分子荧光光谱法
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•荧光发射光谱（荧光光谱）— —固定某一激发波长，测定荧光
发射强度随发射波长变化得到的 光谱。
荧光光谱的特点：
①斯托克斯位移（Stokes shift)。与激发光谱相比，
荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处；
②荧光光谱与激发波长无关。无论用λ=250和350nm
作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同；
=εbc
则 I I 0 e 2.303bc
F K I 0 (1 e 2.303bc )
假设εbc＜0.05
F = K’I02.303 εbc
当I0一定时 F = K·C
(K =K’I02.303 εb)
即在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度
成正比，这是荧光法定量的基础。
2. 荧光量子产率Φ
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
无辐射跃迁 ☆振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级 转至较低振动能级的过程，其效率较高。 ☆内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回 到低能级的分子内过程。 ☆系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多 重态发生变化的过程。 ☆外转换：激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转 换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
（1）电子跃迁类型
发射 π*→π跃迁比π*→n跃迁更常见
（2）共轭效应 芳香族化合物的荧光最常见且最强，大多数未取代芳烃 在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程度增加，荧光峰红移，Φ↑。 简单杂环化合物不发荧光，但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。
（3）平面刚性结构效应 有刚性结构的分子容易发荧光，刚性和共平面 性的增加有利于荧光发射。
C6H5Cl C6H5Br C6H5I
相对荧光强度 10
3 0 17 18 20 20 20
7 5 0
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大；
化合物
★带有酸性或碱性取代基的芳香化
合物的荧光与pH有关；
C6H5OH
★溶剂 溶剂极性增加有时会使荧 光强度增加，荧光波长红移；若溶 C6H5O—
剂和荧光物质形成氢键或使荧光物
③吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称。
9.2 荧光分析仪器和荧光法的应用
9.2.1 荧光分光光度计 荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱。 第一单色器选择激发光波长（＞ 250nm的紫外光），故称为激发单色 器。第二单色器（荧光单色器）与 激发光入射方向垂直，并选择荧光 波长，可提高方法的选择性和准确 度。
物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：
发射荧光的分子数 发射的光子数 激发态的分子数 吸收的光子数
Φ与失活过程的速率常数k有关：
kf
k f ki kec kic
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系间窜越、 外转换、内转换）的速率常数减小的因素都可使荧光增强。
荧光与结构的关系
9.1 荧光光谱法基本原理 9.1.Fra Baidu bibliotek 分子的激发与失活
1. 分子的多重态
单重态 一个所有电子自旋都配对的 分子的电子状态。大多数有机物分子 的基态是单重态。当基态一对电子中 的一个被激发到较高能级，其自旋方 向不会立刻改变，分子仍处于单重态。
三重态 有两个电子的自旋不配对而 平行的状态。激发三重态能量较激发 单重态低。
质电离状态改变，会使荧光强度、 C6H5NH2 荧光波长改变；含重原子的溶剂
（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 +
★溶解氧的存在往往使荧光强度降 C6H5NH3 低。
相对荧光 强度 18 10 20
0
9.1.3 激发光谱和荧光光谱
任何荧光化合物都具有两种特征 光谱：
•荧光激发光谱（吸收光谱）
—固定某一发射波长，测定该波 长下的荧光发射强度随激发波长 变化所得的光谱。
9.1.2 荧光强度及影响荧光的因素
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F） 与荧光物质的吸光程度及其发射荧光的能力有关。
1. 荧光强度与浓度的关系 F = K′（I0—I） I0——入射光辐射功率； I——透射光辐射功率；荧光量 子产率（Ф）。
