植物基因转化及转基因植物地分析报告与鉴定
植物细胞的遗传转化文稿演示
1 转基因植物
1.1 受体
• 叶盘 • 原生质体 • 悬浮细胞 • 愈伤组织 • 胚状体 • 活体 • 等等
1.2 转基因方法
直接转化法 : 基因枪法 载体介导法：农杆菌介导法
1.2.1 直接转化法 基因枪法
**最早的基因枪（火药式）由美国康乃尔大学Sanford等 1987年设计制造 。
基本原理
抗逆-盐害
野生型油菜和转基因（AtNHX1）油菜经 200mM NaCl 处理10 周
抗逆-冻害
Ti质粒的功能区域
T-DNA的染色体整合机制
消毒
切取
土壤农杆菌 浸泡
叶盘
培养基
愈伤组织 分化幼苗
植物受体
抗生素筛选
分化出苗
生根壮苗
其它方法
植物病毒感染法 花粉管通道法 电穿孔转化法 激光微束穿孔转化法 显微注射法 超声波介导转化法 多聚物介导法 浸渍法 电泳法 碳化硅纤维介导法 真空渗透法 圆球体法 等等
2. 基因改良植物
除草剂 干旱
品质
盐害 冻害
非生物胁迫 生物体
热害
涝害
其他性状
虫害作物品种改良中的应用
抗虫 抗病毒 抗病 抗非生物胁迫 抗除草剂 改良作物品种 改变花的颜色和形状 转基因植株作为生物反应器
抗病大豆
（A）萎黄病（箭头所指）感染
野生型 转基因
抗病烟草
野生型
转基因
（B） 外源基因抵抗TMV对烟草的感染。 接种后11天 症状（箭头）
抗除草剂
占总转基因植 物种植面积的 77％，其中主 要为抗除草剂 大豆。
转基因
野生型 野生型
野生型
转基因
转基因
用0.1%草苷膦处理大豆叶片 具有除草剂抗性的大豆
转基因植物
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点， 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义，已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程： 就是重组DNA技术，指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组， 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子，然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达，使宿主细胞获得新的遗传特 性，产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区（virulence region）： ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移，
使农杆菌表现出毒性，故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区（transferred-DNA regions）：
产生白化苗，且由于 PEG法对原生质体活力 有害，转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”，(见
书本图10-1 B)，有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例： ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
植物病理学中的抗病基因筛选与转基因抗病品种培育
植物病理学中的抗病基因筛选与转基因抗病品种培育植物病理学是研究植物疾病的发生、发展和防治的学科。
抗病基因在植物病理学中起着重要作用，它们能够为植物提供抗病性，减轻植物受病害侵袭的程度。
对于农作物来说，培育抗病品种是实现农业可持续发展的重要途径之一。
本文将从抗病基因筛选和转基因抗病品种培育两个方面展开探讨。
一、抗病基因筛选抗病基因的筛选是培育抗病品种的前提。
通过筛选和鉴定抗病基因，可以为后续的转基因培育提供基础。
目前，抗病基因筛选主要采用两种方法：传统方法和现代生物技术方法。
1. 传统方法传统方法是指对不同品种的植物进行交配、选育，并通过后代的表现来判断其抗病性。
这种方法主要依赖于人工选择和观察的经验。
例如，在番茄品种中，通过选育具有抗番茄黄色叶病毒（ToLCNDV）的亲本，再进行交配和杂交，最终获得抗病的番茄品种。
然而，传统方法存在着一些局限性，如耗时、成本高、效率低等问题。
