毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展_夏姗
毕赤酵母表达实验手册
毕⾚酵母表达实验⼿册毕⾚酵母表达实验⼿册Jnuxz丁⾹园虚拟社区蛋⽩质技术讨论版⼤肠杆菌表达系统最突出的优点是⼯艺简单、产量⾼、周期短、⽣产成本低。
然⽽，许多蛋⽩质在翻译后，需经过翻译后的修饰加⼯，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋⽩酶⽔解等过程才能转化成活性形式。
⼤肠杆菌缺少上述加⼯机制，不适合⽤于表达结构复杂的蛋⽩质。
另外，蛋⽩质的活性还依赖于形成正确的⼆硫键并折叠成⾼级结构，在⼤肠杆菌中表达的蛋⽩质往往不能进⾏正确的折叠，是以包含体状态存在。
包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋⽩，就需要进⾏变性溶解及复性等操作，这⼀过程⽐较繁琐，同时增加了成本。
⼤肠杆菌是⽤得最多、研究最成熟的基因⼯程表达系统，当前已商业化的基因⼯程产品⼤多是通过⼤肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量⾼、易于操作。
但⼤肠杆菌是原核⽣物，不具有真核⽣物的基因表达调控机制和蛋⽩质的加⼯修饰能⼒，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应⽤。
近年来，以酵母作为⼯程菌表达外源蛋⽩⽇益引起重视，原因是与⼤肠杆菌相⽐，酵母是低等真核⽣物，除了具有细胞⽣长快，易于培养，遗传操作简单等原核⽣物的特点外，⼜具有真核⽣物时表达的蛋⽩质进⾏正确加⼯，修饰，合理的空间折叠等功能，⾮常有利于真核基因的表达，能有效克服⼤肠杆菌系统缺乏蛋⽩翻译后加⼯、修饰的不⾜。
因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利⽤。
［1］。
同时与⼤肠杆菌相⽐，作为单细胞真核⽣物的酵母菌具有⽐较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加⼯修饰能⼒。
酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分⼦遗传学⽅⾯被⼈们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。
1981年酿酒酵母表达了第⼀个外源基因----⼲扰素基因［2］，随后⼜有⼀系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。
⼲扰素和胰岛素虽然已经利⽤酿酒酵母⼤量⽣产并被⼴泛应⽤，当利⽤酿酒酵母制备时，实验室的结果很令⼈⿎舞，但由实验室扩展到⼯业规模时，其产量迅速下降。
巴斯德毕赤酵母研究进展
巴斯德毕赤酵母研究进展
丁云菲;刘勇;戴长柏
【期刊名称】《生命科学》
【年(卷),期】2003(15)1
【摘要】巴斯德毕赤酵母以其独特的生物学和遗传学特征成为当今一种诱人的外源基因表达系统,已成功地表达了各种类型的外源蛋白。
本文综述了巴斯德毕赤酵母的一些特征及其作为外源基因表达系统,实现高表达的策略。
【总页数】5页(P26-30)
【关键词】巴斯德毕赤酵母;特征;基因表达系统;高表达策略
【作者】丁云菲;刘勇;戴长柏
【作者单位】中国协和医科大学中国医学科学院医学生物学研究所分子生物室【正文语种】中文
【中图分类】Q936
【相关文献】
1.巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)高效异源表达脂肪酶研究进展 [J], 李杨;蔡海莺;赵敏洁;李阳;冯凤琴
2.巴斯德毕赤酵母GS115基因组研究进展 [J], 王永刚;马雪青;王倩;周贤婧;赵虎彪;马建忠
3.巴斯德毕赤酵母启动子研究进展 [J], 薛亚慧
4.巴斯德毕赤酵母基因表达系统的研究进展 [J], 谌井冈;张宝善
5.巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)高密度发酵研究进展 [J], 闵兆升;郭会明;颜旭;洪厚胜
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毕赤酵母工程菌产乳糖酶发酵条件优化的研究
