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结构特异性核酸内切酶FEN1及其与肿瘤的关系

结构特异性核酸内切酶FEN1及其与肿瘤的关系周婷;高婷婷;孙洪芳;潘飞燕;何凌峰;郭志刚【摘要】Flap endonuclease-1 ( FEN1 ) is a kind of structure-specific multifunctional nuclease which contains 5′->3′flap endonuclease( FEN) activity,gap endonuclease( GEN) activity and exonuclease( EXO) activity. The multiple nuclease activities of FEN1 allow it to participate in numerous DNA metabolic pathways,including Okazaki fragment maturation, long-patch base excision repair and telomere maintenance. As such,FEN1 must be precisely regulated to execute each of its functions with the right timing and in a specific subcellular location. FEN1 dysfunction will lead to genomic stability and integrity descend, and eventually induce a variety of chromosomal diseases including tumor. This review mainly targets FEN1’s functional regulation and its link to cancer.%FEN1是一种结构特异性的多功能核酸酶,具有5′->3′flap核酸内切酶( FEN)、缺口核酸内切酶( GEN)和核酸外切酶( EXO)三大酶切活力。

原核表达系统pET28a(+)中抗CD20微抗体的构建和表达

原核表达系统pET28a(+)中抗CD20微抗体的构建和表达李东霞;杨振;潘少坤;周楠楠;宋菲;曹祥荣【摘要】Objective The research aimed to construct anti-CD20 minibody containing VL,VH and CH3,and to explore the best inducing condition of its soluble protein expression.Method The recombinant minibody cDNA was produced by overlap PCR.A short peptide linker was used to join VL and VH.The human IgGl hinge region was used to join VH and CH3.The recombinant minibody gene was subcloned into the expression vector of pET28a and expressed in E.coli BL21.Result SDS-PAGE and Western blot analysis showed that the recombinant protein was about 41.88 kDa and the optimized soluble protein expression condition of minibody was 1.0 mmol/L IPTG for 24 h at 20℃ ,the inclusion bodies were found in the precipitation after sonication.The soluble protein minibody was further purified Ni-NTA affinity chro- matography,the yield up to 90.25% ,the highly purity recombinant protein was obtained after a series of steps including inclusion bodies cell lysis,denaturation,purfication and renaturation.Western blot proved that the recombinant protein anti-CD20 minibody had immunologicai reactive ability against rabbit anti-human IgG,and can specific binding CD20 antigen.The successful expressed of minibody in the prokaryotic expression system was helpful for the future study of its biological function and target therapy to the B lymphoid leukemia and B lymphoma.%目的:改造Rituximab,构建包含VL、VH和CH3的抗CD20微抗体minibody,并探索诱导其可溶性表达的最佳方法.方法:首先通过overlap PCR将Rituximab的VL和VH通过Linker连接在一起,成为单链抗体ScFv,再将ScFv和人源IgG1 CH3通过人源IgG1铰链区连成minibody的cDNA.将其克隆至表达载体pET28a(+)中,并在大肠杆菌中用IPTG诱导表达.结果:SDS-PAGE和Western blot结果表明,抗CD20的微抗体基因表达产物分子量约41.88 kDa,在20℃、1.0 mmol/L IPTG诱导24 h时minibody的可溶性表达量最大,同时还有包涵体形式的蛋白.可溶性抗体蛋白通过镍柱纯化,纯度达到90.25％,包涵体经过变、复性获得了高纯度的抗体蛋白.重组蛋白minibody可特异性地被兔抗人IgGl单克隆抗体识别,并且可特异性结合靶抗原CD20.结论:抗CD20微抗体minibody基因在此原核表达系统中成功表达,为其生物学功能和更好地针对B淋巴系统恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(035)003【总页数】7页(P74-80)【关键词】CD20;minibody;原核表达;大肠杆菌【作者】李东霞;杨振;潘少坤;周楠楠;宋菲;曹祥荣【作者单位】南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学生物技术重点实验室,江苏南京210046【正文语种】中文【中图分类】R394.4非霍奇金淋巴瘤(Non-hodgkin’s lym phoma，NHL)绝大多数来源于B细胞，是最常见的血液系统恶性肿瘤，也是威胁人类生命的十大恶性肿瘤之一.NHL还是我国目前发病率增长速度最快的血液系统恶性肿瘤［1］，每年约有3～4万人死于该病痪.NHL患者中，约85%～90%是B细胞淋巴瘤［2］.CD20是一种B细胞及B淋巴瘤细胞上广泛表达的抗原，它的作用尚未完全阐明，可能在B细胞生长、激活及钙通道形成和调节［3-4］中发挥某种功能，干细胞及髓系细胞表面无此抗原表达，故使用抗CD20抗体后不会出现明显的造血抑制现象［5］.因此研制抗CD20的单克隆抗体就可能专一性地杀伤B淋巴瘤细胞，达到更好的治疗效果. Rituximab(C2B8)是美国基因科技公司研发的，它是以人CD20分子为靶点的人、鼠嵌合型IgG1免疫球蛋白，通过转染相关基因到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)后表达得到的产物［6］.1997年，它被FDA批准用于治疗复发低度恶性或滤泡型淋巴瘤，也是第一个用于肿瘤治疗的抗体.由于其在非霍奇金淋巴瘤及一些自身免疫疾病的治疗中表现出较好的疗效和较低的毒副作用，C2B8已经成为美国销售额最大的抗肿瘤药物.然而，药物来源和治疗费用问题给患者带来了严重的负担，因此限制了其推广应用，针对此情况有必要探索新的抗体表达系统，并对抗体做适当的改造.Minibody是一个比较新的抗体改造形式，即抗体IgG轻链可变区(VL)、重链可变区(VH)和重链保守区(CH3)通过连接肽(Linker)和重链铰链区连接起来的单链抗体(VL-VH-CH3)，其具有中等分子量、且保留了抗体Fc受体，既能够有效地与抗原结合、介导ADCC，在体内的半衰期又相对于ScFv较长［7］，为此我们用基因工程的方法将Rituximab改造成抗CD20的minibody，并成功地在大肠杆菌中进行了构建和表达，这为更好地针对B淋巴系统恶性肿瘤的靶向治疗奠定了基础.大肠杆菌DH5α、质粒pUC19、携带抗CD20抗体重链和轻链cDNA片段的质粒pDC316-ATF均为本实验室保存;大肠菌BL21、质粒pET28a(+)由张双全老师馈赠;限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Pyrobest DNA Polymerase、DNA marker、Taq酶为TaKaRa公司产品;割胶纯化试剂盒及质粒提取试剂盒购自BioMIGA;His 纯化柱为GE Healthcare产物;兔抗人IgG1单克隆抗体购自博士德公司;氨苄青霉素、卡那霉素购自南京生兴生物科技公司;引物由上海生工合成.1.2.1 微抗体(minibody)cDNA的合成根据轻、重链可变区基因的酶切图谱及表达载体pET28a的酶切位点，设计并合成了用于VL、VH和CH3基因拼接的引物(表1 ).提取重组质粒pDC316-ATF，用SalⅠ+EcoRⅠ双酶切消化，得到717 bp和5028 bp 2个片段，以717 bp片段为模板、AT001/AT004为引物对，高保真酶扩增抗CD20抗体轻链可变区cDNA，即VL;以5 028 bp大片段为模板，分别以AT002/AT005、AT003/AT006为引物对，扩增出抗CD20抗体重链可变区cDNA和抗CD20抗体重链恒定区cDNA，即VH和CH3;分别纯化VL、VH和CH3 3个片段.以VL和VH为模板、AT001/AT005为引物对，高保真酶扩增ScFv片段，回收ScFv片段;以ScFv片段和CH3片段为模板、AT010/AT011为引物对，用高保真酶扩增出1 147 bp特异性条带，即为Rituximab改造的minibody的cDNA(也即CDMN).1.2.2 表达载体的构建用XbaⅠ+HindⅢ分别对纯化的PCR产物(CDMN)和测序质粒pUC19进行双酶切，割胶回收酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，在LB(Amp+)培养基中筛选培养，利用菌液电泳和PCR的方法鉴定，将重组阳性质粒送上海生工测序，并命名为pUC19-CDMN.用NdeⅠ和HindⅢ分别对表达载体pET28a(+)和携带抗CD20微抗体的测序质粒pUC19-CDMN进行双酶切，割胶回收酶切产物，在T4 DNA连接酶作用下连接.经Kan+抗性筛选，提取质粒，酶切鉴定，确定其为阳性重组质粒，命名为pET28a(+)-CDMN.1.2.3 重组基因的诱导表达及SDS-PAGE分析将重组质粒pET28a(+)-CDMN转入感受态细胞BL21中，涂在Kan+平板上，37℃过夜培养，挑取单克隆揺菌，按1%接菌，培养至OD=0.6～1.0，加入IPTG诱导.