2. 现代生物技术方法现代生物技术方法使抗病基因的筛选更加高效。
其中，分子标记辅助选择技术和全基因组关联研究是主要的方法。
分子标记辅助选择技术通过分析与抗病基因相关的DNA标记，可以准确预测植物的抗病性。
全基因组关联研究则是通过测定大量的遗传标记与表型（抗病性）之间的相关性，来鉴定抗病基因。
这些技术使得抗病基因的筛选更为精准、高效。
二、转基因抗病品种培育转基因技术是指通过外源基因的导入和表达，使植物表现出特定的性状，从而达到培育抗病品种的目的。
转基因抗病品种培育经历了以下几个步骤：1. 基因克隆和基因功能验证首先，从抗病品种中克隆并鉴定出具有抗病功能的基因。
通过基因克隆的技术手段，如PCR、基因组文库等，将具有抗病性的基因分离出来，并进行功能验证。
这一步骤的目的是确保转入的基因具有预期的抗病效果。
2. 基因转化通过农杆菌介导、基因枪等方法，将已经验证过功能的抗病基因导入到植物细胞中。
植物细胞会通过自身的复制和分化过程，形成具有转基因抗病基因的植株。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是指通过外源DNA的导入，使植物细胞或组织发生基因改变，从而获得具有特定性状的转基因植物。
这一技术在农业、医学和工业等领域有着广泛的应用。
下面将介绍植物遗传转化的基本步骤。
步骤一：选择外源DNA在植物遗传转化中，首先需要选择外源DNA，也就是我们要导入到植物细胞中的目标基因。
这个目标基因可以来自于其他物种，也可以是人工合成的。
目标基因的选择取决于我们希望在转基因植物中表达的特定性状。
步骤二：构建转化载体将目标基因导入植物细胞需要使用载体。
载体是一种专门设计用于植物遗传转化的DNA分子。
通常，载体由多个组成部分组成，包括启动子、终止子、选择标记和目标基因。
这些组成部分的功能是确保目标基因能够在植物细胞中正确表达。
步骤三：转化载体导入植物细胞一旦构建好转化载体，接下来就需要将其导入到植物细胞中。
目前，有多种方法可以实现这一步骤，包括农杆菌介导转化、基因枪法和电穿孔法等。
这些方法都可以有效地将外源DNA导入植物细胞，使其成为转基因细胞。
步骤四：筛选转基因细胞一旦植物细胞被导入外源DNA，我们需要对其进行筛选，以确定哪些细胞成功地获得了目标基因。
为了实现这一步骤，常常会在转化载体中加入选择标记基因，如抗生素抗性基因。
只有携带了目标基因的细胞才能存活下来，而其他细胞则会被筛选掉。
步骤五：培养和再生转基因植物筛选出的转基因细胞可以通过培养和再生来获得完整的转基因植物。
这一过程通常需要在培养基上进行，通过提供适当的营养物质和激素来促进细胞分裂和分化。
经过一段时间的培养，转基因细胞可以发展成为转基因植物。
步骤六：鉴定转基因植物需要对获得的转基因植物进行鉴定，以确认其是否成功地获得了目标基因。
这一步骤通常需要使用分子生物学技术，如PCR和Southern blot等，来检测目标基因的存在和表达。
只有经过鉴定的转基因植物才能用于进一步的研究或应用。
总结：植物遗传转化是一项复杂的技术，需要经历多个步骤才能成功。
gus报告基因
gus报告基因GUS报告基因。
GUS报告基因是一种用于植物基因表达研究的重要工具。
它是由β-葡萄糖苷酶（β-glucuronidase）基因构建而成，可以被广泛地应用于植物遗传转化和表达分析中。
GUS报告基因的研究对于理解植物基因表达及其调控机制具有重要意义。
首先，GUS报告基因可以用于植物遗传转化的研究。
通过将GUS报告基因导入植物细胞，可以观察到该基因在植物体内的表达情况。
这对于研究外源基因在植物中的表达特点以及转基因植物的遗传稳定性具有重要意义。
通过对GUS报告基因的研究，可以更好地了解植物转基因技术的应用前景及其潜在风险。
其次，GUS报告基因也可以用于植物基因表达分析。
通过将GUS报告基因与目标基因进行融合，可以观察到目标基因在植物体内的表达情况。
这对于研究目标基因在不同组织和发育阶段的表达模式，以及其受到外界环境因素影响的调控机制具有重要意义。
通过对GUS报告基因的研究，可以更好地了解植物基因表达调控的分子机制及其在植物生长发育过程中的作用。
此外，GUS报告基因还可以用于植物转基因技术的研究与应用。
通过对GUS报告基因的表达情况进行定量和定位分析，可以更好地评估转基因植物的表达效率和稳定性。
这对于改良转基因植物的遗传背景和表达性能具有重要意义。
通过对GUS报告基因的研究，可以更好地指导植物转基因技术的开发和应用，为农业生产和生物技术研究提供有力支持。