毕赤酵母工程菌产乳糖酶发酵条件优化的研究侯重文;朱梓昂;张秀华;刘飞;马河【期刊名称】《食品与药品》【年(卷),期】2016(018)005【摘要】目的优化毕赤酵母工程菌株VGal3186的发酵条件.方法对发酵培养基中的碳源、氮源、金属离子和pH、温度、接种量等发酵条件分别进行了单因素和正交试验优化,并在50 L发酵罐中验证.还对所产重组米曲霉乳糖酶进行酶学性质研究.结果优化后的发酵培养基为葡萄糖45g/L、甘油15g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取物20g/L、KH2PO4 4 g/L、MgSO4 9 g/L、CaC12 0.5 g/L、FeSO490 mg/L、CuSO4 6mg/L、K2SO4 18.2g/L,发酵条件为pH 7.0、发酵温度30℃、接种量7％,转速300 r/min.摇瓶发酵酶活性可达689 U/mL,较优化前提高了35.2％.50 L发酵罐中酶活性可达5264 U/mL,酶学性质表现更好.结论毕赤酵母工程菌株VGal3186经发酵优化后产量更高,产乳糖酶酶学性质好,在食品工业中应用潜力巨大.【总页数】7页(P305-311)【作者】侯重文;朱梓昂;张秀华;刘飞;马河【作者单位】山东省药学科学院山东省生物药物重点实验室山东省多糖类药物工程实验室多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室,山东济南250101;山东福瑞达医药集团公司,山东济南250101;华东理工大学生物工程学院,上海,200237;山东省药学科学院山东省生物药物重点实验室山东省多糖类药物工程实验室多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室,山东济南250101;山东福瑞达医药集团公司,山东济南250101;山东省药学科学院山东省生物药物重点实验室山东省多糖类药物工程实验室多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室,山东济南250101;山东福瑞达医药集团公司,山东济南250101;山东省药学科学院山东省生物药物重点实验室山东省多糖类药物工程实验室多糖类药物发酵与精制国家地方联合工程实验室,山东济南250101【正文语种】中文【中图分类】TQ92【相关文献】1.响应面法优化毕赤酵母基因工程菌表达木聚糖酶条件研究 [J], 杨诗逸;李琦;奚丽娅;陈明真;赵林果;2.响应面法优化毕赤酵母基因工程菌表达木聚糖酶条件研究 [J], 杨诗逸;李琦;奚丽娅;陈明真;赵林果3.毕赤酵母产木聚糖酶发酵条件优化及其酶学特性研究 [J], 徐志旭;袁丽娟;卢洪栋;潘春梅4.重组毕赤酵母产木聚糖酶的发酵条件优化研究 [J], 袁冬华;蔡国林;任晓静;王霈虹;陆健5.产碱性β-甘露聚糖酶重组毕赤酵母发酵条件优化及酶学特性研究 [J], 钱娟娟;曹世源;王克芬;王兴吉;刘文龙;因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因工程菌高密度发酵工艺研究进展
基因工程菌高密度发酵工艺研究进展
涂桂云;李敏
【期刊名称】《工业微生物》
【年(卷),期】2004(34)3
【摘要】阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术.通过高密度发酵可以提高细胞生长
密度、目的蛋白的表达含量.在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响.
【总页数】4页(P49-52)
【作者】涂桂云;李敏
【作者单位】福建师范大学生物工程学院,福州,350007;福建师范大学生物工程学院,福州,350007
【正文语种】中文
【中图分类】TQ920.1
【相关文献】
1.分泌型人胸腺素α1基因工程菌高密度发酵工艺的研究 [J], 林陈水;黎小军;付水星;许明;梅建凤
2.高产中性纤维素酶的巨大芽胞杆菌基因工程菌发酵工艺条件优化 [J], 李春梅;何江波;陈惠;王红宁;韩学易;吴琦
3.基因工程菌 K88-K99融合蛋白高密度发酵工艺的初步研究 [J], 谢金文;李书光;
肖跃强;王文秀;唐娜;董林;李峰;沈志强
4.基因工程菌高密度培养补料调控策略的研究进展 [J], 吴子岳;张艳乐;许哲;欧杰
5.重组Echistatin融合基因工程菌高密度发酵工艺优化 [J], 杨利军;杨涛;解军;张娟;赵志强;罗佳;牛勃
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基因工程菌的高密度发酵研究
基金项目 作者简介
收稿日期
山西农业大学青年创新基金项目（ ２００５０７） 。 尹淑琴（ １９７９－ ） ， 女， 山西兴县 人， 硕 士， 助 教， 从事 生物 化学 与 分 子 生 物 学 研 究 。＊ 通 讯 作 者 ， 教 授 ， 硕 士 生 导 师 。Ｔｅｌ： ０３５４－ ６２８６９０８， Ｅ－ ｍａｉｌ： ｃｈａｎｇｈｏｎｇ５２３＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ。 ２００７! ０１! １１