分别进行3组条件实验，先确定2个条件不变，探索重组蛋白的最优表达条件.设置IPTG浓度梯度为:0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L、1.5 mmol/L，时间梯度为12 h、24 h、36 h，温度梯度分别为:16℃、20℃、25℃，分别收集菌体，超声破碎，离心，上清和沉淀分别煮样，进行SDS-PAGE电泳.选取最适的温度、最佳时间点和IPTG浓度条件进行大量表达.1.2.4 蛋白的纯化和变复性将表达的200mL菌体重悬于20 mmol/L Tris-cl(pH=8.0)、174μg/mL PMSF中，超声破碎，13 000 rpm、4℃、6min离心，制备上清和沉淀，上清用镍柱进行纯化(步骤按说明书)，纯化后的蛋白于-20℃备用;沉淀用PBS进行重悬，超声破碎，6 000 rpm、20℃、20min离心，弃去上清，用10mL、2mol/L尿素重悬沉淀，同时加15μL TritonX-100，重悬8 min～10min，6 000 rpm、4℃、20min，如此重复5次，然后分别用4 mol/L、6mol/L尿素重悬沉淀，离心、弃上清，再用8mol/L尿素重悬沉淀，同时加15μL TritonX-100和DTT(二硫苏糖醇、1mmol/L)于4℃、30 h;6 000 rpm、4℃、20min离心，取上清，再加等体积的8 mmol/L尿素于透析袋中，将透析袋放入复性液I中复性，4℃透析复性30 h;6 000 rpm、4℃、20min离心，取上清，将透析袋放入复性液II中复性，4℃透析复性30 h;6 000 rpm、4℃、20min离心，取上清，将透析袋放入复性液III中复性，4℃透析复性3.5 h;6 000 rpm、4℃、20min离心，取上清，将透析袋放入复性液IV中复性，4℃透析复性过夜;6 000 rpm、4℃、20min离心，取上清，将透析袋放入复性液V中复性，4℃透析复性3 h，将透析袋中的液体进行浓缩，浓缩后取少量，测定蛋白的浓度，分装于合适的管中，置于-20℃中保存备用.1.2.5 Western blotting鉴定重组蛋白minibody的抗原性将纯化和变复性的蛋白样品于99℃煮5min，使蛋白变性，经SDS-PAGE电泳后，电转膜220 V、90min转移至PVDF膜上，封闭液封闭1 h，TBST洗涤3次，每次10min.与兔抗人IgG1单克隆抗体共同孵育2 h，TBST洗涤3次，每次10min，加入显色液TMB避光显色，观察并拍照.酶切质粒pDC316-ATF，获得大小分别为717 bp、5 028 bp的cDNA片段，以717 bp片段为模板、AT001/AT004为引物对，用高保真酶扩增出抗体的轻链cDNA片段，即VL;以5 028 bp片段为模板，分别以AT002/AT005、AT003/AT006为引物对扩增出抗体的重链可变区和恒定区的cDNA片段，即VH、CH3，纯化VL、VH、CH3 3个片段(如图1)，然后以VL、VH为模板、AT001/AT005为引物对，高保真酶扩增ScFv片段，回收此片段;再以ScFv片段、CH3为模板，以AT010/AT011为引物对，用高保真酶扩增出1 147 bp特异性条带，为Rituximab的cDNA(CDMN)，即minibody(如图2).纯化CDMN PCR产物和测序载体pUC19，进行双酶切，T4连接酶进行连接，经菌液电泳初筛，确定9#和13#为阳性克隆(如图4)，提取9#和13#重组质粒进行酶切鉴定，在1 128 bp处均有1个释放条带，可以确定为阳性质粒(如图5).将9#重组质粒送上海生工测序，并命名为pUC19-CDMN 9#，将pUC19-CDMN9#和表达载体pET28a(+)分别进行双酶切消化，割胶回收产物，用T4连接酶连接，经Kan+抗性筛选，提取质粒，酶切鉴定，确定其为阳性重组质粒，命名为pET28a(+)-CDMN(如图6、7).重组质粒pET28a(+)-CDMN在IPTG诱导后在42 kDa处有一重组蛋白条带.在不同浓度的IPTG诱导下发现，1.0 mmol/L时可溶性蛋白的表达量是较大的，然后分别在1.0mmol/L条件下探索最适的温度和时间点.通过设置不同的温度梯度、时间梯度、IPTG浓度梯度，发现在温度为20℃、IPTG浓度为1.0mmol/L、时间为24h时可溶性蛋白的表达量最高，同时还有包涵体蛋白的表达(如图8、9).在温度为20℃、IPTG浓度为1.0 mmol/L的条件下进行大量诱导，24 h收集200mL菌体，超声破碎，制备上清和沉淀，分别进行镍柱纯化和蛋白的变复性，SDSPAGE电泳.将上清中的可溶性蛋白进行镍柱纯化，取出200μL纯化后的蛋白、煮样，进行SDS-PAGE电泳.用软件分析蛋白胶测得6#、7#蛋白最终纯度分别为90.25%、63.33%(如图10);沉淀中的包涵体形式蛋白进行变复性，复性后取出200μL煮样、进行SDS-PAGE，条带非常的单一，最终纯度达到96%(如图11).将纯化的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，与辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG1单克隆抗体共同孵育，TMB避光显色，进行蛋白印记分析，结果显示在42 kDa处有一明显的蛋白条带，从而证明minibody重组蛋白在大肠杆菌中成功表达，同时也说明minibody重组蛋白具有抗原性.收集Jurkat、NAMALWA细胞蛋白样品，进行SDS-PAGE电泳，电转移至PVDF膜上，将纯化的抗体做为一抗，辣根过氧化物酶标记的兔抗人IgG1单克隆抗体为二抗，结果显示在35 kDa左右有一条明显的条带，阴性对照无条带，表明我们纯化的抗体有抗体的活性，且可与靶抗原特异性结合.随着分子生物学、免疫学等基础研究和试验技术的不断提高，新型抗CD20单克隆抗体的出现将成为今后治疗NHL最有效的药物［8］.应用基因工程抗体进行肿瘤免疫治疗是当前的研究热点之一，生物工程类抗体美罗华的临床应用为肿瘤的生物免疫治疗开创了新的局面，研究表明联合应用美罗华及化疗对于提高B-ALL和B细胞淋巴瘤(B-NHL)患者的临床预后效果明显［9］.对NHL单药治疗或联合化疗目前在世界范围被认为是最成功的生物治疗方式之一.然而由于药物来源和治疗费用问题，给患者带来严重的负担，因而也会限制其推广应用，针对此情况有必要探索新的抗体表达系统，并对抗体做适当的改造.原核表达系统早已成为成熟的表达系统，其操作简单、成本低廉，在抗体片段的表达中已经得到了广泛的使用［10］.然而原核表达系统也存在一些缺陷，大肠杆菌不能对外源蛋白进行糖基化修饰，同时表达的蛋白也多以包涵体的形式存在.本实验在Rituximab的基础上改造构建了minibody微抗体，它是包括鼠源的VL、VH，人的CH3及Linker和人源IgG1铰链区(如图3)，它比单链抗体多了CH3，因而minibody能介导ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用).Linker序列是由重复的4个甘氨酸和1个丝氨酸构成的15个氨基酸序列的短肽，其中甘氨酸是分子量最小、侧链最短的氨基酸，可增加侧链的柔性;丝氨酸是亲水性最强的氨基酸，可增加其亲水性［9］;铰链区包括H链间二硫键，该区富含脯氨酸、不形成a-螺旋、易发生伸展及一定程度的转动，当VL、VH与抗原结合时此处发生扭曲，使抗体上的抗原结合位点更好地与抗原决定簇互补，由于CH3构型发生变化，活化补体结合组织细胞，介导ADCC.本研究采用了(GlySer4)3作为弹性连接短肽，包涵体经复性及透析后所得的minibody微抗体表现出良好的稳定性.本文采用了pET28a表达载体进行诱导表达，其多克隆位点的上游有一个能编码6×His-Tag序列，可与下游的表达序列形成融合蛋白，它通常不影响表达产物的生物学活性，因此不必通过酶水解来获得目的蛋白.同时该序列可作为蛋白标签用于目的蛋白的纯化和检测［9］.由于蛋白的变复性较麻烦，且变复性后蛋白的活性有可能受到影响，所以我们设置温度梯度、时间梯度和IPTG浓度梯度摸索表达可溶性蛋白的最适条件.通过研究发现，在温度为20℃、IPTG为1.0mmol/L、时间为24 h时minibody的可溶性蛋白表达量最大，同时也有包涵体形式的蛋白.上清中的可溶性蛋白足以做蛋白纯化，经过镍柱纯化后获得高纯度的minibody微抗体，纯化后蛋白浓度为643μg/mL.包涵体蛋白进行变复性处理后蛋白浓度为150μg/mL，相比上清中的可溶性蛋白浓度要小，所以诱导蛋白可溶性表达是一个可行的办法.Western blot结果进一步表明，重组蛋白在大肠杆菌中被成功诱导可溶性表达，并且纯化的重组蛋白具有抗体的活性，能与靶抗原特异性结合，而变复性的重组蛋白没有抗体活性.综上所述，我们成功构建和诱导可溶性表达了抗CD20微抗体minibody，为下一步进行minibody生物学功能的研究提供了前提，进而为B淋巴瘤和自身免疫疾病的免疫诊断、治疗奠定了基础.【相关文献】［1］Jemal A，Siegel R，Ward E，et al.Cancer statistics［J］.CA Cancer JClin，2008，58(2):71-96.［2］师明磊，胡显文，陈惠鹏，等.抗CD20嵌合抗体的表达与活性鉴定［J］.中国生物工程杂志，2005，25(7):34-39.［3］Riley JK，Sliwkowski M X.CD20:a gene in search of a function［J］.Semin Oncol，2000，27(6 Suppl 12):17-24.［4］Du J，Wang H，Zhong C，etal.Structuralbasis for recognition of CD20 by therapeutic antibody Rituximab［J］.JBiol Chem，2007，282(20):15 073-15 080.［5］赵江宁，朱雅丽.抗CD20单克隆抗体-Rituximab［J］.白血病.淋巴瘤，2004，13(2):123-125.［6］John R G，Steven SH，Jeffrey TR，et al.An afucosylated anti-CD20 monoclonal antibody with greater antibody-dependent cellular cytotoxicity and B-cell depletion and lower complement-dependent cytotoxicity than rituximab［J］.Molecular Immunology，2012，50(3):134-141.［7］Hu SZ，Lousise S，Andrew R，et al.Minibody:A novel engineered anti-carcinoembryonic antigen antibody fragment(single-chain Fv-CH3)which exhibits rapid，high-level targeting of xenografts［J］.Cancer Res，1996，56(13):3 055-3 061.［8］温宁笑，袁红梅.非霍奇金淋巴瘤单克隆抗体治疗的研究进展［J］.现代诊断与治疗，2010，21(4):221-223.［9］陈森，饶青，王健祥，等.抗人CD19单链抗体基因的构建、表达及功能测定［J］.生物工程学报，2005，21(5):686-691.［10］Verma R，Boleti E，George A J.Antibody engineering:comparison of bacterial，yeast，insect and mammalian expression systems［J］.J Immunol Methods，1998，216(1/2):165-181.。

