定量核磁共振波谱法同时测定中药虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的含量
藜芦的质量控制研究
藜芦的质量控制研究作者：程韬王影超陈韦佳来源：《中国民族民间医药·下半月》2021年第01期【摘要】目的：研究并完善藜芦的质量控制。
方法：采用薄层色谱法鉴别藜芦;采用HPLC法同时测定藜芦中虎杖苷和白藜芦醇的含量，采用Thermo C18色谱柱（4.6mm× 250mm 5μm），以乙腈为流动相A，以水为流动相B，进行梯度洗脱流速1.0mL/min;检测波长306nm，柱温30℃。
结果：薄层色谱斑点清晰分离度较好;虎杖苷和白藜芦醇分别在0.2004～2.004μg、0.4056～4.0563μg范围内呈现良好的线性关系，加样回收率分别为99.6%和100.1%，RSD分别为1.1%、1.0%。
结论：该方法操作简单，准确度高，灵敏度高，重现性好，专属性强，可用于藜芦的质量控制。
【关键词】藜芦;虎杖苷;白藜芦醇;薄层色谱;HPLCAbstract：Objective To study and improve the quality of Veratrum.Methods TLC was used to identify Veratrum;The Polydatin and Resveratrol was eluted on Thermo C18（250mm×4.6mm，5μm） with mobile phase of acetonitrile（A）- water（B） for gradient elution at the column temperature of 30℃. The flow rate of 1.0mL/ min and the detection wavelength was 306nm.Results The TLC spots were clear and showed a good separation;Polydatin and Resveratrol showed good linear relationships in the ranges of 0.2004～2.004μg and 0.4056～4.0563μg respectively.The sample recovery rates were 99.6% and 100.1%，the RSDs were 1.1% and 1.0%.Conclusion The method is simple，accurate，high sensitivity，good reproducibility，high specificity，and can be used for quality control of Veratrum.Keywords：Veratrum; Polydatin; Resveratrol; HPLC藜蘆在2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中系指藜芦Veratrum nigrum L.、黑紫藜芦Veratrum japonicum（Baker）Loes.f.、蒙自藜芦Veratrum mengtzeanum Loes.f.及狭叶藜芦Veratrum stenophyllum Diels的干燥根或根茎。
实验二虎杖中蒽醌类成分的提取
5%NaHCO3萃取2次，每次40ml
水层（紫红色）乙醚层
HClpH=25%Na2CO3萃取数次，每次40ml
大黄酸沉淀（粗品）
水层（红色）乙醚层
HClpH=22% NaOH萃取2次，每次40ml
大黄素沉淀（粗品）水层（红色）
HClpH=2
