Agilent1260高效液相色谱仪

山东康源堂中药饮片有限公司

标准操作规程

题目:Agilent1260高效液相色谱仪标准操作规程

编号：

颁发部门：质量管理部起草：日期：审核：日期：批准：日期：执行日期：

分发部门：质量管理部、检验室

依据：《中国药典》2015年版四部

1. 目的：正确使用仪器，确保化验结果的准确度、精密度，延长仪器使用寿命。

2. 范围：适用于Agilent1260高效液相色谱仪及色谱数据工作站的操作

3. 职责：

3.1操作人员：按照本操作规程操作仪器，对仪器进行自检，作使用登记。

3.2负责人：负责监督仪器操作是否符合规程，对仪器进行定期自检、仪器综合管理。

4.要求：

4.1开机

4.1.1溶剂准备

按要求准备所需流动相，每瓶均超声10min排气，将原来浸泡在甲醇中的滤头取出对应放在各个流动相中（A：二次蒸馏水；B:色谱纯甲醇；C：色谱纯乙腈；D:缓冲溶液；）。

4.1.2开启工作站

4.1.2.1启动计算机

打开计算机电源，登陆 windows 操作系统。

4.1.2.2启动工作站

打开 Agilent 1260 各模块电源，待 Agilent 1260 各模块自检完成后(各模块右上角指示灯为黄色或者无色)，点击屏幕桌面图标“HPLC -1260（联机）”，则进入工作界面。

模块右上角状态灯颜色说明：

无色：未开电源或者模块准备就绪；

黄色：模块未准备就；

绿色：正在进样分析；

红色：模块出错；

所有模块红色：仪器有漏液工作站图形颜色说明：

绿色：模块准备就绪；

黄色：模块未准备就绪；

蓝色：正在进样分析；

红色：出错或者不能联机；

灰色：此模块没启用。

将鼠标移至系统或各个模块的状态指示栏，系统会自动显示未就绪或出错的原因。

4.1.3冲洗流动相管路

反时针旋开泵模块上的溶液排空阀，右键单击泵视图的空白处，选择“方法”，设置“流速”为 5ml/min。将实验中需要的各个通道分别设置“溶剂”为 100%，点击确定开始冲洗，每个通道冲洗3-5分钟，若冲洗通道时压力显示超过10 bar，则可换过滤白头。

4.1.4平衡柱子

冲洗完柱子，按要求调整流动相速率及流动相比例，顺时针旋转排空阀，关闭溶液排空阀(确认泵流量为 1ml/min)，然后右键点击需用检测器模块视图的空白处，选择“方法”进入检测器的参数设置界面，按要求设置参数（停止时间与泵一致），后点击右键，选择“控制”，在弹出的窗口选择打开，开始平衡柱子，监视信号基线和压力，等待平稳后即可进样（若用缓冲溶液和有机相作为流动相，先用水和有机相平衡30 min，比例与所要求的缓冲溶液和有机相比例一致），待基线平稳后换用所要求的缓冲溶液和有机相按比例混合平衡柱子30 min）。

4.1.5保存方法

将编辑好的方法保存起来。

4.2进样分析

在每个样品进样前，从“运行控制”菜单中点击“样品信息”，编辑好数据的保存路径。进样时，逆时针旋动进样器六通阀旋钮，进样完毕立即顺时针旋回该旋钮，并拔出进样针，妥善放置。

4.3数据分析方法编辑

点击屏幕桌面图标“HPLC-1260（脱机）”。从“文件”菜单中选择“调用信号”选项，选中您的数据文件名，点击确定，数据被调出。从“图形”菜单中选择“信号选项”，设置信号包括的信息，从“范围”中选择“满量程”或“自动量程”及合适的显示时间或选择“自定义量程”手动输入 X、Y 坐标范围进行调整，点击“确定”。反复进行，直到图的显示比例合适为止。