综上所述，GUS报告基因在植物基因表达研究中具有重要的应用价值。
通过对GUS报告基因的研究，可以更好地理解植物基因表达及其调控机制，促进植物遗传转化和基因功能研究的进展，为植物生物技术的发展和应用提供重要支持。
因此，对GUS报告基因的深入研究具有重要的理论和实际意义，值得进一步深入探讨和应用。
白豌豆的遗传转化与基因功能验证
白豌豆的遗传转化与基因功能验证白豌豆（Pisum sativum），作为一种重要的农作物和园艺植物，广泛种植于全球各地。
在农业生产中，白豌豆的耐逆性、抗病性等基因功能非常重要。
为了更好地改良白豌豆的性状并提高产量，科学家们不断进行白豌豆的遗传转化与基因功能验证研究。
遗传转化是指在基因工程中将外源基因导入到目标植物中，从而改变其遗传特性的过程。
对于白豌豆来说，遗传转化技术有助于引入具有特定功能的基因，以提高其抗病性、耐逆性等重要性状。
首先，科学家们必须确定适合用于白豌豆的遗传转化方法。
目前常用的方法包括农杆菌介导的基因转化和生物物理手段导入基因等。
在农杆菌介导的基因转化中，科学家们将目标基因组插入细菌Agrobacterium tumefaciens，然后将其转移到白豌豆的组织中。
而生物物理手段则包括基因枪法和电穿孔法等，通过物理力量将外源DNA直接导入到白豌豆的细胞中。
一旦成功进行了遗传转化，接下来的关键是验证导入基因的功能是否有效。
基因功能验证是判断转基因植物是否具有期望性状的过程。
对于白豌豆来说，基因功能验证可包括对抗病性、耐逆性等性状的研究。
抗病性是农作物育种中非常重要的性状之一。
通过基因转化技术，科学家们可以引入具有抗病性基因的DNA到白豌豆中。
在基因功能验证中，科学家们需要利用不同的病原体进行感染实验，观察转基因白豌豆的抗病能力。
这些病原体可能包括细菌、真菌等，可以是常见的白豌豆病原体，也可以是其他农作物病原体。
通过观察转基因白豌豆的抗病程度和病症表现，可以评估引入基因是否有效。
耐逆性是另一个重要的基因功能。
白豌豆在生长过程中会面临各种环境胁迫，如干旱、高温等。
通过基因转化技术，科学家们可以导入一些耐逆性基因，帮助白豌豆在恶劣环境中生长和发育。
基因功能验证中，科学家们可以对转基因白豌豆和野生型白豌豆进行比较实验，观察它们在干旱和高温等胁迫条件下的表现。
通过测量生长指标、叶绿素含量、抗氧化酶活性等参数，可以评估转基因白豌豆的耐逆性。
基因工程实验报告
基因工程实验报告引言基因工程是现代生物技术的一个重要分支，通过对生物体基因的修改和重组，可以创造出具有特定功能的生物体。
本次实验旨在探究基因工程在农业、医学等领域的应用，以及可能带来的潜在风险和争议。
实验方法1. 筛选目标基因：首先，我们在实验中选择了对叶绿体功能有重要影响的一个基因作为目标基因。
2. 基因克隆：通过PCR技术，将目标基因从细菌DNA中放大，然后将其插入载体DNA中。
3. 转化目标生物体：将重组的载体DNA转入植物叶片细胞中，借助几丁质体、热激冲击等方法促使基因转化成功。
4. 筛选阳性转化率：通过筛选培养基中的抗性选择制剂，筛选出转化成功的阳性细胞。
5. 验证目标基因的表达：通过PCR扩增和基因芯片技术验证目标基因在转化植物中的表达情况。
实验结果1. 实验结果显示：我们成功将目标基因插入到植物叶片细胞的染色体中，并且获得了一定比率的阳性转化植株。
2. 鉴定转化植株：对转化植株进行证实鉴定，确保目标基因已经整合到植株基因组中，且稳定表达。
3. 表达验证：通过PCR扩增和基因芯片分析，确定目标基因在转化植物中得到了表达，并且表达量较高。
4. 性状鉴定：对转化植物进行生长发育、形态结构、生理生化等方面的综合性状鉴定，结果显示转化植物与野生型无显著差异。
讨论基因工程技术的应用：本次实验展示了基因工程技术在农业生产中的应用前景，通过将具有耐逆性、抗病虫害等功能基因导入植物，可以提高植物的产量和抗逆性。
潜在风险和争议：但是，基因工程也伴随着一系列争议和风险，如转基因植物可能对环境造成影响，转基因食品可能对人体健康产生潜在影响，因此需要严格的监管和评估。
结论通过本次实验，我们成功地验证了基因工程技术的可行性，展示了其在农业和生命科学领域的广阔应用前景。
然而，我们也要看到基因工程技术所带来的潜在风险和争议，需要谨慎评估和监管。
基因工程是一把双刃剑，只有正确使用才能实现其最大的利益。
愿基因工程技术为人类带来更多福祉。
转基因植物的筛选与检测
8
• Western 印迹是将蛋白质从 SDS-PAGE胶 中电泳转移至固相支持体上 , 然后对固定化 蛋白质进行免疫学测定的方法。 • 特点：