对高中生物学教材中物种定义的比较及评述

对高中生物学教材中物种定义的比较及评述王鹤颖张敏韩娜周长发*（南京师范大学生命科学学院南京210023）摘要本文对我国大陆4种高中生物学教材对物种的定义进行了辨析比较，并对它们在统一性、科学性和适用性上进行了评述。

关键词物种定义高中教材生物学物种是生物学中的重要概念，也是很难定义的概念$我国现行多种高中生物学教材中关于物种的定义明确而醒目，但相互间差别较大，科学性似乎也有不足,出处更是无法考证,给师生准确理解与讲授带来一定的困扰，有必要进行辨析与评述。

1人教版高中教材对物种的定义及评述人教版生物学教材必修2.遗传与进化》中对物种的定义如下:“在遗传学和进化论的研究中,把能够在自然状态下相互交配并且产生可育后代的一群生物称为一个物种。

也就是说,不同物种之间一般是不能相互交配的,即使交配成功，也不能产生可育的后代,这种现象叫做生殖隔离。

”可见，此定义把“生殖隔离”作为判断物种的标准。

这其实就是Mayr［1］提出的生物学物种定义：物种是可实际或潜在交配繁殖的自然种群组合，它们同其他这样的群体在生殖上是隔离的。

针对生物学物种定义有诸多批评［2］,主要是认为它不适用于无性繁殖的生物以及古生物等。

同时,本定义中只有一个“生殖隔离”指标，没有其他如形态学指标,故在实际分类中不太适用。

2浙科版高中教材对物种的定义及评述浙科版生物学教材必修2.遗传与进化》对物种的定义为：“物种是生物分类的基本单位，也是一种自然的类群$同种个体之间能互相交配并产生有生育能力的后代，不同种的个体之间则不能互相交配，或者在交配后不能产生有生育能力的后代,它们彼此之间存在着生殖隔离。

”本定义中的“分类单位、自然类群、生殖隔离”等词汇其出处和准确含义不好理解。

它似乎脱胎于陈世骧先生提出的“三单元论的物种定义”⑶：“物种是繁殖单元，由又连续又间断的居群（即种群）所组成;物种是进化单元，是生物系统线上的基本环节,是分类的基本单元$”3北师大高中教材对物种的定义及评述北师大版高中生物学教材必修2.遗传与进化》对物种的定义是:“生物学上的物种概念以生殖隔离为基础，同一物种生物个体之间可以自由地交配，并能产生有生育能力的后代，而无法与其他物种进行交配。

物种敏感度分布法（SSD）在农药水质基准推导中的应用

物种敏感度分布法（SSD）在农药水质基准推导中的应用梁霞;周军英;李建宏;王香兰;宋宁慧;单正军【摘要】Deriving methods play an important role in water quality criteria derivation. Species sensitivity distributions ( SSD) is a common method used to derive water quality criteria in the world. A number of models are available to derive water quality criteria, but not all the models could wellfit the toxicity data sets of pesticides. In order to select some mod⁃els that fit with high goodness, 4 typical pesticides were selected in the study to compare the models in goodness of fit. Re⁃sults show that sigmoid, Gaussian,Gompertz and exponential growth were better than the other models in fitting curve tend⁃ency, rationality of HC5 and goodness of fit. Therefore it is suggested that when utilizing SSD to derive criteria forpesti⁃cides, sigmoid, Gaussian, Gompertz and exponential growth should be used to get fitting curves first, and then the most optimal model should be chosen to determine benchmark values for the water quality criteria, so as to ensure scientificity of the derivation of the water quality criteria. The findings can serve as scientific references for selection of derivation methods for formulation of water quality criteria for pesticides.%水质基准推导方法在水质基准制定中起着至关重要的作用，物种敏感度分布法是目前国际上常用的基准推导方法，但利用此方法推导水质基准时，可选用的模型很多，但并不是所有的模型都能很好地拟合农药毒性数据集。

槲皮素对香烟烟雾提取物诱导的人支气管上皮细胞死亡的抑制效应

槲皮素对香烟烟雾提取物诱导的人支气管上皮细胞死亡的抑制效应王莉娟;龚涛;王丽;李粉;杨星昊;李朝军;陈华群【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2009(25)7【摘要】目的研究槲皮索对香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract,CSE)诱导的人支气管上皮细胞死亡的影响,并初步探讨其机制.方法槲皮素预处理人支气管上皮细胞(Beas-2b)16 h,然后以CSE刺激不同时间,倒置显微镜下观察细胞形态,以四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)及Western blot分别检测细胞活力和血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白的表达.结果槲皮素明显减少了CSE诱导的Beas-2b细胞死亡,并对CSE处理后细胞活力的降低具有明显的抑制作用;槲皮素还明显提高了CSE诱导的Beas-2b细胞中HO-1的蛋白表达水平,且呈浓度依赖性.结论槲皮素对于CSE诱导的人支气管上皮细胞死亡具有明显的抑制作用,其机制可能是通过提高细胞中CSE诱导的HO-1蛋白表达水平.【总页数】4页(P960-963)【作者】王莉娟;龚涛;王丽;李粉;杨星昊;李朝军;陈华群【作者单位】南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学重点实验室,江苏,南京,210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学重点实验室,江苏,南京,210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学重点实验室,江苏,南京,210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学重点实验室,江苏,南京,210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学重点实验室,江苏,南京,210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学重点实验室,江苏,南京,210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省分子医学重点实验室,江苏,南京,210046【正文语种】中文【中图分类】R284.1;R322.34;R329.2;R329.25;R562.210.22【相关文献】1.Nrf2对香烟烟雾提取物诱导的人支气管上皮细胞中IK K s表达的影响 [J], 李秀英;张卫东;江刚2.辛伐他汀对香烟烟雾提取物诱导的人脐静脉内皮细胞表达sEPCR和mEPCR的影响 [J], 樊芳芳;胡晓芸;扈丽娟;韩葆芬;赵瑛娟3.AMPK在香烟烟雾提取物诱导的支气管上皮细胞凋亡中的调节作用 [J], 谢旺;罗百灵;张立;郭现玲4.异钩藤碱上调miR-192-5p对TNF-α诱导的人支气管上皮细胞凋亡和炎症因子释放的作用及其机制 [J], 侯从岭;芦晓帆;雷小婷;李彬;赵润杨5.冬虫夏草调控PERK-eIF2α信号通路抑制香烟烟雾提取物刺激下的人支气管上皮细胞凋亡研究 [J], 刘玉;谢纬;祝庆华;李敏芳;唐明文;陈生因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