F = K′（I0—I）
根据朗伯-比尔定律，lg I 0 I
名称
结构式
应用
9-蒽基重氮甲烷
CH2N2
某些羧酸
丹磺酰氯
N(CH3)2
伯胺、仲胺、酚或 氨基酸
SO2Cl
减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。
辐射跃迁: 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振 动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。 由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大， 速率常数kf为106~109s-1。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态 所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的 改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。
联苯 Φ=0.2
CH2
芴 Φ=1
(4)取代基的影响 芳环上有羧基、羰基或 亚硝基等吸电子基团取 代时，荧光减弱；
给电子取代基如-OH、NH2、-CN、-OCH3等会使 荧光强度增加。
重原子效应 含有重原 子的分子中，系间窜跃 的几率大,使荧光减弱， 磷光增强。
化合物
苯
C6H5COOH C6H5NO2 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2 C6H5CN
9.2.2 荧光法的应用
荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，但是能 发生荧光的化学体系不多，这是荧光法的应用特点。
无机物通过与荧光试剂作用生成荧光螯合物而进行荧光 分析，非过渡金属离子的荧光螯合物较多，荧光试剂具 有两个（或以上）与MZ+形成螯合物的电子给予体官能团 的芳香结构。
荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能 发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生 荧光。
第九章 分子荧光光谱法 Molecular fluorescence spectroscopy
光致发光和分子荧光光谱法
9.1 荧光光谱法基本原理 9.2 荧光分析仪器和荧光法的应用
光致发光（Photoluminescence）: 荧光和磷光是分子吸光
成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，称为光致发光。 特点： ★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个数量级； ★线性范围宽； ★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不 一定发射荧光或磷光； ★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。 基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光 谱法。
发射强度随发射波长变化得到的 光谱。
荧光光谱的特点：
①斯托克斯位移（Stokes shift)。与激发光谱相比，
荧光光谱的波长总是出现在更长的波长处；
②荧光光谱与激发波长无关。无论用λ=250和350nm
作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同；
=εbc
则 I I 0 e 2.303bc
F K I 0 (1 e 2.303bc )
假设εbc＜0.05
F = K’I02.303 εbc
当I0一定时 F = K·C
(K =K’I02.303 εb)
即在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质的浓度
成正比，这是荧光法定量的基础。
2. 荧光量子产率Φ
2. 激发态分子的失活: 激发态分子不稳定，它要以辐射
或无辐射跃迁的方式回到基态。
无辐射跃迁 ☆振动弛豫：激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级 转至较低振动能级的过程，其效率较高。 ☆内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回 到低能级的分子内过程。 ☆系间窜越： 激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多 重态发生变化的过程。 ☆外转换：激发态分子与溶剂与其他溶质相互作用、能量转 换而使荧光 （或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的
（1）电子跃迁类型
发射 π*→π跃迁比π*→n跃迁更常见
（2）共轭效应 芳香族化合物的荧光最常见且最强，大多数未取代芳烃 在溶液中发荧光，随着环的数目和稠合程度增加，荧光峰红移，Φ↑。 简单杂环化合物不发荧光，但具有稠环结构的杂环化合物都发荧光。
