基因克隆及克隆基因的表达
基因克隆和表达技术及其应用研究
基因克隆和表达技术及其应用研究在现代生物技术领域，基因克隆和表达技术被广泛应用于生物医药、农业生产、环境保护等多个领域，是一项重要的研究方向。
本文将介绍基因克隆和表达技术的原理、工具和应用，旨在深入探讨该技术在现代生物科技领域中的应用价值。
一、基因克隆的原理与工具基因克隆是指将目标DNA片段放入载体中，通过复制和传递，获得大量相同的DNA分子的过程。
基因克隆需要用到一系列工具和分子生物学技术。
其基本的步骤包括：DNA提取、限制酶切割、连接和转化等。
DNA提取是指从细胞中获取目标DNA，一般从细胞核中提取DNA样品。
限制酶切割是一种利用特定的限制酶将DNA切割成不同长度的碎片的技术。
连接是指将目标DNA片段与载体DNA进行配对，在适当的连接条件下会形成一个大的DNA分子，也称作重组DNA。
最后的转化是将重组DNA重新引入一个宿主细胞，使其进行繁殖。
这些步骤组成了一个典型的基因克隆工作流程。
在基因克隆中，一些关键工具也是必不可少的。
例如，限制酶和DNA连接酶是进行酶切和连接的酶类；载体是将目标DNA载入的载体分子。
当然，在实验设计过程中，也需要考虑到多种子序列的选择，以获得最优的结果。
二、基因表达技术基因表达技术是指将克隆好的基因转录和翻译为蛋白质的过程。
基因表达技术所涉及的核心部分主要为转染和转录。
转染是指将载体转化到目标细胞中的过程。
转染可以分为多次批量的直接转染和、转染载体的两种方式。
对于细胞质和细胞核分离的情况，病毒载体或质粒载体也可以被用来介导转录。
质粒载体在转录的时候需要被移入到细胞的核中，由此促进了 DNA 受体和 RNA聚合酶之间的相互作用。
另一种重要的基因表达技术是转录，也称作转录调节。
转录调节可以分为两类：正调节和负调节。
正调节是指通过上调特定基因的表达、促进特定转录的过程；负调节是指通过下调特定基因的表达、抑制特定转录的过程。
转录调节受到多种因素的影响，例如转录因子和超融合酶等分子的运作。
克隆基因的表达
(2)-35区与-10区之间的距离
这两个保守区间的距离越是接近于17bp，启 动子的活性就越强。
2.翻译起始序列对表达效率的影响 （1）SD序列
SD序列与16SrRNA分子之间的碱基互补程 度，可明显影响mRNA的翻译速度，当序列 为5‘-GGAGG-3’，可与16SrRNA3’端完 全互补，翻译效率最高；而当该序列发生 单碱基突变时，翻译效率会下降30倍。
特定的时间顺序发生，称之为基因表达的 时间特异性。
• 多细胞生物基因表达的时间特异性又称阶 段特异性。
（二）空间特异性 • 在个体生长全过程，某种基因产物在个体
按不同组织空间顺序出现，称之为基因表 达的空间特异性
• 基因表达伴随时间顺序所表现出得这种分 布差异，实际上是由细胞在器官的分布决 定的，所以空间特异性又称细胞或组织特 异性
七、原核表达体系
表达体系的建立包括表达载体的构建、受体细胞的 建立及表达产物的分离、纯化等技术 步骤： 获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表 达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导 靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、 进一步检测
（一）获得目的基因
1.对外源目的基因的要求
原核生物缺乏真核生物转录后的加工系统； 同时也缺乏真核生物翻译后的加工系统， 所以目的基因不应具有5’端非编码区以及内 含子结构，只编码成熟的蛋白质或多肽
当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。
当宿主大量生长后，再诱导载体质粒的复制，增 加拷贝数。
6.提高表达产物的稳定性
防止被宿主的酶降解 （1）设计成融合蛋白
基因克隆与表达及功能鉴定研究
基因克隆与表达及功能鉴定研究在现代生命科学领域中，基因克隆与表达以及功能鉴定是非常重要的研究方向之一，它涉及到许多生物医学、农业、工业和环境等领域的研究和实际应用。
本文将从基因克隆与表达的基本原理、方法、技术和应用，以及功能鉴定的原理、方法、技术和应用等方面进行探讨。
一、基因克隆与表达基因克隆是指通过分子生物学技术，将含有某个或某些特定基因的DNA序列从一个大的DNA分子（如染色体）中分离出来，然后插入到特定的载体DNA中，形成重组DNA分子的过程。
基因表达是指基因信息的转录和翻译过程，将基因的DNA序列转录成RNA分子，然后翻译成蛋白质分子的过程。
基因表达是生物体形成和发展的基础，也是生命活动的重要表现形式。
1. 基因克隆原理基因克隆的主要原理是利用限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及质粒或噬菌体等DNA载体的特性，将特定DNA序列插入到载体DNA中，形成重组DNA分子。
限制酶是一种能够识别、切割DNA分子特定序列的酶，其识别序列具有一定的特异性。
DNA连接酶是一种能够连接两个DNA分子的酶，常用的有T4 DNA连接酶和快速连接酶等。
DNA聚合酶是一种能够在DNA模板上合成互补链的酶，其作用是在重组DNA分子中完成互补链的合成。
