产甲烷菌的分离、培养及鉴定方法

产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。

作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。

通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。

摘要产甲烷菌是一类以产生大量甲烷气体作为能量代谢的终产物的特殊原核微生物，广泛存在于各种极端厌氧环境中。

作为自然界碳素循环中厌氧生物处理的最后一个成员，该菌与其它菌群协同作用，将大量的有机物转化成可再生能源，对自然界中的物质循环及当今社会能源危机中的能源替代问题具有极大的推动作用。

通过本实验，我们可掌握产甲烷菌等厌氧菌的分离、培养及活菌计数的一般方法，能够实时观察产甲烷菌的形态特征并了解产甲烷菌的生长特性。

一、实验原理(一) 产甲烷菌厌氧微生物在自然界分布广泛，种类繁多，其生理作用日益受到人们的重视。

产甲烷菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，产甲烷菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。

(二) 产甲烷菌的发现历史自1901—1903年巴斯德研究所的马载（Maze）第一次观察到一种产甲烷菌的微球菌（马氏甲烷球菌）以来，迄今共发现了五十多种产甲烷菌。

1974年Bryant 提出产甲烷菌这一名词，为避免这一类细菌与氧化甲烷的好氧菌相混淆。

1979年由Balch W.E.等人根据菌株间16SrRNA降解后各寡核苷酸中碱基排列顺序间相似性的大小，提出了一个新的系统分类方法，共分为3个目、4个科、7个属、13个种。

(三) 定义、性质及分布产甲烷菌（Mathanogens）是一类必须生活在厌氧生境下并伴有甲烷产生的古生菌，其形态和生理、生化特性呈现明显的多样性。

它生长的氧化还原电位约为-0.33V，最适生长温度为35—40度，最适pH为6.0-7.2。

例如细胞形态有球状、短杆状、长杆状、螺旋状和丝状等；Gram染色反应有阳性、阴性和不定性；生长所需碳源约有10多种，除CO2外，还有其它一碳化合物（甲酸、甲醇、甲胺等）和二碳化合物（乙酸等）；只有当产甲烷菌在利用H2作CO2还原剂以产生生物合成所需细胞物质，才能利用CO2作电子受体以产生ATP和CH4。

产甲烷菌广泛分布于自然界，在淤泥、瘤胃、人和动物的肠道、昆虫的肠道、湿树木、地热泉水、深海火山口、水田和海洋的沉积物、沼泽等厌氧环境中都有产甲烷菌存在。

(四) 产甲烷菌的培养在培养产甲烷菌时，最需要控制的是厌氧条件，在pH=7.0，O2的浓度与1atm的氧平衡时，O2——O2-反应的电位是0.81V，因此，在-0.33V时，O2浓度是大气压中O2浓度的10-75。

每升饱和了空气的水中含有1.48×10-55个O2。

所以说，要保证产甲烷菌培养时的低电位是很重要的。

产甲烷菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。

这些方法都需要特定的除氧措施，操作步骤多，较繁琐。

本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术，亨盖特厌氧滚管技术是美国微生物学家亨盖特于1950年首次提出并应用于瘤胃厌氧微生物研究的一种厌氧培养技术因此他是世界上第一个分离纯化产甲烷菌的人。

以后这项技术又经历了几十年的不断改进，从而使亨盖特厌氧技术日趋完善，并逐渐发展成为研究厌氧微生物的一套完整技术，而且多年来的实践已经证明它是研究严格、专性厌氧菌的一种极为有效的技术。

该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌种都不会干扰厌氧条件。

二、材料、试剂及设备(一) 材料已分离纯化的产甲烷菌（Mathanogens）(二) 设备生物科研网提醒：高纯氮气，厌氧管，厌氧手套箱，注射器，恒温培养箱，铜柱除氧系统，定量加样器，厌氧罐，超声波破碎仪，酒精灯，冰块，水浴锅，记号笔，振荡器。

(三) 试剂1. 改良的PRAS无氮培养基，其配方组成为：NH4CL 1g，MgCl20.1g，K2HPO40.4g，KH2PO40.2g，甲酸钠5g，乙酸钠5g，甲醇3.5ml，Ph值为7.0，蒸馏水1000ml，1%的树脂刃天青（还原指示剂）1ml，121摄氏度灭菌20min。

使用前每5ml培养基加入1%Na2S（还原剂）和5%NaHCO3及3000u/ml青霉素液（抑制剂）各0.1ml；2. 糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、淀粉培养基（液体）；3. 冰块 Na2S NaHCO3；4. 乙醚，吲哚试剂，卢戈氏碘液。