普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源， 葡萄糖浓度过 高抑制细胞的生长。李寅等在高密度生产谷胱甘肽中考察 了 ＷＳＨ ＫＥ１ 对葡萄糖 浓度 的 耐 受 性 及 其 对 葡 萄糖 的 消 耗 能力， 发现初糖浓度超过 ２０ ｇ／Ｌ 即对 ＷＳＫ ＫＥ１ 细胞生长和 ＧＳＨ 合成起抑制作用［４］。洒荣波等在重组菌 Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ的 培养中发现当葡萄糖浓度大于 ４ ％时， 菌体密度随其浓度 的 升 高 而 降 低 ［５］。同 时 已 有 人 用 甘 油 代 替 葡 萄 糖 作 为 细 菌 生 长的碳源， 以减少代谢抑制物质— ——乙酸的积累， 更易达到 重组菌的高密度和外源蛋白的高表达。用甘油作为培养基 的碳源可缩短工程菌的利用时间， 增加分裂繁殖的速度。 ＮＯ３－ 、胰蛋 白 胨（ Ｔｒ） 、酵 母 提 取 物（ Ｙｅ） 作 为 氮源 有 利 于 细 胞 的生长。比如， 在硅藻类（ Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｌａｅｖｉｓ） 高密度培养过程中 提 高 十 二 碳 五 烯 酸 ＥＰＡ 的 产 量 时 ， ＮＯ３－∶Ｔｒ∶Ｙｅ 的 最 佳 比 例 为 １∶２．６∶１．３， Ｇｌｕ∶ＮＯ３－ 的最佳比例为 ３２∶１［１］。有些营养物质在 高密度培养过程中可以控制细胞的死亡率， 曾有报道在非 洲绿猴肾成纤维细胞系培养过程中， 加入半乳糖和谷胱甘 肽 可 以 阻 止 细 胞 程 序 性 死 亡 ［６］。
重组毕赤酵母生产外源蛋白的过程控制与生理分析的研究进展
重组毕赤酵母生产外源蛋白的过程控制与生理分析的研究进展高敏杰1，2，张许1，2，高鹏1，2，史仲平1，2，*【摘要】毕赤酵母是近年来应用广泛、极受青睐的一种外源蛋白表达系统。
除了构建高效、稳定的毕赤酵母生产菌株外，研究不同发酵控制条件下，细胞的生理和代谢状态变化，为毕赤酵母细胞提供最优的生长和环境条件并综合考虑发酵成本是成功实现外源蛋白规模化、商业化生产的保障。
本文从培养基组分、外界环境条件、细胞比生长速率、生长期甘油流加策略和诱导期甲醇流加策略等方面阐述了发酵过程对外源蛋白表达的影响，并进一步从细胞生理和代谢层面深入讨论了不同发酵过程控制条件的影响机制。
【期刊名称】食品工业科技【年(卷),期】2014(035)024【总页数】7【关键词】毕赤酵母，过程控制，代谢分析，蛋白分泌，压力应激【文献来源】https:///academic-journal-cn_science-technology-food-industry_thesis/020*********.html毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来应用非常广泛的一种外源蛋白表达宿主系统，与其他表达系统相比，具有外源基因遗传稳定，细胞生长速率快，产物表达效率高，不受内毒素和噬菌体影响，外源蛋白可以进行翻译后修饰，大多数产物可以分泌到胞外等许多优点。
至今已有1000多种外源蛋白在该表达系统中成功表达，重组蛋白产品涉及食品、饲料、医药等众多行业[1-3]。
毕赤酵母发酵过程通常分为三个阶段：甘油分批培养阶段、甘油流加阶段和甲醇诱导阶段，前两个阶段总称为细胞生长期，目的是为了得到高密度的酵母细胞，甲醇诱导阶段向发酵罐中流加甲醇培养基，诱导外源蛋白表达。
图1为一个典型的好氧发酵过程控制示意图，发酵过程中通过电极在线测量得到的实时甲醇浓度、溶氧浓度、pH和温度等，以及通过天平在线测量得到的实时甲醇流加量、甘油流加量，经多通道A/D-D/A转换卡传输到工业计算机上，与设定值进行比较，然后根据比较结果，对pH、温度以及甲醇和甘油的流加速率等进行调整。
毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法
毕赤酵母高密度发酵过程中色素的去除方法
在毕赤酵母高密度发酵过程中，色素的去除方法可以有以下几种：
1. 洗涤法：通过对发酵液进行反复洗涤，使色素随废液排除。
可以使用水作为洗涤剂，也可以使用一定浓度的酸性或碱性溶液进行洗涤。
2. 吸附剂法：添加吸附剂，如活性炭、聚合物树脂等，将色素吸附在表面上，再经过过滤或离心等方法将吸附剂与色素分离。
3. 离子交换法：使用具有特定透析膜的离子交换器，将色素从发酵液中透析出来。
4. 膜分离法：利用微滤、超滤或逆渗透等膜技术，通过不同孔径的膜将色素分离，使得色素无法通过膜孔径滞留在膜表面上。
5. 氧化法：通过加入氧化剂，如过氧化氢、过氧化物等，在适当的条件下将色素氧化，使其转化为无色物质。
以上是常用的一些色素去除方法，具体的选择可以根据实际情况和要求进行。
Muts型基因重组巴斯德毕赤酵母高密度发酵过程中甲醇流加的控制
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材料与方法
菌种
重组毕赤酵母菌 !"#$"% & %’()*"’ （ ;<’’= ） 由中 ［:］ 科院上海生物化学研究所甘人宝课题组构建 ， 具 有 >5- ? *+,- 表型 ( ! " # 培养基
! （ @*;A ） 甘 ! ( # ( ! 种子培养基 AB@ ’$ ( : 8 C D， 油 ’% .D C D， 生物素 % ( : . 8 C D， ’ .34 C D E> F ( % 的