2. 基因克隆方法基因克隆的主要方法有限制性片段长度多态性（RFLP）分析、聚合酶链式反应（PCR）克隆、原核表达克隆和真核表达克隆等。
RFLP分析是一种利用限制酶对DNA序列进行切割，并根据不同的RFLP位点进行区分的方法，其主要应用于基因型鉴定和进化研究等领域。
PCR克隆是一种利用PCR技术扩增目标基因或DNA片段，并将扩增产物克隆到载体DNA中的方法，其主要应用于基因检测、DNA测序和分子克隆等领域。
原核表达克隆是一种利用质粒或噬菌体等原核生物作为DNA载体，将外源基因转入细菌或古细菌等原核生物细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
真核表达克隆是一种利用真核生物（如哺乳动物、鸟类、昆虫、线虫等）作为DNA载体，将外源基因转入具有表达能力的真核细胞中，通过蛋白质表达实现基因功能研究的方法。
基因的克隆与表达课件
----TAC -----TTG GAC CTT AAG GAT CCA---
DNA序列
AAT CGG AAG AAT TCA GAC CTA GGT TTA GCC TTC TTA AGT CTG GCT CCA
基因的克隆与表达课件
位相载体----含有3种读码框的系列载体
基因的克隆与表达课件
优点： • 表达效率高 • 产物稳定 • 易鉴定：融合蛋白分子量大，电泳可
➢基因克隆(gene cloning) ➢基因表达(gene expression)
-原核基因表达 -真核基因表达
基因的克隆与表达课件
基因克 隆 Gene Cloning
基因的克隆与表达课件
➢概述 ➢克隆载体 ➢受体细胞 ➢体外重组的策略 ➢基因克隆工作流程
基因的克隆与表达课件
一、概述
• 确定了遗传信息的携带者，即基因的盆 子载体是DNA而不是蛋白质
基因的克隆与表达课件
（二）体外重组 连接体系的建立： • 温度：粘末端连接：12-18℃
平末端连接：室温（低于30℃) • DNA量：载体分子数/目的基因分子数
=1：1-3 • 酶量：平端连接时需加大酶量
基因的克隆与表达课件
（三）转化—Cacl2法、电击法
（四）重组子的筛选及鉴定
1、筛选：平板法（抗生素、蓝白斑）
基因的克隆与表达课件
二．原核生物基因结构和表达特点
基因的克隆与表达课件
• 原核生物染色体DNA是裸露的环形 DNA，其转录和翻译是偶联的连续 进行。
• 原核生物形成多顺反子mRNA： mRNA在合成过程中和多个核糖体 结合，翻译形成多条肽链。
基因的克隆与表达课件
3、一般不含内含子（intron），没有转 录及翻译后加工系统
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结
基因工程中的基因克隆与基因表达实验总结基因工程作为一门新兴的交叉学科，已经广泛应用于生物医学、农业、环境保护等领域。
其中，基因克隆和基因表达实验是基因工程的核心技术，对于研究基因功能和开发新药已经起到了重要作用。
本文将对基因工程中的基因克隆和基因表达实验进行总结，并探讨其在科学研究和应用中的前景。
一、基因克隆实验基因克隆是通过重组DNA技术，将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入到另一个生物体中的过程。
它是研究基因功能、生物制药和转基因等领域的基础。
基因克隆实验主要包括以下几个步骤：1. DNA提取与限制性内切酶切割：通过提取DNA样品，使用限制性内切酶切割将目标基因和载体DNA切割成相应片段。
2. 基因插入：将目标基因与载体DNA片段进行连接，常用的方法是使用DNA连接酶将两者黏合。
3. 转化与筛选：将连接后的DNA转入到宿主细胞中，使其成为转基因细胞。
通过选择性培养基进行筛选，可以获得拥有目标基因的转基因细胞。
通过基因克隆实验，我们可以获得不同生物体的目标基因，并进行后续的研究和应用。
例如，通过将某种植物的耐旱基因克隆到其他作物中，可以提高作物的抗旱能力，增加农作物产量。
二、基因表达实验基因表达实验是将目标基因在宿主细胞中进行转录和翻译，产生具有特定功能的蛋白质的过程。
基因表达实验是研究基因功能和制备重组蛋白等领域的重要手段。
基因表达实验主要包括以下几个步骤：1. 选择合适的表达系统：根据需要表达的蛋白质的性质和规模，选择合适的表达系统。
常用的表达系统包括细菌、酵母、哺乳动物细胞等。
2. 构建表达载体：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制性内切酶和DNA连接酶进行连接，并通过测序确保插入正确。
3. 细胞转染：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
不同表达系统有不同的转染方法，如细菌的化学转型、酵母的电转染等。
4. 表达和纯化：经过一定时间的培养，宿主细胞会表达目标基因，合成目标蛋白质。
可以通过蛋白质纯化技术，如亲和层析、凝胶电泳等手段获得纯度较高的目标蛋白质。
基因克隆与表达
基因克隆与表达基因克隆与表达是生物学领域中重要的技术手段和研究方法。
通过基因克隆和表达，科学家能够研究特定基因的功能、调控机制以及其在生物体内的作用，这对于深入了解生物体的生理过程和疾病发生机制具有重要意义。
