化学合成八、DNA微阵技术5Biochemistry. LuJie（一）酸水解糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解，产生嘌呤和嘧啶碱（二）碱水解: RNA→2’-核苷酸，3’-核苷酸RNA的磷酸酯键更易被碱水解（RNA的核糖上有2’-OH，在碱作用下形成磷酸三酯，极不稳定易水解，产生核苷2’，3’-环磷酸酯，继续水解产生2’-核苷酸和3’-核苷酸）（三）酶水解（消化）专一水解核酸的磷酸二酯键的酶称为核酸酶(nuclease)。
能识别特定的核苷酸顺序，并从特定位点水解核酸的内切酶称为限制性核酸内切酶（限制酶）。
67Biochemistry. LuJie限制性DNA 内切酶: 专一性的核酸内切酶，能识别双链DNA 分子的特定序列，并可在该位置或其附近同时切断双链DNA 。
Biochemistry. LuJie核酸外切酶（endonuclease）：从多核苷酸链的末端开始,逐个将核苷酸切下的酶，如：♦3’→5’外切酶(蛇毒磷酸二酯酶)：在3’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是5’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（1）；♦5’→3’外切酶(牛脾磷酸二酯酶)：在5’-OH与磷酸基之间断裂，其产物是3’-磷酸核苷酸或寡核苷酸,如（2）。
核酸的物理化学性质
第15章、核酸的物理化学性质（上册P502）本章重点：1、核酸的水解，2、核酸的紫外吸收，3、核酸的变性和复性本章的主要内容：（一）核酸的水解：所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。
（1）酸水解：糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。
（2）碱水解：磷酸酯键易水解，RNA比DNA易水解，因为RNA核糖上有2‘-OH，水解过程见P502。
（3）酶水解：为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。
1.核酸酶的分类：按底物专一性分为RNase（核糖核酸酶）和DNase（脱氧核糖核酸酶）。
按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用点在末端）。
2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py）-3‘-磷酸与其他核苷酸之间的连键。
3.限制性内切酶：为DNase。
剪裁DNA的工具，可用于核酸测序和基因工程。
在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。
限制性内切酶往往与甲基化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可识别和降解外源DNA。
断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定位点两条链切断后形成粘末端或平末端。
限制性内切酶命名：如E. coR Ⅰ，第1个字母E(大写)，为大肠杆菌(E.coli)属名的第一个字母，第2、3两个字母co（小写）为种名头两个字母，第4个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。
（二）核酸的酸碱性质：核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。
由于DNA酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。
（三）核酸的紫外吸收：嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在260nm附近（蛋白质最大吸收值280nm）。
（1）可用于测样品纯度（测吸光度A）：A260/A280比值，纯DNA应大于1.8，纯RNA应达到2.0，若样品混有杂蛋白，比值明显降低。
第15章-核酸的物理化学性质和研究方法
4.密度梯度超速离心纯化RNA或不同构象的 DNA
超螺旋DNA或
（五） 核酸的凝胶电泳 p254
核酸研究中最常用的方法 优点：简单、快速、灵敏、成本低。
通过凝胶电泳 （1）可进行核酸分离，知道核酸的纯度。 （2）测定分子大小。 （3）估计核酸的构象。
1．琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）
总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛） 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。
（3）Western blotting
将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝 酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标 记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种 技术叫做Western蛋白质杂交技术。
原理：抗原和抗体结合
测定核酸的ε(P)可判断DNA制剂是否发生变性或降解。
一般天然DNA的ε(P)为6 600，RNA为7 700—7 800。 单链多核苷酸的ε(P)值比双螺旋结构多核苷酸的 ε(P)值要高。
核酸发生变性时，ε(P)值升高，此现象称为增色 效应。（这是因为双螺旋结构使碱基对的π电子云 发生重叠，因而减少了对紫外光的吸收）
2.密度梯度超速离心测定DNA的G-C含量
G-C含量与DNA的浮力密度之间呈正比关系
ρ=0.1 xG-C + 1.658 xG-C = （ ρ-1.658）× 10
但是5-甲基胞嘧啶多的DNA，其实际浮力密度会降低， 低于理论值。
3.密度梯度超速离心研究核酸的构象
RNA＞DNA 变性DNA＞双链DNA ＞蛋白质， 变性程度越大，浮力密度越大
碱 基
（一）核酸的酸水解
水解特点：
戊
糖
1.糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解
核酸的性质
DNA的核苷酸序列测定
DNA的测序策略
DNA片断的序列测定
