青霉素的发酵生产过程

原理
7.1.5 发酵设备灭菌方法
(1)实罐灭菌： a．预热（80～90℃）
b．直热（蒸汽）（120℃、30min） （全进全出原则 c．待空气压力高于罐内压力时，通 入空气。 (2)空罐灭菌：130℃，45～60min，直 接蒸汽法 (3)连续灭菌：配料（预热）。冷却系统 水应排净（夹套与盘管）→连消塔→维 持罐→冷却管→无菌培养基。 (4)空气过滤除菌
（1）丝状菌三级发酵工艺流程
冷冻管（25°C，孢子培养，7天） → 斜面母瓶（25°C， 孢子培养，7天） → 大米孢子（26°C，种子培养 56h,1:1.5vvm） → 一级种子培养二级种子培养液（27~26°C,发酵,7
天,1:0.95vvm） → 发酵液。
金色葡萄球菌是一种常见的病原菌，弗莱明从事的就是 此方面的研究。金色葡萄球菌耐盐度高，培养基为了保证菌 种纯正会加入限制其他菌种生存的物质。有一次他忘记在培 养基中加入高浓度食盐，并且没有盖上盖子与空气隔绝，不 久之后培养长出了青霉。
由于工作上的疏忽，使得培养基上长出青霉，这本来是 一件司空见惯的事情。但是恰巧的是弗莱明这次没有习以为 常。他将培养基放在显微镜下观察，发现青霉生长的菌落， 金色葡萄球菌都出现了死亡。他意识到青霉可以制造一种可 以抑制葡萄球菌生长的物质。当然这就是青霉素。
b．溶酶萃取法
c . 沉淀法
（3）发酵液预处理方法:
A.菌体和蛋白质处理： a．等电点沉淀 b．变性沉淀（热变性沉淀） c．加各种沉淀剂沉淀：重金属离子和阴离子 d．加入凝 聚剂：Al2(SO4)3•18H2O、AlCl3•6H2O、FeCl3、ZnSO4等 e．加入絮凝剂，如酰胺类 f.吸附法：加入黄血盐和硫酸 锌生成亚铁氰化锌钾 g.酶解法去除不溶性多糖：酶解不 溶性多糖和蛋白质。 B.高价金属离子的去除: a.离子交换法 b．沉淀法 C.发酵液的液固分离设备： a．压滤设备：板框 b．吸滤设备：真空鼓式吸滤 机（自动化） c．离心过滤设备：框式离心机
包括氯唑西林、双氯西林、苯唑西林等，本组青霉素对产β 内酰胺酶葡萄球菌属有良好作用。
4、抗假单胞菌青霉素类：
包括羧苄西林、美洛西林、哌拉西林、替卡西林等。
3 青霉素的发现
青霉素发现以前，因为伤口细菌感染导致的伤口恶化， 是困扰医学界一个很大的难题，这让即使手术成功的病人还 是不得不承受着很大的生命危险。
7.1.3青霉菌的生长过程
分生孢子发芽期
菌丝繁殖期 脂肪粒形成期 菌丝生长期
脂肪粒减少，小空孢
大空孢 自溶 青霉素分泌期
菌丝自溶期
(1)菌体生长阶段：
发酵培养基接种后生产菌在合适的环境中经过短时间的 适应，即开始发育、生长和繁殖，直至达到菌体的临界浓度。
(2)青霉素合成阶段：
这个阶段主要合成青霉素，青霉素的生产速率达到最大， 并一直维持到青霉素合成能力衰退。在这个阶段，菌体重量 有所增加，但产生菌的呼吸强度一般无显著变化。
（8) 发酵液质量控制
生产上按规定时间从发酵罐中取样 , 用显微镜观察菌丝形 态变化来控制发酵。根据 镜检 中菌丝形变化和代谢变化的其他 指标调节发酵温度, 通过追加糖或补加前体等各种措施来延长发 酵时间, 以获得最多青霉素。
当菌丝中空泡扩大、增多及延伸, 并出现个别自溶细胞, 这
表示菌丝趋向衰老, 青霉素分泌逐渐停止, 菌丝形态上即将进入 自溶期, 在此时期由于茵丝自溶, 游离氨释放, pH 值上升, 导致青 霉素产量下降, 使色素、溶解和胶状杂质增多, 并使发酵液变蒙 古稠, 增加下一步提纯时过滤的困难。 因此, 生产上根据镜检 判断, 在自溶期即将来临之际, 迅速 停止发酵, 立刻放罐, 将发酵液迅速送往提炼工段。
5 青霉素的药理作用
青霉素药理作用是干扰细菌细胞壁的合成。青霉素的 结构与细胞壁的成分粘肽结构中的D-丙氨酰-D-丙氨酸近似， 可与后者竞争转肽酶，阻碍粘肽的形成，造成细胞壁的缺 损，使细菌失去细胞壁的渗透屏障，对细菌起到杀灭作用。 以下为可用青霉素的疾病：
1 2 3 4 5 6 7 8 9
流行性脑脊髓膜炎 放线菌病 淋病 奋森咽峡炎 莱姆病 多杀巴斯德菌感染 鼠咬热 李斯特菌感染 除脆弱拟杆菌以外的许多厌氧菌感染
分子式：C16H18N3O4S· HCl
2 青霉素的种类
1、天然青霉素：
包括青霉素G、青霉素V。主要作用于革兰氏阳性菌、革兰 氏阴性球菌、和某些革兰氏阴性杆菌。
2、氨基青霉素类：
包括氨苄西林、阿西莫林、巴氨西林、匹氨西林等。主要 用于对青霉素敏感的革兰氏阳性菌以及部分革兰氏阴性杆菌。
3、抗葡萄球菌青霉素类：
(3)菌体自溶阶段：
这个阶段菌体衰老，细胞开始自溶，合成青霉素能力衰 退，青霉素生产速率下降，氨基氮增加，PH上升。
7.1.4 发酵培养控制
（1）加糖控制。
加糖量的控制是根据残糖量及发酵过程中的 pH 值确定 , 最好是根据排气中CO2 量及 O2 量来控制, 一般在残糖降至 0.6% 左右, pH 值上升时开始加糖。 （2）补氮及加前体。
弗莱明
钱恩
弗罗里
4 青霉素的理化性质
青霉素本身为一元酸，可与钾、钠、镁、钙、铝和铵等化 合成盐类。 易溶于水，游离酸易溶于醇、酮、醚、酯等一般有机溶剂。 游离酸或盐类的水溶液均不稳定，极易失去抗菌效力。
不耐热，一般保存于冰箱中，但青霉素盐的结晶纯品，在 干燥条件下可于室温保存数年。