慢， 但有时外源蛋白的表达反而更高， 更有利于蛋
［)］ 白质的正确折叠 (
血管生长抑制素 （ 12 853-,1,52） 是一个相对分子 质量为 $9 %%% 的血浆纤维蛋白溶酶原片段， 通过抑 制毛细血管内皮细胞的移行和增殖， 阻断新生毛细 血管的形成， 从而达到阻断肿瘤细胞转移通路、 萎
［$］ 缩肿瘤的治疗目的 ( 已构建的表达血管生长抑制 ［:］ 素的重组毕赤酵母 具有 *+,- 的表型， 在发酵过 程的表达阶段， 甲醇质量浓度控制对蛋白质表达起
dkl溶液开始诱导重组蛋白表达流加方法参照文献发酵过程由国家生化工程技术研究中心上海开发的发酵罐控制系统l3e017q软件进行在线控制和数据采集甲醇的在线检测与控制甲醇的在线检测及流加控制系统包括甲醇采样器检测器和ohr9型甲醇质量浓度监控仪个部分由生物反应器工程国家重点实验室提供测定方法菌体浓度采用浊度法发酵液经稀释后于波长f2
甲醇利用能力， 具有 *+, （ ./,01234 +,54561,532 -437 ） 表型； *+,- 表型的毕赤酵母在甲醇诱导阶段生长缓
不低于 )%& ( 甘油耗尽后 ’ 0 开始流加质量分数为 （每升含 ’) .D KL *’ 溶液） ， 菌体密度 =%& 的甘油 （ 每 升 含 ’) .D 达 一 定 程 度 时 流 加 ’%%& 甲 醇 ［)］ ， 开始诱导重组蛋白表达， 流加方法 KL *’ 溶液 ） 参照文献 ［ )］ ( 发酵过程由国家生化工程技术研究 中心 （上海） 开发的发酵罐控制系统 L3E017Q 软件 进行在线控制和数据采集 ( !"% 甲醇的在线检测与控制 甲醇的在线检测及流加控制系统包括甲醇采 样器、 检测器和 OHR’9%@ 型甲醇质量浓度监控仪 $ 个部分， 由生物反应器工程国家重点实验室提供 ( !"& 测定方法 菌体浓度采用浊度法， 发酵液经稀释后于波长 （ "SF%% ） F%% 2. 测光密度 ( 血管生长抑制素的测定 采用 TDM<! 方法 (
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生物技术通讯LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol.24No.1Jan.,2013
毕赤酵母工程菌高密度发酵的研究进展夏姗1,2，武福军2,3，赵洪亮2，薛冲2，刘志敏21.安徽大学生命科学学院，安徽合肥230039；2.军事医学科学院生物工程研究所，北京100071；
3.山西康宝生物制品股份有限公司，山西长治046000
［摘要］近年来毕赤酵母已成为一种优越的异源蛋白表达系统。而提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵已成为关键技术环节之一。我们从毕赤酵母工程菌的选择、培养基的优化设计，以及发酵工程过程控制等方面简要阐述毕赤酵母的高密度发酵，并提出了工程菌在高密度发酵过程中存在的问题。［关键词］毕赤酵母工程菌；高密度发酵；培养基优化；发酵过程控制［中图分类号］Q78［文献标识码］A［文章编号］1009-0002（2013）01-0109-04
ProgessofPichiapastorisEngineeringBacteriaonHigh-DensityFer⁃mentation
XIAShan1,2,WUFu-Jun2,3,ZHAOHong-Liang2,XUEChong2,LIUZhi-Min2*1.SchoolofLifeScience,AnhuiUniservity,Hefei230039;2.BeijingInstituteofBiotechnology,Beijing100850;3.ShanxiKangbaoBiologicalProductCo.Ltd,Changzhi046000;China*Correspondingauthor,E-mail:liuzhm@vip.sina.com
［Abstract］Pichiapastorishasbeenutilizedwidelyasanexcellentheterologousgeneexpressionsystemrecently.High-densityfermentationhasbeenakeytechniquetachetoimprovetheexpressionleveloftheproteinofinter⁃
est.Inthispaper,weexpoundedthechooseofengineeringbacteria,designationandoptimizationofculturemedi⁃um,andcontroloffermentationcoursetoincreaseP.pastorisonhigh-densityfermentation.Moreover,thequestionsexistinginindustryhigh-densityfermentationwereputforward.