大黄酚和大黄素甲醚
七、实验结果
八、实验讨论
九、思考题
一、思考题
（2）中等酸性成分——大黄素的分离：碳酸氢钠萃取过的乙醚液用5%碳酸钠溶液（测5%碳酸钠水溶液的pH值）萃取5～9次，每次40ml，直至萃取液较浅为止。合并碳酸钠提取液，小心加盐酸调pH2，放置，抽滤，水洗沉淀至中性，抽干，干燥称重。计算得率。
（3）弱酸性成分——大黄酚和大黄素甲醚混合物的提取将Na2CO3提取过的乙醚液，用2%的NaOH水溶液萃取，每次40ml，萃取2次，合并碱液，滴加20%的HCl调pH1-2，放置沉淀、抽滤、水洗、干燥称重，得大黄酚和大黄素甲醚混合物。
仪器：500mL圆底烧瓶、球形冷凝管（30cm）、橡皮管、烧杯、滴管、层析缸（广口瓶）、250mL分液漏斗、布氏漏斗、抽滤瓶、水浴锅、集热式磁力搅拌器、磁子、循环水式多用真空泵、铁架台等。
四、实验内容
1.亲脂性成分——羟基蒽醌类的提取和分离
2.羟基蒽醌类的鉴定
（1）显色反应
① Borntrager’s反应；
8．β-谷甾醇
9．鞣质：属缩合鞣质，可溶于醇及水，不溶于苯、乙醚、氯仿等。
10、其他虎杖中还含有少量大黄素-8-葡萄糖苷、甾醇等。
结构：
大黄素R=OH二苯乙烯衍生物
大黄酚R=H
大黄素甲醚R=OCH3
白黎芦醇R=H
白黎芦醇R=C3H11O5
超声波-酶法提取虎杖中白藜芦醇的工艺研究
供试 中药材虎杖购 自吉林 市中药房 ； 纤维 素酶 由江 苏锐阳生物科技有 限公 司提供 （ 酶活 ５万 Ｕ ／ ｇ ） ； 乙醇 为 分析纯 。 供试仪器 ： 超声波提 取 器 （ 上 海宁商 超声 仪器 有 限 公司 Ｓ Ｙ － ３ ６ ０ ） ； ＵＶ － １ １ ０ ０紫外可 见分光光度计 （ 上海美谱 达仪器有限公司） ； 电热鼓风 干燥箱 （ 上海源长 实验仪器 设备厂 Ｄ Ｈ ９ ０ ３ ５ Ａ） ； 电子天平 （ Ａ Ｌ ２ ０ ４ ） （ 梅特勒一 托利多 仪器（ 上海 ） 有限公 司） ； 旋转蒸 发仪 （ 上海亚龙 生化仪器 厂Ｒ ２ ｃ ｓ ） ； 离心机 （ 上海 安亭科 学仪 器厂 ８ ０ ０ Ｂ ） ； 电热 恒温水浴锅（ 上海精宏实验设备有限公 司 Ｄ Ｋ 一 ￥ ２ ４ 型） 。
１ ． ２ ． １ 工艺路线 １ ． ２ ห้องสมุดไป่ตู้ ２ 原料制取
虎杖一烘 干一粉碎一 酶解一 超声波 将虎杖用清水 洗净装入载物盘 ， 放人
化、 抗休克和 强心 、 扩 血管 等方 面都 有很好 的功效 。毛
永芬等 研究 表 明 ， 这些 药理 作用 均 与 白藜芦 醇苷 、 白 藜芦醇有关 ， 而 在众 多植 物 中， 虎杖 中白藜芦 醇 和 白藜
性［ ２ 及降血脂 、 抗 血栓 、 预防动脉硬 化 、 增强免 疫功 能等
重要调节 作 用 ， 是 一种 极 具 开发 价值 的天 然 多酚 类 物
１ 材料 与方 法
１ ． １ 试验材料
质 。刘涛 等Ｌ ３ ］ 研究表明 ， 法 国人冠 心病发病率 低与 长期 饮 红葡萄酒有关 ， 因为红葡 萄酒 中富含 白藜芦 醇。在 日 本， 已将含 有 白藜 芦 醇植 物提 取 物作 为 食 品 添加 剂 使 用； 在我 国 ， 也 有将 白藜 芦醇 植 物 提取 物 制 成 降脂 、 美
虎杖
虎杖中药用成分的提取与应用研究一、虎杖基本特征虎杖最早见于《尔雅》。
又有大虫杖（《药性论》），苦杖（《本草拾遗》），酸杖、斑杖（《日华子》），苦杖根、杜牛膝（《本事方》），酸桶笋（《救荒本草》）等名称蓼个属Polygonum L.为蓼科Polygonaceae的一属,本属多为草本。
节常庞大。
单叶互生，托叶鞘多筒状，膜质或上部由草质环边。
花瓣常5裂，花瓣状；雌蕊3-9，通常8枚；花柱2-3。