青霉素的抗菌效力与其分子中的β-内酰胺环有关。
青霉素的发酵生产过程
刘科梅
主要内容
青霉素的含义、种类、发现、作用
青霉素的生物合成 青霉素的发酵生产工艺
1 什么是青霉素？
青霉素（Penicillin），是抗菌素的一种， 是指分子中含有青霉烷，能破坏细菌的细胞 壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类 抗生素，是由青霉菌中提炼出的抗生素。
板框压滤机
7.2 青霉素提炼工艺流程图
发酵液 → 预处理液 → 板框过滤 → 滤液 → 储罐 → BA提取 → 脱色 → 过滤 → BA脱色液 → 结晶 → 离心分离 → 含１％水 重液回收溶媒的异丙醇洗涤 → 工业钾盐成品 → 甩滤 → 无水 异丙醇洗涤 → 甩干 → 摇摆机粉碎 → 烘干
（2）球状菌二级发酵工艺流程 冷冻管（25°C，孢子培养，6~8天） → 亲米（25°C，孢 子培养，8~10天）→ 生产米（28°C，孢子培养， 56~60h,1:1.5vvm） → 种子培养液（26~25-24°C，发酵， 7天，1：0.8vvm） → 发酵液。
7.1.1 菌种
目前国内青霉素生产菌按其在深层培养中 菌丝的形态分为丝状菌和球状菌两种，根据丝状 菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子 丝状菌，常用菌种为绿孢子丝状菌，如产黄青霉 素。
补氮：硫酸铵、氨、尿素，使发酵液氨氮量控制在 0.01%~0.05%。前体：发酵液中残存乙酰胺浓度为 0.05%~0.08%。 （3）pH控制。6.6~6.4。 （4）温度。前期25℃ ~26℃ ，后期23℃ 。以减少后期发酵液 中青霉素的降解破坏。 （5）溶解氧。不低于饱和溶解氧的30%。
（6）泡沫的控制。 由于在发酵过程中二氧化碳的不断产生，加上培养基 中有很多有机氮源含有蛋白质，因此在发酵罐内会产生大 量泡沫，如不严加控制，就会产生发酵液逃液，导致染菌 的后果。可以用天然油脂, 如豆油、玉米油等或用化学合成 消泡剂 “ 泡敌 ” 来消泡, 应当控制其用量并要少量多次加入, 尤其在发酵前期不宜多用, 否则会影响菌体的呼吸代谢。 （7）基质浓度。 在分批发酵中，常常因为前期基质量浓度过高，后期 基质浓度低，对生物合成酶系产生阻遏或对菌丝生长产生 抑制。为了避免这一现象,在青霉素发酵中通常采用补料分 批操作法,即对容易产生抑制和限制作用的基质维持一定的 最适浓度。
7.1.2 培养基
碳源：青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖等。 目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。 氮源：可采用玉米浆、花生饼粉、精制棉籽饼粉或麸皮粉 等有机氮源，及氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。 前体：为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需要在发酵 中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉菌有一定毒 性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次加入方式。 无机盐：包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子对青霉 菌有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在30ug/mL以下。
培养基
青霉菌的生长过程
发酵培养控制
发酵设备灭菌方法 发酵液的预处理与固液分离
7.1 青霉素的发酵阶段
青霉素发酵 ——
将青霉菌接种到固体培养基上培养一段时间，得到青 霉菌孢子培养物。用无菌水将孢子制成悬浮液接种到种子罐 内已灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，培养。然后将种 子培养液接种到发酵罐已灭菌的含有苯乙酸前体的培养基中， 通入无菌空气搅拌，培养。 青霉素发酵时，青霉素生产菌在合适的培养基、PH、 温度和通气搅拌等发酵条件下进行生长并合成青霉素。 发酵开始前，有关设备和培养基（主要是碳源、氮源、 前体和无机盐等）必须先经过灭菌，后接入种子。
6 青霉素的生物合成
7 青霉素的生产工艺过程
菌种 → 孢子制备 → 种子制备 → 发 酵 → 发酵液预处理及种子加滤 → 提取 → 精制→ 成品检验 → 包装 → 分装 → （应 用 → 跟踪 → 质量分析）
发酵阶段 提取阶段
菌种
发酵 7.1 阶段 青霉素 7. 生产工 艺过程
提取 7.2 阶段
7.1.6 发酵液的预处理和固液分离
(1) 稳定性 a． 对pH的稳定性，如：青霉素酸性不稳定；多粘菌 素酸性稳定；红霉素酸性不稳定，但碱性稳定 b . 对温度的稳定性，如：杆菌肽、灰黄霉素可在 90~100℃下加热过滤；而四环素、青霉素则需低温处理 （15~18℃）} (2) 提取工艺对滤液质量的要求 a．离子交换法