［Keywords］Pichiapastoris;high-densityfermentation;optimizationofculturemedium;controloffermentationcourse
综述doi:10.3969/j.issn.1009-0002.2013.01.02620世纪80年代以来，随着生物技术药物在人类
疾病治疗和预防中的广泛应用，大大加速了微生物细胞表达产品的产业化进程。近20年来，毕赤酵母大规模培养已成为生物制药领域非常重要的关键技术之一，并不断推动生物技术产业的迅速发展。毕赤酵母表达系统在表达外源蛋白方面具有非常明显的优势，这是因为毕赤酵母本身为单细胞真核生物，易于分子遗传学操作，且外源基因可以整合到酵母的染色体上，随染色体一起复制和遗传，不易造成外源基因的丢失现象；具有强诱导性和强启动性的醇氧化酶基因启动子，适用于外源基因的高水平诱导表达；并且毕赤酵母在高水平表达外源蛋白的同时，自身背景蛋白分泌却很少，不需要破菌等复杂操作，有利于后续纯化；毕赤酵母发酵产物的积累不会对自身宿主菌产生大的毒副作用，这更有利于大规模的高密度发酵。目前，越来越多的国内外研究者选择毕赤酵母作为外源蛋白的优先表达系统，表达产物包括干扰素、白介素2、抗体等[1-3]，且已有产品上市。尽管毕赤酵母有自身的优点，但对于不同的具体目标产品，表达水平参差不齐。如胞内分泌表达的巴西三叶胶腈水解酶的产量高达22g/L[4]，破伤风片段C产量高达12g/L[5]，胞外分泌表达的明胶的产量达到14.8g/L[6]等，而最低的报道只有1mg/L，其间相差可达10000倍。因此，要提高目的蛋白的表达水平，高密度发酵（high-densityfermentation）也成为一个关键技术环节。
1毕赤酵母工程菌的选择和改良
1.1工程菌的选择
目前毕赤酵母工程菌株常常呈现2种表型，分别为mut+和muts，aox1基因缺失的酵母在甲醇限制性培养基上生长缓慢（methanolutilizationslow，muts或mut-
），它们只能利用弱的aox2基因启动合成
收稿日期：2012-08-20基金项目：国家高技术研究发展计划（2009AA02Z108）作者简介：夏姗（1990-），女，硕士研究生通信作者：刘志敏，（E-mail）liuzhm@vip.sina.com
109生物技术通讯LETTERSINBIOTECHNOLOGYVol.24No.1Jan.,2013
醇氧化酶（AOX），而aox1基因完整的酵母则生长正常（mut+）。目前这2种表型的毕赤酵母菌株在高密度大规模表达时均有使用，主要根据具体的外源蛋白来选择，如根据表达产物的分子大小、降解产物的多少、蛋白折叠程度等性质选择工程菌的表型。如考虑到后续产品的制备，一般选用无缺陷的mut+菌株，对外源蛋白适用性好，便于发酵控制[7]；如果是胞内表达，应尽量用muts菌株，这样得到的蛋白产物中AOX较少而目的蛋白量相对较多（占毕赤酵母总分泌蛋白量的30%~90%，使下游纯化更易进行[8]）。1.2对重组转化子的筛选为了获得高产量的表达菌株，就需要对大量转化子进行筛选，这就要求人们在考察菌体对表达产物表达水平的同时，也要考虑到该表达系统对表达产物的影响。如果工程菌表达系统中表达产物容易降解或易受培养基成分的影响，需要考虑表达产物是选择分泌表达还是细胞内表达。2培养基的设计和优化目前在毕赤酵母表达外源蛋白的培养过程中，主要使用不同大小的生物反应器，采取补料-分批发酵（fed-batch）工艺，包括基础培养相、流加补料相（进一步提高菌体密度）和诱导表达相的三相发酵，而高密度发酵培养主要是通过基础培养相来实现菌种的生长、增殖，再通过流加补料相进一步使菌体大量增殖与累积，从而达到高密度菌体。