基因克隆、假病毒操作步骤
基因克隆(包括DNA提取技术步骤)
基因克隆DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。
一 DNA的提取二目的DNA片段的获得（酶切）三体外重组1 LB培养基的配制2大肠杆菌感受态细胞的制备3载体的选择四导入受体细胞五重组子的筛选1插入失活法实验一DNA提取取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：1 准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。
（常温操作）2 恒温箱裂解，55℃。
30min。
3 加等体积Tris饱和酚(酚：氯仿：异戊醇25：24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
（注意酚在油层下面）4 取上清（把枪头去掉部分，注意液面。
蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中），加入等体积CI(氯仿：异戊醇24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
5 汇集上清，加2倍无水乙醇(-30度保存)，颠倒混匀可观察到絮状DNA。
在-30度冰箱沉淀30min。
离心4度12000g 10分钟。
6 弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。
7 重复一次上述操作。
7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。
8 溶解于200ulddwater。
9 定量DNA。
裂解液的配制1ml体系200ul 0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。
作用抑制酶的活性。
）螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。
50ul 10%SDS（蛋白质变性剂）10ul 1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液5ul PK（消化）735ul 灭菌超纯水EDTA（0.5 M，pH8.0）将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
基因克隆的基本原理和流程 cdna
基因克隆的基本原理和流程 cdna下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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克隆基因流程带举例
克隆基因流程带举例下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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1. 选择目标基因。
确定要克隆的特定基因序列。
2. 设计引物。
大肠杆菌基因克隆的基本步骤
大肠杆菌基因克隆的基本步骤嘿，咱今儿个就来聊聊大肠杆菌基因克隆那些事儿！你可别小瞧这大肠杆菌，它在生物领域那可是有着相当重要的地位呢！要进行大肠杆菌基因克隆，第一步，得先找到咱要克隆的那个基因吧。
这就好比你要去一个陌生的地方，得先知道目的地在哪儿呀！得通过各种技术手段，像侦探破案似的，把那个特定的基因给揪出来。
然后呢，就该准备载体啦。
载体就像是一辆小货车，要把基因这个“宝贝”给装进去，拉到它该去的地方。
这小货车可得选好喽，得合适才行，不然基因在里面不舒服可不行。
接下来，把基因和载体连接到一块儿。
这就好像给基因找了个“家”，让它安稳地待在里面。
这连接的过程可得仔细着点儿，不能有一丁点儿差错。
之后，把连接好的载体导入大肠杆菌里。
这就好比把货物运进了仓库。
这导入的方法也有好几种呢，就看哪种适合咱啦。
导入之后，就得让大肠杆菌好好生长啦。
给它提供适宜的环境，就像咱人得住在舒服的房子里一样。
让大肠杆菌在里面开开心心地生活，把咱的基因好好复制。
这时候你可能会问啦，那怎么知道基因克隆成功没呀？嘿嘿，这就得检测啦。
就像考试要看看成绩一样，得知道自己做得对不对。
咱再想想，这基因克隆就像是搭积木，一块一块地搭起来，最后搭成一个漂亮的城堡。
每一步都得小心翼翼，不能马虎。
你说要是中间出了差错会咋样？那可就麻烦啦，就像搭积木搭错了一块，整个城堡可能就歪了或者倒了。