本文将介绍基因克隆与表达的原理、方法以及应用。
一、基因克隆基因克隆是将特定基因从一个生物体中分离并复制到另一个载体中的过程。
这个过程主要涉及DNA的分离、复制和连接。
常用的基因克隆技术包括PCR、限制性内切酶切割、琼脂糖凝胶电泳和基因插入等。
1. PCR聚合酶链反应（PCR）是一种强大的基因扩增技术。
它通过不断地重复某一特定区域的DNA序列，使其得以大规模复制。
PCR可以在短时间内合成大量目标DNA片段，为基因克隆提供了充足的材料。
2. 限制性内切酶切割限制性内切酶可以识别并切割特定的DNA序列。
通过选择合适的限制性内切酶，可以实现将目标基因从源DNA中切割下来，为下一步的基因克隆做好准备。
3. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是一种常用的DNA分离技术。
通过将DNA样品加入琼脂糖凝胶槽中，并施加电场，DNA片段会根据其大小在凝胶中迁移。
凝胶电泳可以帮助科学家分离和纯化目标基因。
4. 基因插入基因插入是将目标基因连接到载体上的过程。
载体可以是质粒、病毒或者人工染色体等。
通过连接酶的作用，目标基因与载体可以稳定地结合在一起。
二、基因表达基因表达指特定基因通过转录和翻译过程转化为蛋白质的过程。
从基因克隆到基因表达，可以分为以下几个步骤：转染或转化、筛选和检测。
1. 转染或转化转染是指将外源DNA导入到动物细胞中的过程，而转化是将外源DNA导入到细菌细胞中的过程。
转染和转化可以通过多种方法实现，如化学法、电穿孔法和基因枪法等。
2. 筛选筛选是为了确定是否成功将目标基因表达在宿主细胞中而进行的步骤。
常见的筛选方法包括荧光筛选和克隆筛选。
荧光筛选利用荧光蛋白标记目标基因，观察细胞是否出现荧光信号。
克隆筛选则利用选择性培养基，筛选出含有目标基因的克隆。
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达
分子生物学大实验——目的基因的克隆及表达第一节基因操作概述............................................................................. 错误!未定义书签。
一、聚合酶链式反应(PCR) ............................................................. 错误!未定义书签。
二、质粒概述................................................................................... 错误!未定义书签。
三、凝胶电泳................................................................................... 错误!未定义书签。
四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化....................................... 错误!未定义书签。
五、重组质粒的连接....................................................................... 错误!未定义书签。
六、限制性内切酶消化................................................................... 错误!未定义书签。
七、SDS-PAGE蛋白质电泳........................................................... 错误!未定义书签。
第二节材料、设备及试剂..................................................................... 错误!未定义书签。
基因工程7克隆基因的表达概述
7.3.1.2 终止子
提供转录停止信号的DNA序列称为终 止子，它可被RNA聚合酶识别并停止合成 mRNA。通常终止信号是一小段DNA片段 ，它的RNA转录本上碱基对可自身相互配 对形成柄-环结构。
强启动子是能维持高频率转录的启动子 ，通常控制那些细胞需要其大量转译产物的 基因转录；而弱启动子具有相对较低的转录 效率，指导那些仅需要其少量转译产物的基 因转录。
利用基因工程技术，可将由弱启动子所 控制的基因放在强启动子的下游，从而获得 高效表达。
两个保守区之间的DNA对启动子的功能 也有影响，各启动子都需要一些最适的间隙 ，通常认为间隙为17 bp的启动子功能较强。
(1) 能识别和除去外源基因中的内含子，加工 形成成熟的mRNA，即带内含子的天然基因是 可以利用的；
(2) 真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠杆 菌表达的蛋白是无糖基化的，糖基化对某些表 达蛋白的免疫原性影响很大。
真核细胞作宿主表达系统尚存在以下几个问 题：