1
一、筛选的方法与原理
• 通过特定基因在转化体内的表达，利用特 定的试剂，选择出来转化细胞。
• 注： 1.特定基因又称“抗性基因” 2.表达方式：蛋白质的合成、酶的失活等
表“植物遗传转化中的选择试剂及其抗性基因”
2
3
二、检测的方法与原理
• 利用特定基因在转化体内的表达，对其表 达产物进行检测。
扩增产物经琼脂糖凝胶电泳 ，染色后很容易观察， 不通过杂交分析就可以鉴定出基因组中的一些顺 序。材料用量少，检测方便，可以在试管苗阶段， 甚至对愈伤组织进行检测，了解转化早期的信息， 便于及时优化试验方案。DNA提取方便，适合于 大批量样品分析，又能检测目的基因的完整性， 是早期检测的一种较好方法。
• 注意： • 此过程最重要的是保持各DNA片段的转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素 膜（NC膜）、尼龙膜（Nylon） 、化学活化膜和 滤纸等。
13
Western
• • • • • • 1.制胶及上样 2.电泳 3.转膜 4.封闭 5.抗体孵育 6.曝光显影
10
Southern杂交
• • • • • • • 1.提取DNA 2.电泳 3.变性 转移 DNA 印迹 4.转膜 5.固定DNA 6.探针的标记 7.杂交与检测（NBT/BCIP显色）
膜
11
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实用文档 文案大全 植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 〖实验目的〗 1． 了解创建烟草突变体库的方法； 2． 理解每种方法的基本原理； 3． 掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。 〖实验原理〗 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成，在此基础上开展功能基因组的研究是目前的核心研究内容之一。植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容，在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。在创制突变体的策略上，传统方法是使用物理或化学诱变方法获得，其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。与传统的物理和化学诱变方法相比，生物诱变(T-DNA和转座子插人诱变)通常可标记突变基因，从而较为容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的T-DNA插入突变已成为国际公认的植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物，其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中的重要内容，其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功能。突变体的创制是遗传学研究的基础，也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。通过诱导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现T-DNA标签在烟草愈伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性愈伤组织获得烟草突变体再生植株，获得各突变体的纯合材料，从而建立烟草突变体的数据库，然后分析突变性状与T-DNA的共分离关系，存在共分离的材料用适当的Tail-PCR克隆技术获得T-DNA的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再进行下一步的分析（图实验4-1）。
T-DNA 载体构建
转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 实用文档
文案大全 筛选T2，获突变子，应为3:1分离