瘦果三棱形或两面突起。
虎杖的别名有花斑竹、酸筒杆、酸汤梗、川筋龙、斑庄、斑杖根、阴阳莲、大叶蛇总管、黄地榆等。
为多年生粗壮草本，高1.5-3米。
地下有木质、长的根状茎，外皮黑棕色或棕黄色，折断面黄红色。
茎直立，圆柱形，中空，有凸起的纵棱，无毛，散生红色或紫红色斑点。
单叶互生，具短柄；叶阔卵形；圆锥花序；花单性异株，托叶鞘短筒状，膜质，早落。
夏季开绿白色或红色小花，雌雄异株，圆锥花序顶生或腋生；花梗细长，中部有关节，上端有翅；花被5深裂，裂片2轮，外轮3片在果时增大，背部生翅；雄花雄蕊8，雌花花柱3。
瘦果卵形，具三棱，红棕色或黑棕色，平滑光亮，全部包于扩大而成翅状的花被内。
药材虎杖多为圆柱形短段或不规则厚片，长1～7cm，直径0.5～2.5cm。
外皮棕药材虎杖褐色，有纵皱纹及须根痕，切面皮部较薄，木部宽广，棕黄色，射线放射状，皮部与木部较易分离。
根茎髓中有隔或呈空洞状。
质坚硬。
气微，味微苦、涩。
虎杖分布于我国中部及南部。
药材虎杖产于江苏、浙江、福建、山东、河南、陕西、湖北、云南、四川、贵州等地。
野生虎杖多生于山谷、溪旁或岸边。
喜欢暖湿环境，北方地区栽培可以在田间越冬。
对土壤要求不严，而以肥沃的土壤生长为好。
常用种子或分根繁殖。
根部于春、秋二季采挖，除去根须，洗净，趁鲜切短段或厚片，晒干。
二、化学成分近年来国内外学者针对单味中药虎杖的活性成分、药理作用及其提取分离方法开展了大量的实验研究工作和临床应用观察。
虎杖植物的化学成分研究已较为深入，迄今已从虎杖植物中分离得到的化学成分主要有蒽醌类、茋类、酚类、黄酮类。
中药虎杖的研究进展
• 文献综述 •471 虎杖的来源为蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.的干燥根及根茎。
在我国有很多地域出产，主要生产于江西、四川、山东、江苏等地。
春秋二季适宜采挖，去除杂质及须根，洗干净，趁着新鲜切成厚片或者小段，晾晒至干。
2 虎杖的化学成分目前为止，报道过的虎杖的研究已有80多种化合物。
它们大多数属于二苯乙烯类、醌类化合物、黄酮类等。
其他还有少数氨基酸、多糖、挥发油等也被报道。
①二苯乙烯类：从虎杖中至少能分离出23个二苯乙烯类化合物。
虎杖中的二苯乙烯类化合物主要含白藜芦醇及它的糖苷类、硫酸盐类、二聚体化合物和糖苷类衍生物。
②醌类化合物：从虎杖中至少能分离出15个蒽醌化合物和5个萘醌化合物。
虎杖中的蒽醌类化合物主要含有大黄素、大黄素甲醚、大黄酚等。
③黄酮类：在虎杖根中能分离出19种黄酮类化合物。
主要含黄铜、黄铜醇、儿茶素、芦丁、槲皮素及其糖苷类等。
④其他：从虎杖中还分离出了香豆素类化合物、木脂素类、甾体、酚类化合物等。
3 虎杖的药理作用近些年来就虎杖及有效物质的抗病毒和在心血管方面的药理作用已成为热门。
以下对近些年来虎杖的药理作用进行了总结与分析。
①抗菌、抗病毒作用：长期应用抗病毒类西药，则易产生抗药性，使其疗效减低。
而虎杖及有效成分具有调节免疫系统功能的作用，抑制病毒的复制，增强镇痛抗炎等功效。
②在心血管方面的作用：a.扩张血管作用：虎杖扩张血管、降低血压的有效成分是虎杖苷。
樊慧婷等[1]曾报道，虎杖苷可以抑制去甲肾上腺素，达到收缩家兔离体肺动脉作用，致使去甲肾上腺素的量效曲线向右侧移动。
b.对心肌细胞的作用：虎杖的水煎液能够明显改善离体心脏的收缩。
高守红等[2]针对虎杖苷对鼠心肌细胞实验说明，虎杖苷强心是由于增多了单个细胞中游离钙离子浓度而增强心肌收缩性；虎杖苷的强心作用好于洋地黄类，不仅能增强心肌的收缩，并且能增强心肌的舒张，使心肌的工作效率提升。