所以每一个步骤都得认真对待呀！你想想，通过这些步骤，咱就能把一个小小的基因复制好多好多份，这多神奇呀！这就是科学的魅力，能让不可能变成可能。
总之呢，大肠杆菌基因克隆虽然听起来挺复杂，但只要咱一步一步慢慢来，肯定能成功。
咱可不能怕困难，要像勇士一样勇往直前！咱要相信，通过咱的努力，一定能在这个领域做出一番大成就！。
【2019-2020年整理】基因克隆的一般流程
PCR RT-PCR 载体 连接 转化 准备感受态细胞 基因的获得
重组子筛选
下游工作
载体的选择
基因工程载体一般要求：
能在宿主细胞中复制繁殖，有较高的自主复制能力。 易进入宿主细胞，进入效率越高越好。 合适的多克隆位点（MCS）可接受外源片段，且不影响其进入宿主细 胞和在细胞中的复制。
重组子转入受体细胞
体外重组的DNA引入受体细胞
感受态:受体细胞处于易于接受外源 DNA 的状态 原理:（1）遗传物质的传递 （2）受体菌的选择与改造
重组质粒的酶切鉴定
重组子的鉴定
插入片段长度大小鉴定 质粒抽提、酶切；PCR 插入片段方向性鉴定 可以选择基因内部切点进行不对称酶切 DNA序列测定
质粒 M 酶切反应 M 酶切反应
pEGFP
pT-NGF
酶切产物凝胶回收操作步骤
（Gel Extraction Kit）
仔细切下含DNA的凝胶，置一称重的1.5ml离心管中。称重。 按300lS1溶液/100mg凝胶加入的比例加入S1溶液，置50℃水浴10分钟， 使凝胶完全溶化，每2分钟颠倒混匀一次。 将溶化后的凝胶溶液移入吸附柱，置收集管中，9000g×30秒，倒掉收集 管中的液体，再将吸附柱放入同一收集管中。 在吸附柱中加入500l W1溶液，9000g×15秒，倒掉收集管中的液体，再 将吸附柱放入同一收集管中。重复一次洗柱。 将吸附柱放入同一收集管中。9000g×1分钟。 将吸附柱放入一新1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入30lddH2O，静置1 分钟，9000g×1分钟。备用。
实验一:pEGFP-NGF质粒载体的构建
NGF 基因的克隆(T-A克隆)
基因克隆的概念
基因克隆的概念基因克隆是指以细胞或生物体为基础，通过人工手段复制出与原始生物体完全相同的基因组和基因表达的过程。
它是利用现代生物技术和分子生物学技术，通过人工手段将一个或多个基因从一个物种的生物体中提取并复制到另一个物种的生物体中，从而在目标生物体中表达出与原始基因相同的特性和功能。
基因克隆的过程可以分为五个主要步骤：DNA提取、DNA切割、DNA连接、DNA转化和筛选。
首先，进行DNA提取。
DNA可以从目标生物体的组织样品中提取，通常使用聚合酶链式反应(PCR)或限制酶切技术来放大和获取所需的基因片段。
接下来，进行DNA切割。
使用一种特殊的酶，即限制酶，可以将特定的DNA 序列切割成片段，从而得到所需的基因片段。
然后，进行DNA连接。
在连接过程中，将目标基因片段插入到载体DNA中，形成重组DNA。
常见的载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等，它们可以用于将基因片段转移至目标生物体中。
接着，进行DNA转化。
将重组DNA导入到宿主细胞中，使其在宿主细胞中复制和表达。
常使用细菌或酵母等微生物作为宿主细胞。
最后，进行筛选。
通过筛选方法来鉴定带有目标基因的宿主细胞，如选择性培养基、荧光标记等。
这样就可以筛选出目标基因在宿主细胞中稳定复制和表达的克隆。
基因克隆的应用非常广泛。
在农业领域，基因克隆可以用于制造具有抗虫、抗病、抗逆境等特性的转基因作物；在医学领域，基因克隆可以用于合成药物、生产重组蛋白和生物材料等；在基础科学研究中，基因克隆可以用于分析基因功能、研究疾病机制等。
然而，基因克隆也存在一定的问题和争议。
首先，基因克隆技术涉及到伦理和道德问题。
由于基因克隆涉及到对生命进行人工干预，引发了关于对生命是否应当加以个体尊重和保护的争议。
其次，基因克隆过程中可能发生不确定的突变和不稳定的基因表达，导致不可预测的副作用和潜在风险。
此外，一些人担心基因克隆可能导致基因多样性的减少，进而影响生物体的适应性和生存能力。
基因克隆方案
基因克隆方案基因克隆是现代生物学中一项重要的技术手段，可以帮助科学家们研究和理解基因在生物体内的功能以及相互作用关系。
本文将介绍一种基因克隆的方案，包括所需材料、实验步骤以及预期结果。
材料准备：1. 原核或真核生物DNA样本2. 大肠杆菌或其他合适的宿主细胞3. 抗生素培养基4. 离心管和显微管5. 高速离心机6. 热循环仪7. DNA聚合酶、限制性内切酶、连接酶等相关试剂实验步骤：1. DNA片段的制备a. 提取所需的DNA样本，并利用限制性内切酶进行酶切，得到所需的目标DNA片段。