(1) 转化真核细胞的效率低； (2) 表达效率不够高； (3) 细胞培养(动植物) 工艺较复杂，成本高； (4) 选择标记及选择系统较少。
2. 影响mRNA转译效果的因素：
(1) SD序列与反SD序列的互补程度：互补程 度高，则表达强。
(2) SD序列与AUG之间的间隔距离(spacer)， 使用不同的启动子，表达不同的基因，其 最佳间隔不一样。
(3) –20 bp到＋13 bp这一段序列中不要有二级 结构（发卡结构）。
(4) 连接在SD序列后面的4个碱基的改变，会 对转译效率发生很大的影响，如果这个区 域由4个A组成，其转译作用最为有效；而 当其被4个C或G替代，则转译效率仅为最高 值的25~50%。
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限制性内切酶
Sma I Sau 3A I Not I Sfi I
识别位点
CCC’GGG GGG’CCC GATC’ ’CTAG GC’GGCCGC CGCCGG’CG GGCCNNNN’NGGCC CCGGN’NNNNCCGG
LOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
LOGO
基因克隆、 克隆基因的表达
吉林大学白求恩医学院 分子生物学教研室 讲师
孙 巍
Tel: 0431 - 85619369
2012-10
基因克隆趣闻
荧光蛋白基因克隆猫
科学家复活冰冻死老鼠 修正基因蚊子防控疾病
基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛 基因克隆胚芽造就健康婴儿
LOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
1. 具有特定的识别和切割位点 2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） 3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端 4. 不同的酶可以产生同样的末端
5.不同的酶可以识别同一个序列
6. 切割会受其他因素的影响
LOGO
94℃
55℃
37℃
LOGO
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 活 性
80 60 40
(%)
20 40 50 100 60 70 80 90
温度(℃)
LOGO
94℃
55℃
72℃
限制性内切酶
获诺贝尔化学奖
噬菌体DNA
限制性内切酶
DNA连接酶 重组DNA分子
Paul Berg a biochemistry at Stanford
LOGO
克隆：通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同
的子代群体。
molecule DNA clone Cell colony organism
在DNA双链内部的特异位点识别并切割DNA 一个细胞只接受一个 重组DNA分子
单克隆
LOGO基因组DNA（genomic DNA library）： 包含某一个生物细胞或组织全部基因组DNA序列的随机克
四、重组DNA转入受体细胞（转）；
五、重组体的筛选与鉴定（筛）。
LOGO
一、目的DNA的分离获取（分）
分离获取目的DNA有多种方法：
(一) PCR——待扩增目的基因两端序列法——直接合成目的DNA（序列已知、片段较短）
LOGO
修正基因蚊子防控疾病
科学家把一种可防疟疾的 基因植入蚊子基因之中,对蚊子 基因进行修正。 在实验中,科学家们不仅仅 在蚊子体内植入了防疟疾基因, 还植入了另一种可以使蚊子眼 睛发出荧光的基因。这样,科学 R反应条件 PCR过程 PCR的特点
72℃
引物1
DNA引物
引物2 Taq酶
LOGO
PCR的基本原理
PCR反应条件 PCR过程 PCR的特点
95℃
第1轮结束 第2轮开始
LOGO
PCR的基本原理
互连后？
Bam HⅠ
Bg lⅡ
AGATCT TCTAGA A +GATCT ALOGO TCTAG
GGATCC CCTAGG
G + GATCC CCTAG G
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
5. 不同的酶可以识别同一个序列 同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶
隆群体，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息。如何从中钓取基因？LOGO
用带有标记的、已知序列的核酸片段 (单链
RNA或DNA)作为探针，与待测DNA或RNA
样品进行核酸分子杂交，来检测被测样品中 是否有与探针序列同源的目标序列，以及目 标序列的量。
LOGO
荧光蛋白基因克隆猫
由韩国科学技术部公布的对比 照片显示出3只具有荧光蛋白 基因的克隆猫（上图为普通光 线照射下，下图为紫外线照射 下）
具有荧光蛋白基因的克隆 猫在紫外线照射下会变色
LOGO
科学家复活冰冻死老鼠
一只老鼠死亡后被冷冻了 16年之久,日本科学家从其体内 提取基因克隆了一只新老鼠,这 是人类首次成功克隆冷冻动物 。
LOGO