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DOI:10.11895/j.issn.0253_3820.140654定量核磁共振波谱法同时测定中药虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的含量
禹珊1 郭强胜1 王会琳2 高建平2 许旭*1,31(上海应用技术学院化学与环境工程学院,上海201418)2(上海中医药大学中药学院,上海201203)3(中国科学院天然产物有机合成化学重点实验室,上海200032)
摘 要 建立了定量核磁共振波谱法同时测定虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的方法。样品用80%乙醇和丙酮两次超声提取净化,再用定量核磁共振波谱法测定。考察了样品预处理和核磁共振实验条件对测定结果的影响,选择氘代二甲亚砜_重水(10∶1,V/V)为溶剂,用基准物质邻苯二甲酸氢钾标定的2,3,5_三碘苯甲酸为内标,选择脉冲延迟时间为5s,采样次数为32次。定量峰为6.388~6.391(白藜芦醇:H_2,6,d,2H)和6.322~6.330(虎杖苷:H_4,t,1H)。结果表明,NMR测定的精密度均小于0.6%,线性相关系数(r)均大于
0.999,白藜芦醇和虎杖苷的检出限分别为0.23和0.24g/L,定量限分别为0.69和1.57g/L,包括样品提取
过程的回收率分别为97.7%~103.5%(RSD=2.4%)和94.5%~99.2%(RSD=1.6%),显示出定量核磁共振法在中药定量时的可靠性。实际测定4种虎杖饮片及配方颗粒样品中白藜芦醇和虎杖苷含量分别为3.57~5.69mg/g和12.73~24.07mg/g。
关键词 定量核磁共振;虎杖;白藜芦醇;虎杖苷
2014_08_20收稿;2014_10_05接受本文系中国科学院天然产物有机合成化学重点实验室研究基金资助项目(2013_2014)*E_mail:xuxu3426@sina.com
1 引 言虎杖为蓼科植物虎杖(PoilgonumcuspidatumSieb.etZucc)的干燥根茎及根,主要功效为利湿退黄,清热解毒,散瘀止痛,具有抗菌抗病毒、扩张血管、抗肿瘤、调节代谢等药理作用[1]。虎杖作为常用中药
已收入中国药典[2],不久也会被收入欧洲药典[3]。虎杖含有大黄素和大黄素甲醚等蒽醌类化合物、白
藜芦醇和虎杖苷(白藜芦醇苷)等二苯乙烯类化合物、鞣质和多糖等成分。其中,白藜芦醇和虎杖苷是虎杖中两种主要药效成分[1,2](化学结构见图1),这两种成分测定主要以高效液相色谱[2,4]和液相色谱_
图1 白藜芦醇和虎杖苷的结构式Fig.1 Chemicalstructureofresveratrolandpolydatin
质谱联用[5]为主。定量核磁共振波谱(Quantitativenuclearmagneticresonancespectroscopy,qNMR)方法
简单、快捷,实际样品测定时可以不使用待测组分的对照品[6]。已先后被美国药典、英国药
典[7]、欧洲药典收录,中国药典2010版也已收
录[8]。近几年来,qNMR方法已被广泛用于化
学药物[9~13]、中药与植物提取物[14~19]、体液样品[20,21]、异构体[22]、食品[23,24]等的定量分析。本研究在对虎杖样品进行有效提取的基础上,建立了qNMR定量测定其中白藜芦醇和虎杖苷两种药效成分的方法,考察了实验条件的影响,对所建立的方法进行了验证,并用于实际样品分析。2 实验部分
2.1 仪器与试剂BrukerAVANCEIII500MHz核磁共振谱仪(德国Bruker公司);M2P精密天平(精度0.001mg,德