2.1基础培养基的选择补料-分批培养中的培养基的组分直接影响细胞的生长和外源基因的表达。在毕赤酵母高密度培养时，培养基主要包括BMGY/BMMY、BMG/BMM和BSM，也有部分使用MGY/MMY培养基。基础盐培养基（BSM）在低pH值条件下处于溶解状态，但在高pH值条件下易产生盐沉淀，所以在生产时一般使用低浓度的盐或优化后的培养基。BMGY/BMMY、BMG/BMM培养基中包含磷酸盐缓冲液，可以维持培养基中的pH值保持相对恒定，适用于对pH值敏感的表达产物的表达，但由于培养基组分和多步操作，在生产中容易引起污染。由于表达产物的特殊性和多样性，在分批培养过程中需要对培养基进行筛选和优化。另外，为了保护目的产物的活性和不被降解，须在培养基中添加蛋白酶抑制剂或EDTA等保护剂，以降低蛋白酶对表达产物的降解[9]。2.2补料培养基的补加方式目前毕赤酵母发酵过程中的补料培养基主要成分为葡萄糖和甘油，含诱导型启动子的菌株一般在甲醇和甘油或甲醇和葡萄糖的培养基中生长[10]；而组成型启动子［如甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因的启动子］则可以不需要甲醇的诱导在含葡萄糖的培养基中正常生长[11]。葡萄糖作为碳源性价比较高，有利于工业化生产；甘油作为毕赤酵母的碳源，效果优于葡萄糖，但其浓度过高和过低均会影响菌体的生长。为了实现菌体高密度发酵的同时又有利于大规模生产，许多研究者对补料方式做了深入细致的研究，主要包括间歇式补料发酵、恒速流加补料发酵、指数流加发酵及在不同时期综合考虑的流加方式[12]。间歇式补料发酵是最常见的流加发酵方式，即每隔一段时间补料一次；恒速流加补料发酵，以恒定流速补加培养基，直到诱导表达开始；指数流加发酵是随微生物生长同步补加的方式，在一定范围内菌体量随时间以指数函数增加，所以流加补料也随时间以指数函数增加，这种流加需要对菌体的生长速率有准确的把握，其生长速率的大小也会影响菌体的生长。Cunha等在研究scFv受体片段的发酵过程中，发现在诱导阶段细胞浓度和甲醇的摄取率是对表达量影响最大的因素[13]。在规模化大生产过程中，补料方式的选择要综合考虑生产成本和菌体增殖，同时要考虑到补料对目的表达产物的影响。目前有研究采用时间分段，各段采用不同的补加方式，既有利于菌体的生长又有利于培养基的完全利用。
3发酵过程控制
目前，对毕赤酵母的高密度发酵培养的过程控制策略呈多样化，比如对影响菌体生长的各个因素的控制、对细胞生长速率的控制、反馈控制和对培养基成分浓度的控制等，但各控制之间关联因素多，无法形成一个合理的模型控制，需要进一步探索。3.1发酵过程参数的控制
3.1.1溶氧的控制对于毕赤酵母而言，发酵培养
中的溶解氧是影响生长表达的关键因素。高密度发酵需要消耗大量氧气，尤其在菌体快速生长期间，供氧往往成为菌体大量生长的限制因素，保证氧气的供给成为高密度发酵的重要因素。培养基中溶解氧的提高主要受通气量、搅拌速度、罐压的直接影响，以及温度、补料速度等的间接影响，因此溶解氧可以反映出菌体生长情况。为了提高溶解氧的浓度，生产上开始采用纯氧和空气按一定比例混合通气的方式来提高供氧能力，尽力解决由于缺氧带来的限制。但是，也有研究表明氧浓度太高会抑制菌体的生长和繁殖[14]。3.1.2温度的控制温度对菌体的生长和发酵的影
响是各种因素综合表现的结果。温度对毕赤酵母发
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