b. 进行DNA片段的纯化，通过凝胶电泳确认目标DNA片段的大小，并将其收集起来。
2. 载体的制备a. 准备合适的载体，如质粒或病毒。
b. 利用限制性内切酶对载体进行酶切，以开放载体的多个切位。
c. 将目标DNA片段与载体进行连接，使用连接酶催化反应使其稳定结合。
3. DNA的转化与筛选a. 将连接好的DNA测序样本转化到合适的宿主细胞中，如大肠杆菌。
b. 将转化后的细胞培养于含有抗生素的培养基上，以筛选带有目标DNA的克隆。
c. 通过PCR等方法检测筛选出的克隆是否携带目标基因，确认克隆是否成功。
4. 克隆的扩增与提取a. 选择带有目标基因的克隆进行扩增培养。
b. 利用高速离心机将细胞进行离心分离，提取出目标DNA。
预期结果：经过以上步骤，我们可以获得目标基因的克隆并进行扩增。
在实验结果中，我们能够观察到目标DNA片段在凝胶电泳图谱中的特定带状条带，同时，通过PCR验证可以进一步确认克隆是否成功。
此外，最终扩增的目标基因克隆可以用于后续的实验研究，如转基因生物的构建或基因功能的研究。
总结：通过以上实验方案，我们可以使用基因克隆技术获得目标基因的克隆，并获得扩增后的纯净DNA样本。
这项技术在现代生物学和医学研究中具有广泛的应用前景，为科学家们研究基因的功能及其在人类健康中的意义提供了关键的工具。
然而，需要注意的是，基因克隆技术的操作需要严格遵守实验室安全规范，并经过充分的训练，以确保实验的准确性和安全性。
基因克隆全过程
基因克隆全过程Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（50 次量）割胶回收操作流程：全套操作约需 30 分钟，详细说明如下。
1. 使用TBE 缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳。
2. 在紫外灯下切出含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，此时应注意尽量切除不含目的 DNA 部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高 DNA 回收率。
注）切胶时请注意不要将DNA 长时间暴露于紫外灯下，以防止DNA 损伤。
3. 切碎胶块。
胶块切碎后可以加快操作步骤6 的胶块融化时间，提高 DNA 的回收率。
4. 称量胶块重量，计算胶块体积。
计算胶块体积时，以1 mg=1 μl 进行计算。
5. 向胶块中加入胶块融化液 DR-I Buffer，DR-I Buffer 的加量如下表：均匀混合后75℃加热融化胶块（低熔点琼脂糖凝胶只需在45℃加热）。
此时应间断振荡混合，使胶块充分融化（约 6～10 分钟）。
注）胶块一定要充分融化，否则将会严重影响 DNA的回收率。
7. 向上述胶块融化液中加入DR-I Buffer量的1/2体积量的 DR-II Buffer，均匀混合。
当分离小于 400 bp的 DNA 片段时，应在此溶液中再加入终浓度为 20%的异丙醇。
8. 将试剂盒中的 Spin Column 安臵于 Collection Tube 上。
9. 将上述操作 7 的溶液转移至 Spin Column 中，12,000 rpm 离心 1 分钟，弃滤液。
注）如将滤液再加入 Spin Column 中离心一次，可以提高 DNA 的回收率。
10. 将500 μl的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm 离心 30 秒钟，弃滤液。
11. 将700 μl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm 离心30 秒钟，弃滤液。
注）请确认Rinse B 中已经加入了指定体积的100%乙醇。
基因克隆方法
基因克隆方法
基因克隆方法是一种重要的生物技术手段，它可以将一个生物体的基因复制到另一个生物体中，从而实现基因的传递和改变。
这种方法在生物学、医学、农业等领域都有广泛的应用，可以用来研究基因功能、制备重组蛋白、生产转基因作物等。
基因克隆方法的基本步骤包括：DNA提取、限制性内切酶切割、DNA连接、转化和筛选等。
首先，需要从目标生物体中提取DNA，然后使用限制性内切酶对DNA进行切割，得到所需的基因片段。
接着，将基因片段与载体DNA连接，形成重组DNA。
将重组DNA转化到宿主细胞中，使其表达目标基因。
最后，通过筛选方法，筛选出表达目标基因的细胞，得到所需的基因克隆产物。
基因克隆方法的应用非常广泛。
在生物学研究中，可以利用基因克隆方法研究基因功能、构建基因库、制备重组蛋白等。