英国Sanger ， 1975年加减法，1977年末端 终止法，目前广泛用于DNA的自动测序 美国Maxam和Gilbert ， 1977年化学断裂法 基本原理：把DNA变成在不同碱基的核苷酸处 打断的四套末端标记的DNA片断，当相应于四 个不同碱基产生的四套DNA片断并排进行电泳 分离时，产生一个可以直接读出DNA顺序的区 带。
模板DNA的变性：双链DNA解离，使之成为单链，以便 它与引物结合 模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性 成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的 互补序列配对结合（退火温度与Tm有关，温度太低非特 异扩增增加，温度过高引物和模板不易结合） 引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链 重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半 保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板
真核生物mRNA的分离：亲和层析
真核生物的mRNA有polyA的尾巴，能被oligo-dT柱 子吸附而和其他物质分离开来
真核生物ｍＲＮＡ的分离
核酸纯度鉴定与含量测定
根据A260/A280的比值判断核酸样品的纯度 （若样品中含有杂蛋白或苯酚，则 A260/A280比值明显降低）
纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0
核酸的物理化学性质
核酸的水解 核酸的磷酸二酯键和糖苷键可 以被水解
室温条件下，DNA在碱中变性， 但不水解，RNA水解，水解产物为 2’-和3’-核苷酸的混合物。
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7-3 核酸的物理化学性质上册P502
（一）核酸的水解：
所有糖苷键和磷酸酯键都能被水解。
（1）酸水解：
糖苷键比磷酸二酯键易被水解，嘌呤碱糖苷键比嘧啶碱更易水解。
（2）碱水解：
磷酸酯键易水解，RNA比DNA易水解，因为RNA核糖上有2‘-OH，水解过
程见P502。
（3）酶水解：
为水解磷酸二酯键的酶，专一水解核酸的为核酸酶。
1.核酸酶的分类：
按底物专一性分为RNase（核糖核酸酶）和DNase（脱氧核糖核酸酶）。
按对底物作用方式分为内切酶（作用点在核糖核酸酶内部）和外切酶（作用
点在末端）。
2.RNase：如牛胰核糖核酸酶（EC 2.7.7.16），内切酶，作用位点为嘧啶核苷（Py）
-3‘-磷酸与其他核苷酸之间的连键。
3.限制性内切酶：为DNase。
剪裁DNA的工具，可用于核酸测序和基因工程。
在细菌中发现，目前已找到限制性内切酶数千种。
限制性内切酶往往与甲基
化酶成对存在，自身酶作用位点的碱基被甲基化，内切酶不再降解，因而可
识别和降解外源DNA。
断裂位点处常有二重旋转（轴）对称性（回文结构，正读反读相同），在特定
位点两条链切断后形成粘末端或平末端。
限制性内切酶命名：如E. coR Ⅰ，第1个字母E(大写)，为大肠杆菌(E.coli)
属名的第一个字母，第2、3两个字母co（小写）为种名头两个字母，第4
个字母R，表示菌株，最后一个罗马字为该细菌中已分离这一类酶的编号。
（二）核酸的酸碱性质：
核苷和核苷酸都是兼性离子，碱基和磷酸基均能解离，见P505，具有酸碱性。
由于DNA酸碱变性，使酸碱滴定曲线不可逆。
（三）核酸的紫外吸收：
嘌呤环与嘧啶环具有共轭双键，核苷和核酸的吸收波段在240~290nm，最大吸收值在260nm附近（蛋白质最大吸收值280nm）。
（1）可用于测样品纯度（测吸光度A）：
A260/A280比值，纯DNA应大于1.8，纯RNA应达到2.0，若样品混有杂蛋白，比值明显降低。
对于纯样品，从260nm的A值即可算出含量。
A值为1，相当于50μg/mL DNA双螺旋，或40μg/mL单链DNA（或RNA），或20μg/mL寡核苷酸。
（2）核酸的摩尔磷吸光系数ε（P）：为含有1克原子磷（30.98g）的核酸在260nm 处的吸光系数。
ε（P）= A / CL. = 30.98 A / W L
A：吸收值，C：每升溶液的磷摩尔数，C=W/30.98，L：比色杯内径。
一般天然DNA ε（P）为6600，RNA为7700~7800
由于双螺旋结构使碱基对的π电子云发生重叠，使紫外吸收比单链减少，由此可判断DNA是否变性。
DNA变性时ε（P）值升高，增色效应。
DNA复性时ε（P）值降低，减色效应。
核酸比所含核苷酸单体的ε（P）低40~45%。
（四）核酸的变性、复性及杂交：
（1）变性：核酸双螺旋区的氢键断裂变成单链，不涉及共价键的断裂。
降解：多核苷酸骨架上共价键（3‘，5‘-磷酸二酯键）断裂，分子量降低。
引起变性因素：热变性，酸碱变性，变性剂（如尿素，甲醛等）变性（竞争形
成氢键）。
DNA变性温度：又称熔点或熔解温度，为DNA双螺旋结构失去一半时的温度，用T m表示，DNA的T m一般为82~950C。
DNA变性是爆发式的，变性
在一个很窄温度范围内发生。
P508 图14-4为DNA变性过程。
影响T m的因素：
1. DNA的均一性：均一则T m窄，如poly (A-T)，poly d(G-C)等，T m窄。
2. G-C含量：T m值与G-C含量成正比，G-C含量越高，T m值越高，因为
G-C间三个氢键。
G-C含量与T m关系的经验公式：
G-C% = (T m - 69.3) ×2.44
可由G-C含量计算T m或由T m计算G-C含量。
3. 介质离子强度：
离子强度较高时，DNA的T m值较高，DNA较稳定，因此DNA的保存在含盐（如1mol NaCl）缓冲溶液中。
RNA的变性：RNA分子中有局部双螺旋区，所以也可发生变性，只是T m值较低，且范围较宽
双链RNA变性几乎与DNA同。
（2）复性：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构的过程称为复性。
变性DNA在缓慢冷却时，可以复性的过程称为退火。
加热变性的DNA为防止复性，需骤冷处理。
DNA复性，浓度越大复性越快，且具有多重复序列的复性快。
（3）核酸的杂交：不同来源的DNA热变性后慢慢冷却，若异源DNA之间某些区域有相同序列，则复性时会形成杂交DNA分子。
DNA与互补的RNA之间也可发生杂交。
核酸杂交应用广泛，可用来检测特殊核苷酸序列的一个或更多的DNA片断，将少量基因钓出，是基因芯片，基因探针的工作根据。