太湖冬季军团菌_Legionellaspp__的分布和多样性

第32卷第7期2011年7月环境科学ENVIRONMENTAL SCIENCEVol．32，No．7Jul．，2011太湖冬季军团菌（Legionella spp．）的分布和多样性王娜1，2，邢鹏1*，吴庆龙1，余多慰2（1.中国科学院南京地理与湖泊研究所湖泊与环境国家重点实验室，南京210008；2.南京师范大学生命科学学院，南京210046）摘要：军团菌（Legionella spp．）广泛存在于各种水体中，对人类的健康造成了一定的安全隐患．为了解太湖在冬季是否存在军团菌，以及它的分布和多样性，本研究于2010年2月，在全太湖32个点位采样，使用巢式PCR 对样品中军团菌进行检测，并用变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel eletrophoresis ，DGGE ）及对典型条带切胶测序来分析军团菌的基因多样性．结果表明，太湖32个位点中，附着细菌和浮游细菌分别有21个点和11个点检出军团菌，检出率分别为65.63%和34.38%．附着细菌和浮游细菌DGGE 图谱中，特异性条带分别有40个和36个．不同湖区的种群特征参数显示轻度富营养化湖区的军团菌种群多样性高于中度富营养化湖区．典型条带切胶回收测序共获得34个序列，以97%相似度为依据可划分为12个OTUs．切胶条带中3个序列与2种致病军团菌Legionella feeleii 和Legionella longbeachae 亲缘关系很近，表明太湖中这些潜在致病菌的存在对湖区人民健康存在一定风险．关键词：军团菌；太湖；DGGE ；分布；基因多样性；富营养化中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：0250-3301（2011）07-2125-07收稿日期：2010-09-23；修订日期：2010-11-01基金项目：国家重点基础研究发展规划（973）项目（2008CB418104）；中国科学院知识创新工程重大项目（KZCX1-YW-14-1）；中国科学院知识创新工程方向性项目（KZCX2-YW-JC302）；江苏省人才攀登计划项目（BK2009024）作者简介：王娜（1985 ），女，硕士研究生，主要研究方向为环境微生物，E-mail ：wangnajijicao@163．com *通讯联系人，E-mail ：pxing@niglas．ac．cnDistribution and Diversity of Legionella spp．in Lake Taihu in the WinterWANG Na 1，2，XING Peng 1，WU Qing-long 1，YU Duo-wei 2（1.State Key Laboratory of Lake Science and Environment ，Nanjing Institute of Geograghy and Limnology ，Chinese Academy of Sciences ，Nanjing 210008，China ；2.Colloge of Life Science ，Nanjing Normal University ，Nanjing 210046，China ）Abstract ：The Legionella spp．are ubiquitous in aquatic environment and could cause certain risks on human health．In order to investigate the distribution and diversity of Legionella spp．in Lake Taihu during winter time ，water samples were collected from 32sites of the whole lake in February 2010.The presence of Legionella spp．was screened by nested-PCR and their phylogenetic diversity was determined by denaturing gradient gel electrophorese （DGGE ）and sequencing analysis of excised DGGE bands．The Legionella spp．was detected from 21out of 32sites in particle-associated bacterial samples and 11out of 32sites in free-living bacterial samples ，which accounted for 65.63%and 34.38%of each type of bacteria ，respectively．In total ，40and 36unique bands were identified among those particle-associated and free-living bacterial DGGE profiles ，respectively．Community characteristic indices of different euthrophic areas showed that the diversity of Legionella spp．in mild eutrophic areas was higher than that in the moderate eutrophic areas．In total ，thirty-four DGGE bands were excised and sequenced ，which could be classified into 12OTUs by 97%similarity．Among all the sequences ，three showed a high similarity with two pathogenic Legionella species Legionella feeleii and Legionella longbeachae ．This revealed potential healthy risks to the people lived around the Lake Taihu．Key words ：Legionella spp．；Lake Taihu ；DGGE ；distribution ；phylogenetic diversity ；eutrophication军团菌（Legionella spp．）是一种革兰氏阴性菌，它是肺炎型军团病（Legionnaires'disease ）和非肺炎型庞蒂亚克热（Pontiac fever ）的病原体［1］．人们通常是由于呼吸了被军团菌污染的水源散发的水雾而感染上军团病．到目前为止，已发现的军团菌有50多个种，其中近一半与人类疾病有关［2，3］．有关军团菌的研究主要集中在人工供水系统，如冷却塔、污水处理厂、配水系统等，以及对感染军团病病人血清的分析，对自然环境水体中军团菌的分布和多样性研究相对较少［2］．太湖是我国第三大淡水湖泊，面积约2338km 2，平均水深1.9m ，是一个典型的浅水湖泊．流域内城市化发展和生活水平的提高导致湖泊水质逐年下降，呈现严重的水体富营养化特征，蓝藻水华暴发的规模和频率不断增加．越来越多的证据表明，水体富营养化对致病微生物造成重要影响，从而引起疾病风险的增加［4，5］．但目前对于太湖中是否有军团菌这类致病微生物的存在，军团菌的种类组成和分布状况，以及富营养化与军团菌的关系还鲜见报道．此外，已有研究显示军团菌对环境条件（如温度、pH 、盐度等）的适应范围很广，甚至在南极半岛这样寒冷的环境中，也检测到军团菌的存环境科学32卷在［6，7］．太湖冬季是否也有军团菌的分布值得研究．军团菌在环境中的存在主要有4种形式：自由生活的浮游细菌，营自由生活阿米巴虫的胞内寄生物，栖息在复合共同体的生物膜上（附着状态），以及活的非可培养的细菌［8 10］．水体中存在浮游细菌和附着细菌，军团菌在2类不同生活状态细菌中的种类是否存在差异，也鲜见相关报道．传统的环境水体中军团菌检测方法是分离培养，但具有一定的缺陷［11，12］，因此很多研究人员开始采用灵敏度更高的分子生物学方法来研究环境样品中的军团菌［2，13］．本研究运用巢式PCR方法对大型浅水湖泊太湖进行了全湖检测，分析了军团菌在冬季太湖中的分布情况，并通过指纹图谱技术DGGE以及对DGGE典型特异条带进行切胶回收、测序等方法，探讨了太湖中2种不同生活状态的军团菌的基因多样性，并比较了不同富营养化湖区的种群多样性．本研究的开展对于了解太湖是否存在潜在的健康风险以及探讨富营养化与军团菌的关系具有重要的意义．1材料与方法1.1样品的采集及处理全太湖32个位点，根据太湖流域省界水体水资源质量状况通报（2010年2月），0、9、15号为五里湖，1、3、4、5、6、32号为梅梁湖，16、17号为竺山湖，13、14、31号为贡湖，12、24、25号为东太湖，7、8、18、19、21号为湖心区，10、20号为西部沿岸区，26、27、28、29、30号为东部沿岸区，11、22、23号为南部沿岸区（见图1），其中除了五里湖水质Ⅳ类、东太湖水质Ⅴ类，其他湖区均为劣于Ⅴ类，除五里湖、湖心区、东部沿岸区、南部沿岸区为轻度富营养化，其它湖区均为中度富营养化．因此，本研究于2010-02-21在全太湖9个湖区的32个点采集样品，水样取自水面以下10、30和50cm，混合均匀后，置于低温下避光保存．样品采完后，立即进行处理．每个位点取120mL水样经超声波处理后，经孔径为100μm的浮游生物滤网（150目）过滤去除大型浮游动物．滤液再经过超声波处理，将滤液负压过滤到孔径为5μm聚碳酸酯膜上（Millipore USA）（即附着细菌样品），最后将滤液负压过滤到孔径为0.2μm的聚碳酸酯膜上（Millipore USA）（即浮游细菌样品）［14］，将滤膜放置于无菌的2mL离心管中保存于－70ħ冰箱中．滤膜将分别用于附着细菌和浮游细菌基因组DNA的提取．图1太湖采样点分布示意Fig．1Schematic of the distribution of sampling sites1.2巢式PCR检测军团菌的存在1.2.1DNA提取本研究采取CTAB法提取DNA．样品基因组的提取及纯化方法参照文献［15］．通过测定提取的DNA在260nm及280nm的吸光度值确定其DNA 的含量以及纯度．提取的基因组DNA置于－20ħ保存．1.2.2巢式PCRPCR扩增方案如表1所示．25μL扩增体系包括1ˑPCR缓冲液（200mmol/L的Tris-HCl pH8.3，200mmol/L KCl）、1.5mmol/L MgCl2、0.2mmol/L 的dNTP、20pmol/L引物、1.5U的Taq DNA聚合酶．取5μL扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶，于1ˑTAE Buffer中电泳，在紫外灯下观察结果并拍照．所有样品经过巢式PCR检测，3次重复，以巢式PCR第二步有扩增为检测阳性，3次扩增中任意一次有扩增均为检测阳性．1.3分析军团菌属种群多样性1.3.1PCR-DGGE在上述巢式PCR第二对引物的上游引物LEG448的5'端加上40bp的GC夹［17］，进行PCR 扩增．PCR体系及扩增程序同上．采用美国CBS公司电泳仪（DGGE-2001）进行变性梯度凝胶电泳．使用梯度混合器制作浓度6%的聚丙烯酰胺变性胶，选用的变性剂梯度为45% 65%（100%变性剂含有7mol/L尿素和体积分数40%去离子甲酰胺）．电泳缓冲液为1ˑTAE（20mmol/L Tris，10 mmol/L acetate，0.5mmol/L EDTA，pH8.0）．60ħ，恒压100V，电泳16 18h．电泳结束后，62127期王娜等：太湖冬季军团菌（Legionella spp．）