4.4积分

4.4.1自动积分方法

从“积分”菜单中选择“积分事件”选项，选择合适的“斜率灵敏度”，“峰宽”，“最小峰面积”，“最小峰高”。从“积分”菜单中选择“积分”选项，则数据被积分。如积分结果不理想，则修改相应的积分参数，直到满意为止。后将积分参数存入方法，最后，选择“方法->保存方法/方法另存为”或直接保存数据分析方法。

4.4.2手动积分方法

选择“积分->积分事件”，选择“手动积分事件”，如需更改，更改自动积分方法后，

保存并关闭“积分事件”。选择“积分->更新方法中的手动积分事件”，保存手动积分方法；选择“积分->应用方法中的手动积分事件”，将手动积分方法应用到当前谱图中；选择“积分->删除方法中的手动积分事件”，将从当前方法中删除手动积分事件。最后，选择“方法->保存方法/方法另存为”或者直接保存数据分析方法。

4.5校正

为“标准样品”建立校正曲线(工作曲线/标准曲线)，在色谱图正确积分后才可进行校正设置。

4.5.1校正设置

从“文件”菜单中选择“调用信号”选项，选中您的标样数据文件名，点击确定，数据被调出。选择“校正->校正设置”设置校正参数。参考峰/其他峰---分钟栏留空，修改“%”以改变确认保留时间范围内的峰都被认为是参考/其他峰含量单位---填写样品含量单位选择缺省校正曲线方法，“确定”退出。

4.5.2建立校正表

选择“校正->新建校正表”。出现“新建校正表”菜单，“确定”即可。出现“校正表”表格，在图谱中选择需要校正的色谱峰，后在表格中“化合物”中填写化合物名称，“含量”中填写色谱峰对应物质含量。右侧“校正曲线”即可实时更新校正曲线图，并标注 RSD 和相关系数。“确定”保存退出。最后，选择“方法->保存方法/方法另存为”或者直接保存数据分析方法。

4.5.3添加校正级别

调用新的标样数据文件后，选择“校正->添加级别”，点击“确定”，在校正表中输入相应的标样浓度，点击“确定”，右侧校正曲线窗口则会自动更新。

4.5.4打印带校正表的报告

选择“报告->设定报告”，在“定量设置”中的计算模式一栏选定“外标法”，“报告设置”为“完整报告”后，打印报告即可在“视图->信号选项”中选择“化合物名称”即可将命名的化合物名称添加到打印的色谱图中。

4.5.2建立校正表

选择“校正->新建校正表”。出现“新建校正表”菜单，“确定”即可。出现“校正表”表格，在图谱中选择需要校正的色谱峰，后在表格中“化合物”中填写化合物名称，“含量”中填写色谱峰对应物质含量。右侧“校正曲线”即可实时更新校正曲线图，并标注 RSD 和相关系数。“确定”保存退出。最后，选择“方法->保存方法/方法另存为”或者直接保存数

据分析方法。

4.5.3添加校正级别

调用新的标样数据文件后，选择“校正->添加级别”，点击“确定”，在校正表中输入相应的标样浓度，点击“确定”，右侧校正曲线窗口则会自动更新。

4.5.4打印带校正表的报告

选择“报告->设定报告”，在“定量设置”中的计算模式一栏选定“外标法”，“报告设置”为“完整报告”后，打印报告即可在“视图->信号选项”中选择“化合物名称”即可将命名的化合物名称添加到打印的色谱图中。

4.6打印报告

选择“报告->设定报告”选项，点击“定量结果”框中“定量”右侧的黑三角，选中“外标法”，其它选项不变。选择“类型”，点击“确定”。从“报告”菜单中选择“打印”，则报告结果将打印到屏幕上。如想输出到打印机上，则在上图中左下角“目标”处，将打印机选上。若要生成其他格式的报告，则选定“文件”，然后选择相应的格式即可。在方法菜单中，选择“运行时选项表”，确认“数据分析选项”也被选中，点击“确定”。点击“保存”按钮，存储修改的方法。此方法包含校准表，建立完毕。 4.7关机