在医学领域，可以利用基因克隆方法研究疾病基因、制备基因药物等。
在农业领域，可以利用基因克隆方法制备转基因作物，提高作物产量、抗病性等。
然而，基因克隆方法也存在一些问题。
首先，基因克隆可能会引起基因突变或不稳定性，导致不良后果。
其次，基因克隆可能会引起道德和伦理问题，例如制备人类克隆体等。
因此，在使用基因克隆方法时，需要严格遵守相关法律法规和伦理规范，确保其安全和合法性。
基因克隆方法是一种重要的生物技术手段，具有广泛的应用前景。
在使用基因克隆方法时，需要注意其安全和合法性，以充分发挥其优势，为人类社会的发展做出贡献。
基因克隆实验步骤
基因克隆实验步骤
嘿，朋友们！今天咱就来唠唠基因克隆实验那些事儿。
你说基因克隆实验像啥？就好比搭积木！咱得把基因这块特殊的“积木”给准确无误地拼起来。
首先呢，咱得有个“模板”，也就是咱要克隆的那个基因。
这就像你要搭个城堡，得先知道城堡啥样儿不是？然后呢，准备各种工具和材料，这就跟你搭积木得有各种形状的积木块一个道理。
接下来就是关键步骤啦！得把基因从原来的地方“揪”出来。
这可不是个容易事儿，得小心翼翼的，就像从一堆杂物里精准地挑出你想要的那个宝贝。
挑出来后，咱得给它找个“新家”呀，这新家就是载体。
把基因安安稳稳地放进去，让它在里面舒舒服服的。
这过程可得仔细着点儿，别弄出啥岔子。
然后呢，把带着基因的载体送进细胞里。
嘿，这细胞就像是个大工厂，基因在里面就开始工作啦，开始复制自己，一变二，二变四，越来越多。
哎呀，你想想，这多神奇啊！就这么一步步地，咱就把基因给克隆出来啦。
你说这像不像变魔术？咱就是那个神奇的魔术师，把不可能变成可能。
做这个实验可不能马虎，每个步骤都得认真对待。
就好比走路，一步一步都得踩稳了，不然就得摔跟头。
而且啊，这实验有时候就像一场冒险，会遇到各种各样的问题和挑战。
但咱可不能怕，得鼓起勇气去面对，去解决。
等你成功克隆出基因的时候，那种成就感，哇，简直没法形容！就好像你爬上了一座很高很高的山，看到了最美的风景。
总之呢，基因克隆实验是个有趣又充满挑战的事儿。
只要咱用心去做，肯定能收获满满的惊喜！咱都能成为基因克隆的小能手，让那些基因在咱的手下乖乖听话！怎么样，是不是很有意思呀？赶紧去试试吧！。
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实验名称：基因克隆
实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、
NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等；
操作步骤：
1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化，
在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；
2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接
T4lages 1.0
10×T4buffer 2.0
EZ-T 1.0
目的基因8.0
DdH2O 8.0
＿＿＿＿＿＿＿＿＿
20ul
3、取100µl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下
面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；
4、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并
使转化体产生抗药性；
5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬菌体，
并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时；
6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振
荡培养3h；
7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；
8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充
分混匀，-80℃保存；
实验名称：假病毒的制备
实验器材：荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工小剂量抽提试剂盒、生工胶回收试
剂盒、恒温加热器、NEB连接体系、灭菌纯水、冰、LB培养基、氨苄、卡那、卡那抗性平板、甘油等；
操作步骤：