的分布和多样性DGGE胶采用SYBR GREENⅠ（1ʒ10000稀释，Molecular Probe Inc．）染色15 30min，Bio-Rad全自动多功能凝胶成像分析系统拍照．1.3.2切胶测序选取特异性条带手动切胶，用冻融法提出DNA，进行PCR扩增，并用DGGE确认扩增结果与切胶迁移位置是否一致，确认后用不带GC夹引物LEG448和LEG858重新进行PCR扩增并纯化，委托上海英骏生物科技有限公司（Invitrogen）测序．获得的序列，用Chimera Check（http：//rda8.cme．msu．edu/cgis/chimera．cgi？su=SSU，16S rRNA）软件检验，排除可能的嵌合体．利用DOTUR［18］比较序列，将操作分类单元（operational taxonamic unit，OTU）定义为相似性差异≤3%的序列群．通过BLAST工具（http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/BLAST/）在GenBank数据库中进行相似性比较，获取同源性较高的相关菌株的16S rDNA序列．采用MEGA4.0软件构建系统进化树（邻接法，1000次抽样bootstrap 检验）．1.3.3统计分析采用GelComparⅡ软件（Applied Maths，USA）对DGGE电泳照片进行分析，以每个条带在样品中的相对含量生成矩阵，对含量低于1%的条带不计．分别计算附着军团菌种群的Shannon-Wiener指数（H'）、Simpson指数（D）和Pielou指数（J）［19］，其中Shannon-Wiener指数受物种丰富度影响较大，Simpson指数较多地反映了物种的优势度，Pielou指数则是物种均一性的度量．计算公式如下所示．H'=－Σni=1Piln PiD=Σni=1P2iJ=H'/ln S式中，n表示每个样品中检测到的条带数，S表示DGGE检测到的不同条带的总和，Pi表示样品中各个条带的灰度占样品总灰度的百分含量．1.3.4序列登录号本研究所获得的浮游军团菌和附着军团菌的16S rRNA基因序列在GenBank中的登录号分别是HQ230453 HQ230466和HQ230467 HQ230486．表1PCR扩增方案Table1Primers and PCR programs for amplification of16S rRNA gene of Legionella项目引物引物序列（5'-3'）片段长度/bp热循环条件文献巢式PCR 第一步LEG225R907AAGATTAGCCTGCGTCCGATCCGTCAATTCCTTTGAGTTT70095ħ90s-95ħ10s，54ħ1min，72ħ1min，35次循环-72ħ10min［13］［16］巢式PCR 第二步LEG448LEG858GAGGGTTGATAGGTTAAGAGCGTCAACTTATCGCGTTTGCT46095ħ90s-94ħ10s，60ħ1min，72ħ1min，30次循环-72ħ10min［13］DGGEGC LEG448LEG858CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGAGGGTTGATAGGTTAAGAGCGTCAACTTATCGCGTTTGCT50095ħ90s-94ħ10s，60ħ1min，72ħ1min，30次循环-72ħ10min［13］［17］2结果与分析2.1巢式PCR检测军团菌在全太湖中分布用巢式PCR对全太湖32个位点进行检测，附着样品中检出军团菌位点为：3、4、5、6、7、8、11、12、13、16、17、18、21、22、23、25、26、27、28、31和32号，共21个位点，检出率为65.63%．而浮游样品中检出军团菌位点为：3、4、5、8、10、11、12、13、17、18和27号，共11个位点，检出率为34.38%．军团菌在太湖中的分布如图2所示．可以看出，除五里湖没有检测出军团菌外，其它湖区均有军团菌检测出来．附着样品中检出率高的湖区为：梅梁湖、竺山湖、贡湖等北部湖区以及湖心区和南部沿岸区，而浮游样品检出率高的湖区则为：梅梁湖和西部沿岸区（表2）．2.2DGGE结合测序分析军团菌种群的基因组成及多样性根据DNA在变性胶中电泳的迁移位置，附着样品中共检测到40个不同的条带，平均每个样品具有7.5个条带（表3），浮游样品中共检测到36种不同的条带，平均每个样品具有8.8个条带，表明在太湖中军团菌具有一定的基因多样性．此外，各个样品的条带在数量和位置上均有差异（图3），说明军团菌种群的主要基因型存在空间变化．根据太湖流域省界水体水资源质量状况通报（2010年2月），中度富营养化湖区包括梅梁湖、竺山湖、贡湖、东太湖和西湖沿岸区），轻度富营养化湖区包括五里湖、湖心区、东部及南部沿岸区．不同湖区的种群特征参数7212环境科学32卷图2军团菌在太湖中的分布示意Fig．2Schematic of the distribution of Legionella in LakeTaihuM ：100bp ladder图3附着样品和浮游样品中军团菌的DGGE 图谱Fig．3DGGE profiling of samples ：particle-assaciated bacteria samples and free-living bacteria samples表2军团菌在各个湖区的检出率Table 2Relevance rates of Legionella in different areas 项目五里湖梅梁湖竺山湖贡湖东太湖湖心区东部沿岸区西部沿岸区南部沿岸区合计位点数36233552332附着样品检出位点数05222430321检出率/%083.3310066.6766.678060010065.63浮游样品检出位点数03011211111检出率/%5033.3333.3340205033.3334.38（表3）显示轻度富营养化湖区多样性高于中度富营养化湖区．分别挑选附着样品和浮游样品DGGE 图谱上特异性条带20条和14条，分别标记fl1 fl14和pa1 pa20，重新进行PCR ，PCR 产物纯化后测序，共获得34个序列，通过与GenBank 中已知序列对比，82127期王娜等：太湖冬季军团菌（Legionella spp．）的分布和多样性图4附着样品和浮游样品切胶测序结果建立的16S rDNA 系列的系统进化树Fig．4phylogenetic tree of Legionella from excised DGGE bands in Lake Taihu构建细菌的16S rDNA 的系统进化树（图4）．可以看出，所有切胶序列均属于Legionel spp ．．以97%相似度为依据，获得的序列可划分为12个OTUs ，其中附着军团菌与浮游军团菌共有的OTUs 有7个，附着军团菌独有的OTUs 有3个，浮游军团菌独有的OTUs 有2个．表3不同富营养化水平湖区的种群特征参数Table 3Community characteristic indices of different areas项目中度富营养化湖区平均值（范围）轻度富营养化湖区平均值（范围）DGGE 条带数 6.80（5 10）8.18（4 14）Shannon-Wiener 指数 1.70（1.40 2.23） 1.75（1.41 2.44）Simpson 指数0.21（0.12 0.27）0.21（0.09 0.35）Pielou 指数0.46（0.38 0.52）0.48（0.33 0.57）使用PCR-DGGE 及切胶测序的分子生物学手段对太湖中军团菌的种群结构进行研究，结果表明，太湖中存在的军团菌种类主要为uncultured Legionella spp．、L．donaldsonii 、Legionella feeleii 、Legionellayabuuchiae 、Legionellalongbeachae 、L．worsliensis 、L．quateirensis 等．附着样品中序列pa10与L．donaldsonii 和Legionella feeleii 相似性均为99%．L．donaldsonii 在台湾废水处理厂是占主要优势的军团菌属［20］，而Legionella feeleii 是一种能引起Pontiac fever 的致病军团菌［21］．序列pa19与Legionella yabuuchiae 相似性为96%，Legionella yabuuchiae 为2007年在日本新发现的军团菌种［22］．浮游样品DGGE 切胶序列fl13和fl14序列与9212环境科学32卷Legionella longbeachae相似性分别为99%和98%，Legionella longbeachae由Eitrem等［23］1987年发现，它能引起肺炎和急性胰腺炎．3讨论本研究首次对太湖冬季军团菌的分布状况进行了分析，各个湖区存在军团菌的风险不同，附着样品检出率为65.63%，附着军团菌主要分布于梅梁湖、竺山湖、贡湖等北部湖区以及湖心区和南部沿岸区．浮游样品检出率为34.38%，浮游军团菌主要分布于梅梁湖和西部沿岸区．这些检出军团菌的湖区水质均为劣于Ⅴ类，而水质为Ⅳ类的五里湖（0、9和15号）没有检测出军团菌．检出率高的湖区大部分是富营养程度较重的湖区，可以推测，富营养化程度的加剧，能增加军团菌的检出概率．而对不同富营养化湖区的种群特征常数进行分析显示，轻度富营养化湖区的军团菌种群多样性高于中度富营养化湖区．Johnson等［24］认为低至中等富营养化程度会增加物种丰富度，而高富营养化程度会减少物种丰度．笔者推测，富营养化一定程度上的加剧，降低了军团菌的物种丰度．从太湖中主要存在的军团菌种类可以看出，太湖中有Legionella feeleii和Legionella longbeachae这2种致病军团菌．现已发现的肺炎型军团病约90%是由L．pneumophila引起的［2］，而在太湖冬季水样中没有检测出L．pneumophila，这可能是因为采样时水温比较低，未达到L．pneumophila的最适生长温度［2，25］．由此可以推断太湖中存在致病军团菌的风险比较小．太湖中检测出的军团菌种类与其它湖泊的报道存在差异．在荷兰、南极半岛、台湾等地的湖泊中大多存在着L．pneumophila、Legionella-like amoebal pathogens（LLAPs）、L．lytica、L．erythra、L．worsliensis、L．quateirensis等军团菌［4，5，20］．Wu等［26］认为同一属的细菌在不同生境中的群落结构差异显著．所以不同生境内的军团菌存在显著差异．并且LLAPs需要与阿米巴等原生动物寄主共培养后才能分离出来［2，5］，而本研究中仅通过非培养的分子生物学方法，主要涉及军团菌的2种生活状态———浮游状态和附着状态，不利于LLAPs的检测．此外，对不同生活状态（附着状态和浮游状态）的军团菌的研究，获得的OTUs和军团菌种类大部分相同．附着军团菌和浮游军团菌共有的OTUs为7个，共有的军团菌种类为uncultured Legionella spp．，附着军团菌独有的OTUs有3个，种类为uncultured Legionella spp．和L．donaldsonii或Legionella feeleii，浮游军团菌独有的OTUs有2个，种类为Legionella yabuuchiae和Legionella longbeachae，可见在太湖中，除了少数的已知军团菌种属，附着军团菌和浮游军团菌的相似性比较高．4结论太湖冬季存在军团菌且具有一定的多样性．附着样品和浮游样品检出军团菌的概率分别为65.63%和34.38%．轻度富营养化的湖区的军团菌种群多样性高于中度富营养化湖区军团菌的种群多样性．对DGGE典型条带切胶测序结果显示，太湖中存在Legionella feeleii和Legionella longbeachae这2种致病军团菌，这些潜在致病菌的存在对湖区人民健康存在潜在影响．致谢：感谢中国科学院太湖湖泊生态系统研究站协助采样．参考文献：［1］Nazarian E J，Bopp D 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143抑制LPS诱导的细胞炎症反应