确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆T-DNA两侧的植物DNA（Tail PCR) 利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能） 图实验4-1 T-DNA标签克隆基因的基本流程 TAIL-PCR分离法是利用多个嵌套的T-DNA插入序列特异性引物（根据T-DNA中靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62℃和一个短的随机简并引物（AD，Tm值44-46℃）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次PCR反应，采取高温特异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA插入侧翼区特异性扩增片段（实验图4-2），可作为探针，筛选分离基因。 TAIL-PCR分离法可以降低非侧翼区特异产物的背景，同时它可以产生2个以上嵌套的目的片段，与其它方法相比TAIL-PCR方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了成功及广泛的应用。 实用文档
文案大全 实验图4-2 TAIL-PCR反应流程图 本实验用含T-DNA载体质粒pCAMBIA1301的LBA4404农杆菌菌株转染烟草愈伤组织，让T-DNA随机插入烟草的基因组中形成T-DNA突变体，通过PCR特异扩增HPT基因片段来鉴定转基因烟草， 以TAIL-PCR法获得转基因烟草突变体的侧翼基因片段，测序后将获得侧翼基因片段的序列与GeneBank中的已知序列对比，获得功能基因的全序列。
〖仪器、材料和试剂〗 （一）仪器
高速冷冻离心机，PCR仪，超净工作台，恒温摇床，隔水式恒温培养箱，光照培养箱，紫外可见分光光度计，凝胶成象仪或Dark Reader，恒温水浴锅，微孔加热器，电泳仪，水平板电泳槽，天平，酸度计，旋涡混合器。 实用文档 文案大全 （二）材料 烟草幼苗，含T-DNA载体质粒pMD83rc的LBA4404农杆菌菌株，Ex-taq DNA 聚合酶，DNA 1kb laddeer，GoldView核酸染料。
（三）试剂 1. 2×CTAB提取液 100mmol/L Tris-HCl pH8.0 2％（w/v）CTAB 1.4mol/L NaCl 40mmol/L b-巯基乙醇 20mmol/L EDTA 2. TE缓冲液 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 1mmol/L EDTA
3. 50´TAE电极缓冲液 1000ml Tris 54g 硼酸 27.5g 0.5mol/L EDTA 20ml
4. 10％次氯酸钠 5. 氯仿：异戊醇(V:V，24：1) 6. 70％乙醇 7. 溶液I：50 mmol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris.HCl（pH8.0），10 mmol/L EDTA（pH8.0）100ml
8. 溶液III：60ml 5mol/L乙酸钾，11.5ml 11.5％冰乙酸，28.5ml无菌水100ml 9. 溶液II：分别配制0.4 mol/L NaOH和2％SDS溶液（各30ml），用时1:1混合 10. LB液体培养基 实用文档 文案大全 配制每升培养基，应在950mL去离子水中加入： 胰蛋白胨(bacto-typtone) 10g 酵母提取物(bacto-yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，加入200uL 5mol/L NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1升，121℃高压灭菌20分钟。
11. MS基本培养基 大量元素 mg/L 微量元素 mg/L 有机营养 mg/L NH4NO3 1650 KI 0.83 甘氨酸 2.0 KNO3 1900 H3BO3 6.2 烟酸 0.5 CaCl2·2H2O 440 MnSO4·4H2O 22.3 盐酸吡哆醇（Vb6） 0.5 MgSO4·7H2O 370 ZnSO4·7H2O 8.6 盐酸硫胺素（Vb1） 0.l KH2PO4 170 NaMoO4·2H2O 0.25 肌醇 100 CoCl2·6H2O 0.025 CuSO4·5H2O 0.025 FeSO4·7H2O 27.8