第43卷2015年1月 分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告ChineseJournalofAnalyticalChemistry 第1期69~74国Startorius公司);AB204_N天平(精度0.1mg,上海世义精密仪器有限公司);PS_20超声波清洗仪(东莞市洁康超声设备公司);RE_52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。dDMSO(氘代二甲基亚砜,DimethylSulphoxide_D6,99.9%D)和D2O(重水,DeuteriumOxide,
99.9%D)(CambridgeIsotopeLaboratoriesInc.);白藜芦醇(南京泽朗医药科技有限公司,批号ZL130705008YY);虎杖苷(南京泽朗医药科技有限公司,批号ZL20120907YY);2,3,5_三碘苯甲酸(Aladdin公司,批号23527);邻苯二甲酸氢钾(基准物质,99.05%~100.05%,国药集团上海化学试剂公
司,批号20091218);无水乙醇和丙酮(分析纯,国药集团化学试剂公司)。实验用水为某品牌蒸馏水。样品1为虎杖中药超微饮片(湖南春光九汇现代中药有限公司,规格:1.2g/袋,批号130439);样品2为虎杖中药配方颗粒(华润三九医药股份有限公司,规格:1g/袋,批号1109001S);样品3为虎杖中药
配方颗粒(江阴天江药业有限公司,规格:1g/袋,批号1109081);样品4为虎杖中药饮片(中药原产地:浙江,上海华浦中药饮片有限公司生产,批号:XD13032601)。2.2 实验方法
2.2.1 样品制备 虎杖样品研细,准确称取粉末1g,加入30mL乙醇_水(4∶1,V/V)摇匀,室温超声30min,抽滤,滤液于55℃水浴旋干。称重后称取部分产物与20mL丙酮混匀,超声30min,抽滤,残渣
重复丙酮提取一次,合并滤液,于40℃水浴上旋干得产物并称重。称取适量产物及内标2,3,5_三碘苯甲酸于塑料离心管中,加入0.55mLdDMSO_D2
O(10∶1,V/V),混合,超声2min,转移至5mm核磁管中
待测。2.2.2 核磁共振定量 核磁共振(NMR)采集条件:脉冲序列zg30,脉冲宽度14.4μs。选择延迟时间
5s,扫描次数32次,测定样品的NMR谱图。积分时,先将NMR谱图基线调平,选定峰积分区间,每个峰
积分3~5次,相对标准偏差(RSD)<1%时取平均值。用中国药典2010版中的绝对定量公式计算待测组分的重量[9]:
Ws=Wr×(As/Ar)×(Es/Er)(1)其中Wr为内标物的重量,As和Ar分别为供试品特征峰和内标峰的峰面积,Es和Er分别为供试品和内标物的质子当量重量(质量)(以分子量除以特征峰的质子数计算得到),然后根据称样量计算组分在样品中的含量。3 结果与讨论
3.1 样品制备方法的选择3.1.1 样品提取条件的优化 虎杖中有效成分提取方法已有不少研究[25,26]
,相对传统的醇提法和水
提法等,超声辅助提取法更适用于虎杖中热敏性物质白藜芦醇和虎杖苷的提取,提取时间短,提取率高。故采用超声提取法。虎杖中的白藜芦醇和虎杖苷在70~80℃时会发生部分分解,强光照射也会造成部分损失[26,27],常
温下稳定性良好。故本实验的超声提取在室温进行,无强光照射,提取时间30min,旋蒸温度均在60℃以内。根据文献[25,26],以样品2为研究对象,先用一种溶剂提取,比较了甲醇、80%甲醇、80%乙