1、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含氨苄（1：1000）的5ml LB 培
养基中过夜培养中，37℃，200r/min；
2、收集菌体抽提质粒，用生工小剂量抽提质粒试剂盒跟据说明书进行抽提，在抽提过
程中要注意防污染（在最后一步的洗脱可以用预热的洗脱液洗脱，在加洗脱液的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）；
3、用抽提好的质粒做双酶切用NEB公司的体系，同时做一管PET28-MS2的双酶切20ul BamH 1 2.5ul BamH 1 1.0ul
HindIII 2.5ul HindIII 1.0ul
BSA 5.0ul BSA 2.0ul
Buffer2 5.0ul Buffer2 2.0ul
产物20ul PET28-MS2 8.0
H2O 15ul H2O 15ul
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
50.0 ul20.0ul
37度3小时，
4、配置1%的大空胶，将双酶切产物跑胶，割胶（在割胶的时候要注意产物不要在紫外
灯光下暴露太久），用生工胶回收试剂盒进行回收根据说明书进行纯化；PET28-MS2直接用生工PCR产物回收试剂盒进行纯化；
5、将回收好的酶切产物进行连接用NEB的连接体系，16℃，过夜连接
T4lages 1.0ul
10×T4buffer 2.0ul
PET28-MS2 4.0ul
目的片段8.0ul
DdH2O 6.0ul
＿＿＿＿＿＿＿＿＿
20ul
6、取100µl摇匀后的BL21感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进
行下面的操作），加入10µl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min；
7、加入500µl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状
态并使转化体产生抗药性；
8、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200µl重悬
菌体，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（卡那抗性），37℃倒置培养12~16小时；
9、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（卡那）的LB液体培养基中，37℃
振荡培养，培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定；
10、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），
充分混匀，-80℃保存；
11、选取测序结果正确的菌种以1：100 的比例接种到含卡那霉素的5ml LB 培养基中
过夜培养，37℃，200r/min；
12、将1ml 过夜培养的菌液接种到100ml 含卡那青霉素的LB 培养基中，37℃，200 r
/min 振荡培养4 -6h 至OD 600值大约在0.6-0.8；
13、加入终浓度为1mmol/L (IPTG)，在37℃条件下，200 r /min诱导表达16h；
14、10,000 rpm，4℃，离心10min，收集菌体，加入1×超声buffer 5 ml重悬菌体；<
摇床一小时>
15、超声处理：置于冰上超声，功率300W，超声时间2<5>s，间隔时间3<5>s，全程
3min，超声12<10>个循环；
16、将破碎完全的表达产物12,000 rpm，4℃，离心30min，沉淀细胞碎片，收集上清
到另一干净的离心管中，得到含病毒样颗粒的表达产物，分装保存-80℃保存；
17、将得到的病毒样颗粒的双酶消化验证实验分别取4 份用NEB公司的DNaseI、
生工的RNaseA 进行消化37℃消化1h-2h
18、1.0％琼脂糖凝胶电泳检测酶消化结果；
19、去第1次消化产物进行第2次消化37℃1h-2h（用NEB公司的DNaseI）
DNaseI 40ul
10×DNaseIBuffer 100ul
消化产物10ul
TE 850ul
＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿
1ml
20、DNaseⅠ消化后，加入终浓度为5mM的EDTA终止反应，然后65度10分钟使DNaseⅠ失活；
21、提取RNA标本后上荧光定量，检验病毒颗粒的浓度和质粒的消化情况。