143抑制LPS诱导的细胞炎症反应张广芹;马梦娇;于晓璐;温传俊【摘要】机体异常炎症反应与各种疾病的发生息息相关.实验室通过前期工作,筛选出抗炎效果较好的化合物,并将其命名为143.通过LPS诱导RAW264.7细胞和BV2细胞作为炎症细胞模型,用不同浓度的143处理细胞,观察其抗炎效应.用MTS 检测不同浓度143对细胞活力的影响,NO试剂盒检测细胞培养上清NO含量的变化,Western blot检测NF-κB p-p65、iNOS、COX-2蛋白的表达情况.结果显示,143在浓度小于10μmol/L时对两种细胞活力没有影响;143在浓度为10μmol/L时能显著抑制细胞上清中NO的含量,并显著抑制细胞中炎症相关蛋白因子NF-κB p-p65、iNOS、COX-2的表达.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(042)001【总页数】7页(P95-101)【关键词】143;炎症反应;iNOS;COX-2;NF-κB【作者】张广芹;马梦娇;于晓璐;温传俊【作者单位】南京师范大学生命科学学院,分子细胞生物学研究所,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,分子细胞生物学研究所,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,分子细胞生物学研究所,江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院,分子细胞生物学研究所,江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】Q291炎症反应对机体来说是一把双刃剑.炎症反应是机体常见的一种抵御外界不良致病因子的一种反应.但是,过度的炎症反应是一些疾病的发病基础,如在一些自身免疫性疾病以及神经系统病变的疾病中,炎性相关因子的表达都上升.此外,有研究表明,外周炎症也能通过一定的途径引起中枢神经系统的炎症[1].因此,寻找可以抑制过度炎症反应的药物及其可能的作用机制对于临床上炎症相关疾病的治疗具有重要意义. 本实验室通过前期工作,筛选出一种抗炎效果较好的化合物,并命名为143(图1),通过研究发现143可以通过抑制炎症信号通路中核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)的表达来抑制细胞炎症,此外,其下游相关的炎性蛋白表达也降低,进而推测143在细胞炎症的治疗方面可能具有一定的作用.研究以小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)和小鼠小胶质细胞(BV2)作为实验细胞,体外用LPS诱导这两种细胞来分别模拟外周炎症和中枢神经系统炎症,研究143对LPS 诱导的细胞炎症的作用.1 材料和方法1.1 实验材料合成的化合物143,纯度大于98%,将其粉末形式溶于DMSO中,浓度为10 mmol/L,并在-20 ℃下保存;高糖DMEM和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自美国Gibco生物公司;100 U/mL青霉素(penicillin)、100 U/mL链霉素(Streptomycin)和含0.25%的EDTA胰蛋白酶购自维森特公司;RIPA裂解液和Acr-Bis购自凯基生物科技有限公司;P-p65、iNOS、COX-2抗体购自CST公司;β-actin抗体购自迅贝生物科技有限公司;ECL发光液、二抗(兔抗)购自Biosharp公司;MTS购自Promega公司.小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)和小鼠小胶质细胞(BV2)为本实验室保存.1.2 实验方法1.2.1 RAW264.7和BV2细胞培养及分组将冻存的细胞株快速复苏至含有适量培养基(含10%胎牛血清和1%双抗的高糖DMEM完全培养基)的培养皿中并轻轻混匀细胞.置于含有5%的二氧化碳、37 ℃培养箱中培养.待细胞贴壁后,PBS清洗换掉含有DMSO的培养基,此后每2 d换一次培养液.当细胞密度达到80%左右,用1 mL 0.25%胰蛋白酶(含EDTA)进行消化传代.细胞分组:分别接种RAW264.7以及BV2细胞于6孔板中,预培养后将细胞分组处理.①对照组:细胞不做任何处理,用0 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L浓度的143处理细胞20 h;②实验组:用0 μmol/L、3 μmol/L、10 μmol/L浓度的143预处理细胞1 h,之后用2 μg/mL的LPS持续刺激细胞共同作用细胞20 h.1.2.2 MTS检测细胞增殖取对数期的细胞消化后均匀地接种于96孔板中;设置不同浓度梯度,每个浓度设置5个复孔,每孔加入100 μL培养基,置于细胞培养箱中培养48 h后,将板内培养基吸走,用PBS清洗一遍,每孔加入100 μL培养基和20 μL MTS/PMS混合液(MTS∶PMS=20∶3,现配现用),继续培养3 h,将板子置于酶标仪上在490 nm处检测各孔的吸光值(OD值).1.2.3 上清NO含量检测分别取对数生长期的RAW264.7细胞和BV2细胞接种于6孔板,细胞分组及处理方法同1.2.1,细胞培养结束后收集上清,按照NO检测试剂盒说明书进行操作来检测NO的释放情况,酶标仪540 nm测定吸光度.1.2.4 Western blot检测相关蛋白表达分别取对数生长期的RAW264.7细胞和BV2细胞接种于6孔板,细胞分组及处理方法同1.2.1,细胞培养结束后提取蛋白质,弃去培养基,用预冷的PBS清洗2遍,每孔中加入150 μL裂解液(RIPA强裂解液,100×PMSF,10×coc ktail)置于冰上裂解30 min,每5 min晃动一次使其充分裂解;收集细胞裂解液至1.5 mL的离心管中;在4 ℃离心机中,12 000 rpm离心15 min,吸取上清到新的离心管中,5×Sample Buffer漩涡震荡混匀,99 ℃煮样10 min,10%、12%的SDS-PAGE恒压80 V电泳,当Marker在分离胶中分辨出条带,将电压调至120 V;恒流330 mA,90 min将蛋白转移到PVDF膜上;5%的脱脂牛奶室温封闭2 h;一抗,4 ℃孵育过夜.室温孵育二抗2 h;用ECL发光液显色,在凝胶成像系统中曝光成像.1.2.5 统计学分析采用GraphPad 6.02软件对NO的检测数据进行分析,数据以均值(±SE)表示.Image J软件对Western Blot 结果进行灰度分析,采用Origin 8.0软件对实验数据进行统计学分析并作图,组间差异用单因素方差分析进行比较,数据以均值(±SE)表示,检验P<0.05为差异显著,P<0.001为差异极显著.图1 143的结构Fig.1 The structure of 143(2,4,5-tris(4-nitrophenyl)-1H-imidazole)2 实验结果2.1 MTS检测143分别对RAW264.7细胞以及BV2细胞生长的作用用不同浓度的143分别处理RAW264.7细胞以及BV2细胞48 h,MTS检测药物对细胞生长的影响.如图1(a)所示,在RAW264.7细胞中,与对照组相比,当143浓度低于10 μmol/L时,对细胞的生长没有明显的抑制作用;当143浓度为20 μmol/L 时,对细胞的生长具有一定的抑制作用(P<0.001);当药物浓度为100 μmol/L时,对RAW264.7细胞生长具有极明显的抑制作用(P<0.001).BV2细胞中药物对其生长作用如图1(b)所示,与对照组相比,143浓度在20 μmol/L 浓度内对细胞生长没有抑制作用;在40 μmol/L时已经对细胞生长有极显著的抑制作用(P<0.001).此外,检测143在RAW264.7以及BV2细胞中的IC50值,如图1(c)所示,在RAW264.7细胞中的IC50值为31.84 μmol/L,图1(d)显示BV2细胞中的IC50值为56.78 μmol/L.结合以上实验结果,在后续的实验中处理细胞的最大浓度设置为10 μmol/L,对细胞的生长活力没有明显影响作用.A:不同浓度143对RAW264.7细胞活力影响;B:不同浓度143对BV2细胞活力影响;C:143对RAW264.7细胞作用的IC50值;D:143对BV2细胞作用的IC50值;***:与空白对照组相比(P<0.001,n=6).图2 143对细胞活力影响Fig.2 The effects of 143 on the cells viability2.2 143对细胞培养上清中NO含量的影响一氧化氮(nitric oxide,NO)作为一种“明星分子”被人们所熟知,其生成依赖于一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS).诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)是一氧化氮合成酶(NOS)同工酶的3种亚型之一,也能够催化NO的生成.当机体产生异常炎症时,细胞中iNOS蛋白的表达就会上升,进而由其合成的NO含量就会异常增加,而大量的NO会参与巨噬细胞、淋巴细胞的毒性作用,加重细胞的炎症反应,此外NO还与肿瘤的发生转移等密切相关[2].因此检测细胞上清中NO的含量可以一定程度上反映细胞产生炎症的程度.本实验中利用NO检测试剂盒来检测143对细胞培养上清中NO释放含量的影响.如图3C所示,用143处理RAW264.7细胞,与空白对照组相比,加入143浓度为3 μmol/L时上清中NO释放量降低(P<0.01),加入143浓度为10 μmol/L时上清中NO的含量显著性降低(P<0.001);经143预处理1 h之后再用LPS刺激细胞20 h 之后,与非143预处理组相比,细胞培养的上清中NO含量显著性降低(P<0.001),说明143对LPS诱导的细胞释放NO具有抑制作用.此外,还在BV2细胞中检测了143对上清中NO含量的影响,如图3D所示,用143预处理细胞1 h之后再加入LPS刺激细胞20 h,与非预处理组相比,143在浓度10μmol/L时对细胞中LPS诱导的细胞释放NO具有抑制作用(P<0.001).A:RAW264.7细胞中NO释放标准曲线;B:BV2细胞中NO释放标准曲线;C:143对RAW264.7细胞NO释放影响;D:143对BV2细胞NO释放影响;**:与空白对照组相比(P<0.01);***:与空白对照组相比(P<0.001);###:与空白对照组相比(P<0.001).图3 143对细胞释放NO的影响Fig.3 The effects of 143 on the release of NO in RAW264.7 and BV2 cellsA:143对RAW264.7细胞中iNOS蛋白的表达影响;B:灰度分析iNOS/β-actin相对表达量;C:143对BV2细胞中iNOS蛋白的表达影响;D:灰度分析iNOS/β-actin 相对表达量;***:与空白对照组相比(P<0.001);#:与空白对照组相比(P<0.05);###:与空白对照组相比(P<0.001).图4 143对细胞中 iNOS蛋白表达的影响Fig.4 The effect of 143 on the expression of iNOS protein in cells2.3 143对细胞中炎症相关蛋白表达的影响2.3.1 143对细胞中iNOS和COX-2蛋白表达的影响分别在两种细胞中,利用Western Blot检测与炎症相关的iNOS以及COX-2蛋白的表达情况.如图4A所示,在RAW264.7细胞中,正常情况下,iNOS蛋白的表达水平较低,加入2 μg/mL的LPS刺激细胞之后,细胞中该蛋白的表达明显增加,分别用3 μmol/L和10 μmol/L浓度的143预处理细胞1 h之后再加入LPS刺激细胞,发现相较于非143预处理组,iNOS蛋白的表达均有不同程度的下降,并且用浓度为10 μmol/L的143预处理的细胞中该蛋白表达下降的更明显.在BV2细胞中,如图4C所示,iNOS蛋白在正常情况下表达是较低的,经143预处理后再用LPS刺激后,与未用143处理组对比,iNOS蛋白的表达水平有所降低.从图中可以看出,143对LPS诱导的两种细胞中iNOS蛋白的表达都有抑制作用,但是在浓度为3 μmol/L 时,BV2细胞中的抑制作用没有RAW264.7细胞中明显.推测可能与这两种细胞各自的特质有关,BV2细胞参与神经系统抵御各种不良外界刺激,而RAW264.7细胞是外周系统的免疫细胞,两种细胞对该化合物的吸收效率不同可能会使结果有所差异.环氧化酶2(cyclooxygenase 2,COX-2)是环氧化酶(cyclooxygenase,COX)的两种亚型之一.已有研究表明,COX-2基因的启动子上具有NF-κB的结合位点.当NF-κB 被激活之后入核,引起下游与炎症相关靶蛋白表达的上调,而COX-2作为靶蛋白之一也被激活,进一步加剧炎症反应.因此,利用Western Blot检测COX-2蛋白的表达情况来观察143对炎症反应的作用.如图5A和5C所示,两种细胞在正常情况下COX-2蛋白表达水平都较低,加入LPS诱导之后,细胞中COX-2蛋白的表达显著增加,分别用3 μmol/L和10 μmol/L浓度的143预处理细胞1 h之后再加入LPS刺激细胞,两种细胞中该蛋白的表达均下降,并且在浓度为10 μmol/L时的抑制效果更加明显.提示143对LPS诱导的细胞炎症反应具有一定的抑制效应.A:143对RAW264.7细胞中COX-2蛋白的表达影响;B:灰度分析COX-2/β-actin 相对表达量;C:143对BV2细胞中COX-2蛋白的表达影响;D:灰度分析COX-2/β-actin相对表达量;***:与空白对照组相比(P<0.001);##:与空白对照组相比(P<0.01);###:与空白对照组相比(P<0.001).图5 143对细胞中COX-2蛋白表达的影响Fig.5 The effect of 143 on the expression of COX-2 protein in cells 2.3.2 143对LPS诱导的细胞中NF-κB P-P65蛋白表达的影响NF-κB核转录因子下游有众多的靶基因,如:与免疫相关的受体,炎症相关的因子等,因此参与了免疫细胞激活、细胞凋亡、炎症反应及自身免疫性疾病等多个过程[3].在哺乳动物中,NF-κB通常以p50-p65二聚体的形式维持静息状态,在炎症刺激下被激活之后,其抑制蛋白IκB对该二聚体的抑制作用解除,NF-κB 入核参与下游转录反应,因此检测p65反映了NF-κB在炎症刺激下的激活情况.在检测完NF-κB下游的相关蛋白分子后,我们用143预处理RAW264.7细胞1h,之后用LPS诱导该细胞,共同作用细胞 20 h 后检测NF-κB P-P65蛋白的表达情况,由图6可知,143在浓度为3 μmol/L时对NF-κB P-P65的蛋白表达有一定的抑制作用,在浓度为10μmol/L时,NF-κB P-P65的蛋白表达已经明显下降.A:143对RAW264.7细胞中P-P65蛋白的表达影响;B:灰度分析P-P65/β-actin相对表达量;*:与空白对照组相比(P<0.05);***:与空白对照组相比(P<0.001)图6 143对RAW264.7细胞P-P65蛋白表达的影响Fig.6 The effect of 143 on the expression of P-P65 protein in RAW264.7 cells3 讨论慢性炎症与肿瘤的关系最早是在1863年由Rudolf Virchow教授在人类肿瘤中发现有淋巴细胞浸入的现象而提出,随着研究深入,炎症已被列为癌症的七大特征之一[4-5].近年来,越来越多的研究表明,外周炎症与中枢神经系统的炎症有着密切的关系.手术等各种外伤引发的外周炎症会激活中枢神经系统炎症,造成认知功能障碍等[6].所以本实验中选取小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)和与神经中枢有密切关系的小鼠小胶质细胞(BV2)两种细胞作为炎症实验模型,观察143对这两种细胞炎症的抑制作用.NF-κB是一种普遍存在的转录因子,因其在先天免疫反应中的作用而众所周知.众多的研究表明该蛋白是炎症信号通路中的经典蛋白.正常情况下,NF-κB在胞质中以二聚体的形式维持静息状态,当被活化后,NF-κB恢复转录活性并转移到细胞核内,进而引起下游相关因子的转录激活[7].通过实验,推测143可能是通过抑制NF-κB的表达来缓解细胞炎症反应.NF-κB信号通路下游的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶-2(COX-2)是参与炎症反应的关键的调节因子.在正常生理情况下,各组织细胞的iNOS 活性几乎不表达,病理状况下主要受一些细胞因子的诱导而激活,如干扰素-α、肿瘤坏死因子-β 、脂多糖(LPS)、白介素-1等可激活NF-κB、蛋白激酶等,诱导iNOS 表达引起一氧化氮(NO)合成增加[2].NO的过量表达又会反作用于iNOS,使得炎症反应更剧烈.此外,实验中显示143对iNOS表达影响较强,而对NO的释放影响较弱,这与NO的不稳定性密切相关.NO是一种不稳定的自由基气体,携带一个未配对的电子,生物半衰期只有3 s～5 s,因此检测到的NO和诱导其产生的蛋白的表达相比,含量会有所降低.环氧合酶(COX)是前列腺素(PGs)合成过程中重要的限速酶[2].其中环氧合酶2(COX-2)在LPS的诱导下表达会上调,进而引起PGE2、PGF2等前炎症因子的含量升高,使得机体产生炎症[8].反过来,这些前炎症因子又可以使iNOS 以及COX-2蛋白表达上升,使得炎症反应进一步加强[9].已有研究表明,iNOS基因上有NF-κB 的应答元件,COX-2基因的启动子上也具有NF-κB的结合位点[10].这表明NF-κB 可能通过直接作用于这两个靶蛋白进而调节下游因子的转录与激活.但是实验中143对COX-2蛋白的抑制作用并没有iNOS蛋白的抑制作用明显,推测虽然二者都是NF-κB下游的靶蛋白,但是其参与调控的功能可能侧重不同,iNOS更多的是参与机体炎症反应,而更多的报道显示COX-2蛋白与癌症的发生密切相关.机体产生炎症反应是一个复杂的过程,NF-κB信号通路在有关炎症治疗方面的研究热度也一直居高不下.本实验表明143能抑制NF-κB的激活,进而抑制下游相关靶蛋白iNOS和COX-2的表达来抑制炎症反应.这为该化合物作为抑制炎症反应的作用做了初步的探讨,但是143抑制NF-κB的作用机制以及与该通路相关的可能上游蛋白分子还有哪些问题则有待于进一步研究.143是咪唑化合物,含有3个硝基,咪唑环是产生组胺、组氨酸生物活性并在生物体中起生理作用的重要基团.咪唑环是在结构中含有2个氮原子的五元芳香族氮杂环,并且可能产生各种非共价相互作用,例如氢键,与金属离子的配位和2π键相互作用.目前,许多咪唑化合物已被临床用作抗炎、杀菌、抗癌等药物,如咪唑斯汀、左旋咪唑、硝基呋喃、替莫唑胺等[11-13].研究提示143有望作为一种抗炎化合物来抑制炎症反应,而这种含有3个硝基的咪唑化合物在体内作用的安全性以及药物毒性还有待研究.[参考文献]【相关文献】[1] NK R,S B,SK V,et al.Frontline science:aspirin-triggered resolvin D1 controls herpes simplex virus-induced corneal immunopathology[J].Journal of leukocytebiology,2017,102(5):jlb.3HI1216-511RR.[2] 王菊勇,胡兵,徐振晔,等.NF-кB/iNOS-COX-2信号转导通路与肺癌[J].肿瘤防治研究,2009,36(4):342-345.[3] ATCHISON M L,PERRY R P.The role of the kappa enhancer and its binding factor NF-kappa B in the developmental regulation of kappa 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植物 SOD 的基因表达、活性调节及抗逆作用研究进展