4.7.1关闭检测器的灯

关闭紫外检测器，关闭检测器的灯后冲洗系统，可以延长检测器灯的寿命。

4.7.2冲洗系统

没有盐缓冲溶液的流动相，(反相系统)用 85%~90%有机相+15%~10%水相冲洗系统和反相色谱柱或者适宜的流动相冲洗系统和反相色谱柱；有盐缓冲溶液的流动相，(反相系统)用 85%~90%水相+15%~10%有机相冲洗系统和反相色谱柱(反相系统)30min，除去反相色谱柱与系统中的盐溶液，然后用85%~90%有机相+15%~10%水相冲洗系统和反相色谱柱30min。

4.7.3封存色谱柱

(反相系统)用 90%~95%有机相+10%~5%水相封存反相色谱柱，两端封死。（如长时间存放可将柱子完全浸泡有机相内，以防用纯有机相封存反相色谱柱，如果长期保存有机相会挥发）。

4.7.4关闭电脑

将泵流速逐步降至 0ml/min，单击“关闭”按钮关闭所有模块，退出化学工作站，关闭电脑。

4.7.5关闭模块

关闭所有模块电源。

4.7.6 冲洗六通阀

上下反复旋动六通阀旋钮，用注射器注射去离子水进行反复冲洗，冲洗完毕后将旋钮旋至分析（inject）标志处，用空闲针头堵住进样口并盖上红色保护盖。

5.维护

5.1 日常维护

5.1.1运行环境

为了仪器的合理运转及延长其使用寿命，应该将仪器放置在平稳固定的台面上，要求台面无振动，周围无辐射和磁场。另外，因为流动相大多数是有机溶剂，还要保持室内有一些排风扇等通风换气的设备。

5.1.2开机维护

首先检查检测使用的流动相以及色谱柱是否准确无误，然后再打开仪器的稳定电源，然后再开输液泵，柱箱。设置好色谱柱的最大保护柱压，进行排气工作，并确保流路时不会有气泡。而流速不可操之过急，应该从小到大一点点地加速，这样是为了更好地保护色谱柱。

5.1.3柱前维护

注意不要把溶剂瓶放在光线强烈的地方，尽量使用琥珀色的溶剂瓶放置。还可以在色谱柱前加上保护柱，从而避免色谱柱的污染，进而延长色谱柱的使用命。

5.1.4关机维护

5.1.4.1实验完成后，首先关闭检测器，保证灯的有效使用年限。

5.1.4.2没有盐缓冲溶液的流动相，(反相系统)用 85%~90%有机相+15%~10%水相冲洗系统和反相色谱柱。

5.1.4.3有盐缓冲溶液的流动相，(反相系统)用 85%~90%水相+15%~10%有机相冲洗系统和反相色谱柱(反相系统)30min，除去反相色谱柱与系统中的盐溶液，然后用85%~90%有机相+15%~10%水相冲洗系统和反相色谱柱30min。

5.1.4.4泵的流速应慢速减小到0时，才可以关闭泵和稳压器。反相系统用90％~95％有机相+10％~5％水相封存反相色谱柱。

5.1.5其他维护

流动相使用前必须过滤，不要使用多日存放的蒸馏水（易长菌）。流动相使用前必须进行脱气处理，可用超声波振荡10-15min。

5.2 定期维护

5.2.1 开机时，打开排气阀，100%水，泵流量5ml/min，若此时显示力>10bar，则应更换排气阀内过滤芯（过滤白头）。

5.2.2 根据使用情况定期更换柱前保护柱或者色谱柱。 5.2.3 每年根据实验情况安排工程师进行预防保养工作。

6.相关文件

《仪器说明书及Agilent化学工作者现场操作培训教材》

7.记录

《仪器设备使用记录表》

《仪器设备维护、维修记录表》