（3）平面刚性结构效应 有刚性结构的分子容易发荧光，刚性和共平面 性的增加有利于荧光发射。
C6H5Cl C6H5Br C6H5I
相对荧光强度 10
3 0 17 18 20 20 20
7 5 0
荧光与环境因素的关系
★温度降低会使荧光强度增大；
化合物
★带有酸性或碱性取代基的芳香化
合物的荧光与pH有关；
C6H5OH
★溶剂 溶剂极性增加有时会使荧 光强度增加，荧光波长红移；若溶 C6H5O—
剂和荧光物质形成氢键或使荧光物
③吸收光谱与发射光谱大致成镜像对称。
9.2 荧光分析仪器和荧光法的应用
9.2.1 荧光分光光度计 荧光分光光度计既可用于定量分析， 也可用于测绘激发光谱和荧光光谱。 第一单色器选择激发光波长（＞ 250nm的紫外光），故称为激发单色 器。第二单色器（荧光单色器）与 激发光入射方向垂直，并选择荧光 波长，可提高方法的选择性和准确 度。
物质分子发射荧光的能力用荧光量子产率（Φ）表示：
发射荧光的分子数 发射的光子数 激发态的分子数 吸收的光子数
Φ与失活过程的速率常数k有关：
kf
k f ki kec kic
凡是使荧光速率常数kf增大而使其他失活过程（系间窜越、 外转换、内转换）的速率常数减小的因素都可使荧光增强。
荧光与结构的关系
9.1 荧光光谱法基本原理 9.1.Fra Baidu bibliotek 分子的激发与失活
1. 分子的多重态
单重态 一个所有电子自旋都配对的 分子的电子状态。大多数有机物分子 的基态是单重态。当基态一对电子中 的一个被激发到较高能级，其自旋方 向不会立刻改变，分子仍处于单重态。
三重态 有两个电子的自旋不配对而 平行的状态。激发三重态能量较激发 单重态低。
质电离状态改变，会使荧光强度、 C6H5NH2 荧光波长改变；含重原子的溶剂
（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱。 +
★溶解氧的存在往往使荧光强度降 C6H5NH3 低。
相对荧光 强度 18 10 20
0
9.1.3 激发光谱和荧光光谱
任何荧光化合物都具有两种特征 光谱：
•荧光激发光谱（吸收光谱）
—固定某一发射波长，测定该波 长下的荧光发射强度随激发波长 变化所得的光谱。
9.1.2 荧光强度及影响荧光的因素
荧光是物质吸收光子之后发出的辐射，荧光强度（F） 与荧光物质的吸光程度及其发射荧光的能力有关。
1. 荧光强度与浓度的关系 F = K′（I0—I） I0——入射光辐射功率； I——透射光辐射功率；荧光量 子产率（Ф）。
F = K′（I0—I）
根据朗伯-比尔定律，lg I 0 I
名称
结构式
应用
9-蒽基重氮甲烷
CH2N2
某些羧酸
丹磺酰氯
N(CH3)2
伯胺、仲胺、酚或 氨基酸
SO2Cl
减弱或消失，称为荧光熄灭（或猝灭）。
辐射跃迁: 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振 动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8 ~ 10 -11s。 由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大， 速率常数kf为106~109s-1。
磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态 所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的 改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。
联苯 Φ=0.2
CH2
芴 Φ=1
(4)取代基的影响 芳环上有羧基、羰基或 亚硝基等吸电子基团取 代时，荧光减弱；
给电子取代基如-OH、NH2、-CN、-OCH3等会使 荧光强度增加。
重原子效应 含有重原 子的分子中，系间窜跃 的几率大,使荧光减弱， 磷光增强。
化合物
苯
C6H5COOH C6H5NO2 C6H5CH3 C6H5OH C6H5OCH3 C6H5NH2 C6H5CN
9.2.2 荧光法的应用
荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量分析，但是能 发生荧光的化学体系不多，这是荧光法的应用特点。
无机物通过与荧光试剂作用生成荧光螯合物而进行荧光 分析，非过渡金属离子的荧光螯合物较多，荧光试剂具 有两个（或以上）与MZ+形成螯合物的电子给予体官能团 的芳香结构。
荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能 发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生 荧光。
第九章 分子荧光光谱法 Molecular fluorescence spectroscopy
光致发光和分子荧光光谱法
9.1 荧光光谱法基本原理 9.2 荧光分析仪器和荧光法的应用
光致发光（Photoluminescence）: 荧光和磷光是分子吸光
成为激发态分子，在返回基态时的发光现象，称为光致发光。 特点： ★灵敏度高。检测限比吸收光谱法低1~3个数量级； ★线性范围宽； ★选择性比吸收光谱法好。因为能产生紫外可见吸收的分子不 一定发射荧光或磷光； ★应用范围不如吸收光谱法广，因为有的分子不发荧光。 基于化合物的荧光测量而建立起来的分析方法称为分子荧光光 谱法。