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。转基因植株中Fe－SOD高
表达可以提高植株对百草枯的耐受力及它们的御寒能
力
［
8
］
。Cu/Zn－SOD在转基因烟草植株中的高表达可
以提高植株对氧化胁迫的耐受力
［
9
］
。转豌豆叶绿体
Cu / Zn－SOD在烟草中的高表达可以提高植株对强
光、低温的耐受力
［
10
］
。在转基因拟南芥中抗
miR398CSD2的高表达会比正常情况下CSD2的表达
ence，177 (4): 310～316
［
8］Brockington SF，Walker RH，Glover BJ，et al．2011．Complex pig-
ment evolution in the Caryophyllales．New Phytologist，190 ( 4 ):
854～864
，
17
(
4
):
745～760
［4］White JA，Scandalios JG．1988．Isolation and characterization of a
cDNA for mitochondrial manganese superoxide dismutase( SOD－3)
［
9］Stafford HA．1994．Anthocyanins and betalains: evolution of the mu-
tually exclusive pathways．Plant Science
，101 (2): 91～98
?基中Fe不足时或者在培养基中加入Mn或Fe
的鳌合剂时才开始表达。
－

遗传学排名

071007 遗传学遗传学的研究范围包括遗传物质的本质、遗传物质的传递和遗传信息的实现三个方面。

遗传物质的本质包括它的化学本质、它所包含的遗传信息、它的结构、组织和变化等；遗传物质的传递包括遗传物质的复制、染色体的行为、遗传规律和基因在群体中的数量变迁等；遗传信息的实现包括基因的原初功能、基因的相互作用，基因作用的调控以及个体发育中的基因的作用机制等。

遗传学中的亲子概念不限于父母子女或一个家族，还可以延伸到包括许多家族的群体，这是群体遗传学的研究对象。

遗传学中的亲子概念还可以以细胞为单位，离体培养的细胞可以保持个体的一些遗传特性，如某些酶的有无等。

对离体培养细胞的遗传学研究属于体细胞遗传学。

遗传学中的亲子概念还可以扩充到DNA脱氧核糖核酸的复制甚至mRNA的转录，这些是分子遗传学研究的课题。

一个受精卵通过有丝分裂而产生无数具有相同遗传组成的子细胞，它们怎样分化成为不同的组织是一个遗传学课题，有关这方面的研究属于发生遗传学。

由一个受精卵产生的免疫恬性细胞能够分别产生各种不同的抗体球蛋白，这也是遗传学的一个课题，它的研究属于免疫遗传学。

从噬菌体到人，生物界有基本一致的遗传和变异规律，所以遗传学原则上不以研究的生物对象划分学科分支。

人类遗传学的划分是因为研究人的遗传学与人类的幸福密切相关，而系谱分析和双生儿法等又几乎只限于人类的遗传学研究。

微生物遗传学的划分是因为微生物与高等动植物的体制很不相同，因而必须采用特殊方法进行研究。

此外，还有因生产意义而出现的以某一类或某一种生物命名的分支学科，如家禽遗传学、棉花遗传学、水稻遗传学等。

更多的遗传学分支学科是按照所研究的问题来划分的。

例如，细胞遗传学是细胞学和遗传学的结合；发生遗传学所研究的是个体发育的遗传控制；行为遗传学研究的是行为的遗传基础；免疫遗传学研究的是免疫机制的遗传基础；辐射遗传学专门研究辐射的遗传学效应；药物遗传学则专门研究人对药物反应的遗传规律和物质基础，等等。