配制方法 母液： 大量元素（50×） 400mL 硝酸铵 33g；硝酸钾 38g；磷酸二氢钾 3.4g；七水合硫酸镁 7.4g； 铁元素（100×） 200mL 七水合硫酸亚铁 0.556g；七水合EDTA二钠 0.746g； 有机营养（100×） 200mL Gly 0.040g；VB1 0.002g；VB6 0.010g；肌醇 2g；烟酸 0.010g； 实用文档 文案大全 微量元素（1000×） 200mL 碘化钾 166mg；硼酸 1240mg；一水合硫酸锰 3380mg；七水合硫酸锌 1720mg；二水合钼酸钠 44mg；五水合硫酸铜 5mg；六水合氯化钴 5mg；
氯化钙（50×） 400mL 氯化钙8.8g 12. 愈伤组织诱导与分化培养基：MS基本培养基 ＋ 0.2mg/L 6-BA＋0.02mg/L NAA ＋ 3%蔗糖 ＋ 0.6%琼脂
其中6-BA 取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL； NAA取25mg用少量1M NaOH溶解后定容到50mL； 2,4-D取50mg用少量1M NaOH溶解后定容到100mL； 以上激素母液均为0.5mg/mL 13. 筛选培养基：MS基本培养基＋0.2mg/L 6-BA ＋ 0.02mg/L NAA＋3%蔗糖＋0.6%琼脂＋100mg/L羧苄青霉素
14. 抗生素母液的配制 KANA（50mg/mL） 1g KANA溶于20mL蒸馏水； RIF（50mg/mL） 0.25g RIF溶于少量乙醇再定容至50mL； STR（30mg/mL） 0.6g STA溶于20mL蒸馏水； 羧苄青霉素（100mg/mL） 2g羧苄青霉素溶于20mL蒸馏水。 潮霉素B（50mg/mL） 可以直接购买 〖实验步骤〗 I 烟草外植体的无菌培养和诱导再生
1. 烟草叶片预培养： 取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。 实用文档 文案大全 2. 烟草叶片的诱导再生：自行设计MS培养基中的NAA、6-BA植物激素浓度，诱导烟草叶片生根或生芽；将上述处理过的无菌叶片接种在含有不同浓度植物激素的MS固体培养基中，每周定期观察并更换培养基。 II 转基因烟草的培养
1. 农杆菌的培养：将含T-DNA载体的农杆菌单菌落接种到20ml LB液体培养基中（Kana 50ug/ml、RIF、STR）， 27℃，180r／min振摇培养过夜。将2ml菌液转入20ml LB液体培养基中，与上述的相同条件培养6小时左右，使菌液达到OD600＝0.2～0.5，用来侵染烟草叶片 。
2. 烟草叶片预培养： 取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。在超净工作台中将叶片浸于70％酒精中30秒，然后移入10％的次氯酸钠溶液中5～10分钟（消除外植体表面的微生物）。无菌水至少洗涤3次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每次停留3～5min。将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。
3. 愈伤组织转化：在80r/min摇床上旋转浸染5～10分钟。将叶外植体置于无菌滤纸上吸去多余的菌液（如果叶片粘附细菌过多，可以在无菌水中漂洗1～2次）。
4. 共培养：将侵染过菌液的叶片接种在MS愈伤组织诱导和分化培养基上，在26℃黑暗条件下共培养3天。
5. 筛选培养与分化：将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上（100ug/L羧苄青霉素和50ug/L潮霉素B，羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用。如果农杆菌生长未被抑制，农杆菌将抑制叶外植体的生长）。每隔3～4天继代一次，培养条件为，光照2000lx，温度26℃，日照16h。4周后转基因细胞分裂生长形成大量愈伤组织并有根、芽分化。接种烟草叶片于无激素的MS培养基上培养，培养条件同上，同时作为对照实验（无愈伤组织生长和器官分化）。
Ⅲ 转基因烟草的检测 1. 剪取培养后的转化烟草和前期实验未转基因烟草叶片小片，液氮中研磨至粉末状，加入0.5mL65℃预热CATB抽提液65℃水浴抽提30min，间歇混匀；
2. 取上清各加入0.5mL氯仿异戊醇（体积比24:1）去除蛋白，12000rpm离心10min；