醇、丙酮、以及混合溶剂80%乙醇_丙酮(1∶1,V/V)的提取效果。结果表明,甲醇、80%甲醇、80%乙醇以及80%乙醇_丙酮(1∶1,V/V)一次提取即可达到提取完全的效果,但测试谱图杂峰较多,影响定量;而丙酮重复提取3次后仍可检测到较高残留,但谱图杂峰较少且不干扰待测组分的定量峰。因此考虑两步提取的方式。选择80%乙醇做第一步完全提取的溶剂;第二步提取选择丙酮为溶剂净化产物,结果表明,丙酮两次提取即可基本提取完全(第三次提取产物旋蒸后测组分定量峰信噪比仅为17,残留很少,基本不影响定量结果)。实验确定样品提取的条件为:室温,无强光照射,80%乙醇一次超声提取,产物旋干后再经丙酮两次超声提取,时间均为30min。3.1.2 氘代溶剂 单独以dDMSO为溶剂时,待测样品图谱中白藜芦醇和虎杖苷的定量峰旁边存在干
扰峰。尝试dDMSO_D2
O混合溶剂,两定量峰可获得较好分离,且没有干扰。最终选定氘代溶剂为
07 分析化学第43卷dDMSO_D2O(10∶1,V/V)。3.2 内标物的选择尝试了邻苯二甲酸氢钾、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、对苯二甲醛、苯甲酸、3,5_二硝基苯甲酸、2,3,5_三碘苯甲酸。仅有2,3,5_三碘苯甲酸不与样品峰互相干扰。故选择2,3,5_三碘苯甲酸为内标。3.3 NMR峰归属及定量峰的确认
3.3.1 NMR峰归属 用2.2节的方法,分别对白藜芦醇、虎杖苷、内标以及3者的混合物进行NMR
检测。对比图2中各图,归属混合物谱图(D)中的各信号峰。δ6.0~8.5区间段内为白藜芦醇峰:δ6.097~6.105(t,1H),6.388~6.391(d,2H),6.743~6.760(d,2H),6.783~6.816(d,1H),6.922~6.955(d,1H),7.376_7.393(d,1H);虎杖苷峰:6.322~6.330(t,1H),6.573(s,1H),6.715(s,1H),6.747~6.764(d,2H),6.846~6.878(d,1H),7.010~7.043(d,1H),7.388~7.404(d,1H);2,3,5_三碘苯甲酸:7.727~7.730(d,1H),8.329~8.332(d,1H)。
图2 对照品和内标的NMR测试结果在化学位移δ6.0~8.5区间段放大图Fig.2 NMRspectraofchemicalreferencesandinternalstandardinδ6.0-8.5range
白藜芦醇(A);虎杖苷(B);2,3,5_三碘苯甲酸(C);A、B和C的混合物(D)。Resveratrol(A);Polydatin(B);2,3,5_triiodobenzoate(C);themixtureofA,BandC(D).
3.3.2 定量峰确认 取样品1,用2.2节的方法测得NMR谱图(图3A),与纯品混合图谱(图2D)比
较,选定H_2,6(6.388~6.391,d,2H)(图3B中峰1)为白藜芦醇定量峰;虎杖苷定量峰为H_4(6.322~6.330,t,1H)(图3B中峰2);内标峰为H_6(8.329~8.332,d,1H)(图3B中IS)。
3.4 对2,3,5_三碘苯甲酸,白藜芦醇和虎杖苷的含量校正以dDMSO_D2
O(4∶1,V/V)为溶剂,基准物质邻苯二甲酸氢钾的NMR峰H_3,6(7.917~7.935,
2H,dd)与3种纯品的NMR定量峰互不干扰,故选其作为校准2,3,5_三碘苯甲酸(定量峰为H_6(8.189~8.193,1H,d)),白藜芦醇(定量峰H_4(6.097~6.105,1H,t))和虎杖苷(定量峰H_4(6.322~6.330,1H,t))含量的内标,采用qNMR绝对定量模式对3种纯品进行含量校正。实验测得2,3,5_三碘苯甲酸含量为96.64%,RSD为0.6%;白藜芦醇纯品含量为98.64%,RSD为0.4%;虎杖苷