作物土传真菌病害发生的根际微生物机制研究进展

作物土传真菌病害发生的根际微生物机制研究进展杨珍;戴传超;王兴祥;李孝刚【摘要】土传病害是制约我国农业生产可持续发展的重要瓶颈.根际是作物养分高效利用的窗口, 是植物-土壤-微生物相互作用的关键微域, 也是土传病害发生发展的主要场所.在宏基因组学快速发展的今天, 了解根际微生物与土传病害互作关系, 有利于从微生物种群、功能代谢和抑病物质等研究找出防控土传病害的有效方法.本文综述了根际微生物与土传真菌病害的发生机制关系, 探讨了土传病原真菌致害机理, 并提出目前研究的不足和未来研究的重点.目前, 我国农业生产中土传真菌病害发生严重, 很多是由不同病原菌复合侵染的结果, 其致害机理较为复杂.定向优化根际微生物群落结构提升植物根际微生态抗性, 是防控土传病害途径之一, 应加以重视.现有研究多偏向根际促生微生物, 而忽视了根际有害细菌与病害发生和作物生长的关系.今后的研究应系统评估土传真菌病害的发生及危害程度、归类土传真菌病原菌类型、深入研究土传真菌病害发生的根际微生态机理以及研发土传真菌病害综合防控技术.%Soil-borne diseases have become a major bottleneck restraining sustainable development of the agriculture in China. Rhizosphere is a window displaying how efficiently a crop uses soil nutrients, a key micro-domain of plant-soil-microbe interactions, as well as a major scene where soil-borne diseases develop. Today when metagenomics is developing so rapidly, any knowledge about interactions between rhizosphere microorganisms and soil-borne fungal diseases is conducive to exploration for effective ways to prevent and control soil-borne diseases from the aspects of microbial community, metabolic function, and disease suppressants. With reference to the databases ofScopus, Web of Science and China National Knowledge Infrastructure, a review is presented in this paper summarizing relationships between soilborne fungal diseases and rhizosphere microorganisms, discussing pathogenesis of soil-borne disease fungi, and pointing out shortages of the current researches and focal points for future researches. Currently, the incidence of soil-borne fungal diseases is very high in agricultural production of the country, and incidence of most soil-borne fungal diseases is the result of complex infections of a variety of pathogens. Oriented optimization of the structure of rhizospheric microbial communities is an effective way to enhance their antagonism to soil-borne fungal diseases for control of incidence of the diseases. So it is a noteworthy method. So far, quite a number of papers are found in the literature addressing relationships between rhizosphere probiotic microorganisms and health and growth of plants, but few are exploring impacts of harmful bacteria in the rhizosphere on incidence of soil-borne diseases and crop growth. Studies in future should be oriented to systematically assess the incidence and damage of soil-borne fungal diseases, classify soil-borne pathogens by type, explore in depth micro-ecological mechanism of rhizosphere in incidence of soil-borne diseases, and develop a comprehensive technological system for management of soil-borne diseases.【期刊名称】《土壤学报》【年(卷),期】2019(056)001【总页数】11页(P12-22)【关键词】土传真菌病害;根际微生物;微生物多样性;防控技术;作物抗性【作者】杨珍;戴传超;王兴祥;李孝刚【作者单位】南京师范大学生命科学学院,南京 210023;中国科学院南京土壤研究所,南京 210008;南京师范大学生命科学学院,南京 210023;中国科学院南京土壤研究所,南京 210008;中国科学院南京土壤研究所,南京 210008【正文语种】中文【中图分类】S182近年来我国农作物的土传病害日趋严重，对农作物产量和品质造成严重影响，已成为限制我国农业可持续发展的重要瓶颈。

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课程改革与精品建设教学内容的定位与管理研究性教授
研究性学习
完善学习评价体系课程群建设
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教学内容的定位
遗传学特色
（1）遗传学课程的教学内容与其他相关课程教学内容的交叉与重叠 –本科专业建设负责人、专业基础课程建设负责人协调（2）遗传学课程的教学体系与遗传学的快速发展相适应 –选修课、自主学习
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教学团队
理论课程 4位任课教师全部具有博士学位，期中50 岁以上教授1人，40-49岁教授2人，30岁以下副教授1人。
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教学团队
实验课程所有理论课教师均承担实验课的教授任务，此外还有2位专任实验课教师，均具备硕士学位，期中高级实验
师1人，实验师1人。
2007年开始，本科教学设立本科专业建设负责人、专业基础课程建设负责人制度。本科专业建设：生物科学、生物技术、生物工程、海洋资源开发。本科生培养的专业基础课程，分别为：动物生物学I＆II、植物生物学I＆II、生物化学、微生物学、细胞生物学、遗传学、分子生物学、生态学。
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南京师范大学生命科学学院
―遗传学”课程改革与精品创建
程罗根博士教授
南京市栖霞区文苑路1号，210042
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1
课程描述
专业设置
课程发展的主要历史沿革
教学条件
课程管理模块教学团队
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专业设置生命科学学院为南京师范大学“211工程” 重点建设的以研究型为主的二级学院，是国家理科基础科学研究和教学人才培养基地。学院现有生物科学、生物技术、生物工程和海洋资源开发技术等4个本科专业。生物科学专业有国家理科生物学人才培养基地和生物科学（师范）2个培养方向。生物科学专业为国家特色专业、江苏省首批品牌专业，生物技术专业为南师大特色专业。
理论学习环节：
（1）申报江苏省或南京师范大学大学生创新实践项目；
（2）布置自主学习内容。
实验环节：利用果蝇材料设计实验方案验证遗传三大规律和伴性遗传现象，完成详细的实验报告撰写课程论文
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完善学习评价体系
理论课程
期中考试成绩、期末考试成绩、作业、课程论文、出勤率
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课程发展的主要历史沿革
2002年“与时俱进的遗传学系列课程建设”获学校教学二等奖；主编了《人类遗传学》、《遗传学实验》等教材和《遗传学700题》等教辅资料； 2008年获准立项，启动“遗传学”校级精品课程建设。
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教学条件
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课程管理模块
课程内容的组织、作业的布置、教学信息的公布、资源的上传下载以及交互管理等有效管理
教材建设模块
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研究性教授研究型教师
教学科研型
教学探讨与交流
应届生的座谈、评教；往届生的回访
承担各级教改项目撰写教学研究论文
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南京学习
师范性
内容的衔接与互动、中学生创新思维与能力培养
先进性
设置不同层次难度等级的学习内容，满足考研学生需
要
前沿性
网络维护与更新
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教学内容的管理
课程资源模块
素材、案例、文献、流媒体等不同类型教学资源的组合
在线学习模块
注重于互动交流( 如BBS、QQ、答疑本、Blog 等) 、借助学习辅助工具并采用一定的评价手段
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课程发展的主要历史沿革
二十世纪五十年代我校首次开设《遗传学》课程； 1983年成功主办了《华东地区高师遗传学教学研讨会(第三届)》； 1996年获江苏省教委普通高校二类优秀课程（证书号：95169）； 1996年获学校一等奖； 2000年“强化素质训练的遗传学系列课程建设” 获学校教学三等奖；
教室多媒体、有线网络与无线网络实验室生物学实验教学中心：1999年以优秀的成绩被评为省级教学先进实验室； 2003年，与国际著名的生物仪器公司——Bio-Rad联合共建了生物技术探索教学实验室。
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教学条件
2004年，中心被江苏省教育厅遴选为面向南京仙林大学城的基础课共享共建实验室； 2005年，被江苏省教育厅确定为江苏省高校基础课实验教学示范中心建设点。中心面积7200平方米，仪器设备2000多件（套），总值已达1600余万元。
、教学互动（课堂、网络平台等）
实验课程
实验操作、实验结果、实验报告、实验设计、出勤率、教学互动（课堂、网络平台等）、实验考试
期中考试和期末考试实行流水阅卷，各班级按照统一的标准总评学生成绩
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课程群建设
建立了包括细胞学、生物化学、分子遗传学、分子生物学、人类遗传学、微生物遗传学、生物信息学、蛋白质组学和功能基因组学等课程在内的遗传学课程群体系，其中有些课程是各专业的必修课，有些是根据不同专业要求或学生的学习兴趣开设的选修课。
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教学条件
电子资源不断增加：电子资源建设正加快进行。近年来，先后引进各类大型光盘数据库和网络数据库70余种，内容覆盖文、史、哲、社科、心理学、理工、艺术等学科，实现了网络共享，读者可通过校园网进行检索、查阅。
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课程管理模块
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教学条件
图书资料馆藏纸本文献总量265万册，居江苏省高校第二位。馆藏文献种类覆盖哲学、人文社会科学、自然科学、工程技术等门类，馆藏文献学科体系完整，结构合理，适应综合性大学的办学需要。形成专业特色：五个学科的文献种量居全国大学图书馆前20位，其中，生物学科类（包括心理学）居第2，语言文字类居第8，文学类和教科文类同居第12，艺术类居第20。