三、实验步骤(一) 分离与培养1. 铜柱系统除氧铜柱是一个内部装有铜丝或铜屑的硬质玻璃管。

此管的大小为40～400mm，两端被加工成漏斗状，外壁绕有加热带，并与变压器相连来控制电压和稳定铜柱的温度。

铜柱两端连接胶管，一端连接气钢瓶，另一端连接出气管口。

由于从气钢瓶出来的气体如N2、CO2和H2等都含有微量O2，故当这些气体通过温度约360℃的铜柱时，铜和气体中的微量O2化合生成CuO，铜柱则由明亮的黄色变为黑色。

当向氧化状的铜柱通入H2时，H2与CuO中的氧就结合形成H2O，而CuO又被还原成了铜，铜柱则又呈现明亮的黄色。

此铜柱可以反复的使用，并不断起到除氧的目的。

当然H2源也可以由氢气发生器产生。

2. 预还原培养基及稀释液的制备在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。

此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，于灭氧罐中灭菌备用。

3. 分离(1) 编号取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。

(2) 稀释在无氧无菌的超净厌氧手套箱中的条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。

用无菌注射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。

依此进行10倍系列稀释，至10-6，制成不同样品稀释液。

通常选10-4、10-5、10-6三个稀释度进行滚管计数。

(3) 滚管分离① 滚管将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，当培养基从瓶中取出时，要用N2在培养基内中充气。

再在试管中用N2充气，赶走所有管内空气，然后把培养基加入管内，立即塞上瓶塞。

待瓶塞塞入管内，及时拔出充气针头。

用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。

② 分离纯化生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。

如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。

待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。

然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。

同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。

将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。

37℃培养，培养24h或更长时间或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。

③ 划线分离将试管橡皮塞的一端在火焰上灼烧一下，挨着打气针塞住管口，在针头快速取下前，通气15-20s，管口一端在火焰上烧片刻。

旋紧管塞，划线后的卷管直立保温，使用CO2:H2=80:20,因为CO2比空气重，开启后管塞不致有空气残留。

划线后的滚管，置34-37度下培养，便可长出菌落。

4. 镜检与计数(1) 镜检挑取特征性菌落制片，革兰氏染色后镜检，观察菌体形态。

(2) 计数液体纯培养物经系列稀释后，按上述滚管法培养。

然后对固体滚管计数，计算每克或每毫升样品中含有产甲烷菌的数量。

公式如下：产甲烷菌数量cfu/g（mL）样品=A×10ml×X/10×DA-0.1mL滚管计数的实际平均值，X- 镜检呈现为产甲烷菌的数目，X/10为菌落中产甲烷菌的概率，D是稀释倍数。

(二) 菌种的鉴定1. 糖发酵试验糖发酵实验是最常用的生化反应，在肠道细菌鉴定上尤为重要。

绝大多数细菌都能利用糖类作为碳源和能源，但是它们在分解糖的能力上有很大差异，有些细菌能分解糖并产酸（如乳酸、醋酸、丙酸等）和气体（如氢、甲烷、二氧化碳等）；有些细菌只产酸不产气。

例如大肠杆菌能分解乳糖和葡萄糖产酸并产气；伤寒杆菌能分解葡萄糖产酸不产气，不能分解乳糖；普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，不能分解乳糖。

酸的产生可以利用指示剂来断定。

在配制培养基时预先加入溴甲酚紫 [pH5.2(黄色)—6.8（紫色）]，当发酵产酸时，可使培养基由紫色变为黄色。

气体的产生可由发酵管中倒置的德汉氏小管中有无气泡来证明。

具体实验步骤如下：(1) 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

(2) 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

(3) 24h后观察各管中液体颜色变化及产气情况。

2. 蛋白质分解实验(1) 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

(2) 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

(3) 24h后各管分别进行米伦氏反应、吲哚反应、黄色反应和坂口反应等。

2. 淀粉水解实验(1) 将菌液进行适当稀释，之后在无菌环境下，取一定量的稀释液注入生化鉴定管中，用无菌封口膜封口。

(2) 将接种后的鉴定管放入厌氧罐中，充足氮气后放入37℃恒温培养箱培养。

(3) 24h后于各管中加入适量卢戈氏碘液观察淀粉的水解情况。

【注意】1. 注射器在使用前必须经过121℃、20min灭菌。

2. 注意无菌操作，保持手和培养管的清洁。

每次接种前需用酒精棉球将厌氧管盖子擦一遍。

3. 用注射器吸取菌悬液注入固体培养基后，如需再次吸取，应快速将注射器插入厌氧管中，以防止针头污染。

4. 树脂刃天青（resazurin）既是还原剂又是指示剂，它可以把培养基中残留的溶解氧去除，其氧化还原电位指示敏感范围为-42mV。

有氧时呈紫色或粉红色，无氧时呈无色（培养基的颜色），它是较为理想的氧化还原电位指示剂和培养严格厌氧菌不可缺少的。

5. 培养基中加入的青霉素是用来抑制其它细菌生长的，因为产甲烷菌的细胞壁成分为假肽聚糖，不受青霉素影响。