基因转换让蝌蚪长出三颗眼睛
2007年,英国科学家在实验室 中利用基因转换技术成功地在蝌 蚪头部培育出第三颗眼球。这个 消息对盲人来说是一个天大的喜 讯。利用这种技术,干细胞科学家 们真的有可能实现他们再造眼球 的梦想。
LOGO
基因克隆胚芽造就健康婴儿
PCR反应条件 Taq PCR过程 PCR的特点
72℃
Taq
Taq
Taq
LOGO
PCR的基本原理
PCR反应条件 72℃ PCR过程 PCR的特点
第2轮结束
体外高效特异性的扩增目的DNA片段
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
LOGO
PCR的基本原理
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
平端切口 （blunt end）
黏端切口 （sticky end）LOGO
粘性末端又可分为两种：
1）5-端突出
5 ………GAATTC……… 3 3 …… CTTAAG……… 5
EcoRI
LOGO
转膜、
变性、
封闭、
加入变性的探针、
杂交、 洗涤、 检测杂交体。
LOGO
如何实现特异性的获得目的基因？
LOGO
聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction, PCR
LOGO
PCR的基本原理
PCR反应条件 95℃ PCR过程 PCR的特点
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
1
2 模板DNA 3
94
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
形 成
DNA 2
55 22
条变 单性 链
PCR循环
LOGO
PCR的基本原理
标准的PCR反应体系
4种dNTP混合物 引物 模板DNA Taq DNA聚合酶 Mg2+ 各200umol/L 各10～100pmol 0.1～2ug 2.5u 1.5mmol/L
• PCR反应条件 • PCR过程 • PCR的特点
子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
时间（min）
4
5
LOGO
PCR的基本原理
PCR反应条件 50℃ PCR过程 PCR的特点
引物1
DNA引物
引物2
LOGO
PCR的基本原理
Taq酶
能识别同一序列（切割位点可同或不同）但来源不同的两种酶。
Bam HⅠ XmaⅠ
GGATCC CCCGGG CCTAGG GGGCCC
GGATCC CCCGGG CCTAGG GGGCCC
G GATCC C CCGGG CCTAG + G CCCGG + G GATCC G CCC + GGG G + CCC CCTAG GGG
核酸水解酶，裂解磷酸二酯键。
LOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
1. 具有特定的识别和切割位点 识别位点通常为6或4碱基序列
II型限制性内切酶的识别位点举例（'示切割位点） 限制性内切酶
Apa I BamH I Pst I EcoR I
识别位点
GGGCC’C C’CCGGG G’GATCC CCTAG’G CTGCA’G G’ACGTC G’AATTC CTTAA’G
BstⅠ SmaⅠ
为DNA操作增加了酶的可选余地
LOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
6. 切割会受其他因素的影响
通常不能切割在识别位点内有特异碱基甲基化的序列。 缓冲液或环境温度也会影响一些酶的特异性。 如，EcoR I在正常情况下识别“-GAATTC-”序列，但在甘油 浓度大于5%（v/v）或反应温度较低时识别序列可变为“AATT-”或“-嘌呤嘌呤AT嘧啶嘧啶-”，这种现象称为星号活 性（star activity），以EcoR I*表示。
5- AATTC……. 3 5………GOH HOG…… 5 3………CTTAA -5
2）3-端突出
5 ………CTGCA G………3 3 …… C ACGTC……… 5
PstI
5 ………CTGCAOH 3 ………G-5 5- G……… 3
HO
基因的秘密随着科技的日益发达而 被逐渐揭开。血友病、色盲、白化 病……这些遗传病困扰着一个又一 个家庭，也激励着一代又一代科学 家为之奋斗。
LOGO
分子生物学关键的技术突破： DNA重组技术
1980年，
1972年，
世界上第一个重组DNA分子诞生
猿猴病毒DNA
2. 识别的核苷酸序列通常为回文结构（palindrome） 两条核苷酸链中，从5’到3’方向的核苷酸序列完全一致
LOGO
Ⅱ型限制性内切酶具有一些共性和特性：
3. 切割双链DNA分子后产生黏端或平端
HindⅡ
Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
LOGO
限制性核酸内切酶 Restriction endonuclease
可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，分子生物学中通常使用的是Ⅱ型：