药敏实验流程

药敏实验流程 The pony was revised in January 2021

药敏实验

1.目的

提供细菌对抗菌药物的敏感试验的标准采集与操作方法，选择敏感药物用于临床。

2.范围

适用于实验室分离菌及常见菌的抗菌药物敏感试验。

3.采样对接人

服务专家针对病死猪进行解剖根据临床症状采集相应的病料。

4.设备和材料

无菌剪刀、无菌手术刀、无菌试管、无菌生理盐水、无菌平皿、三角烧瓶、酒精灯、接种环、打火机、75%酒精棉球、一次性手套、营养琼脂培养基、M-H琼脂培养基或特殊培养基、标准麦氏比浊管、药敏纸片、待测病料、记号笔、眼科镊子、2ml或5ml一次性注射器、试管架、超净工作台、恒温培养箱、带刻度直尺。

5.采样及送样操作

采集：病料新鲜度→无菌操作采样→有目的进行采样→保证组织完整性→独立存放到封口袋中并做好标记。

运输：采集好病料放入保温箱（泡沫纸箱+冰袋）中，冷藏即可，不可冷冻。

常见细菌分离采样部位

样品的标识

要求有样品编号、样品名称、样品来源、样品数量、初步诊结果抽样日期及周龄、检测项目等内容。

采样数量

猪一般采集3-5头，

6.细菌分离

在无菌操作条件下，将待测病料（含有典型临床症状部分）用平板划线分离法接种于普通营养琼脂培养基或特殊培养基上（血琼脂、SS琼脂、麦康凯琼脂、BP琼脂等），于37℃±1℃恒温培养箱中培养18-24h后备用。

细菌在培养基上生长特点

7.药敏试验操作步骤

制作待检菌液

在超净工作台内挑取培养18-24h普通营养琼脂平板上的菌落，悬于含3ml无菌生理盐水的试管中。混匀后与比浊管比浊，调整浊度至麦氏标准（相当于1-2*10 cfu/ml）。

接种细菌

在超净工作台内用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余的菌液，均匀涂抹整个平板表面，最后沿平板内缘涂抹一周（用接种环密集划线法也可以）。

贴药敏片

将涂抹均匀的培养皿底部用记号笔做好标记，眼科镊子在酒精灯上灼烧灭菌待冷却后，镊取各种购买或自制的药敏片，分别贴于相应的位置上，用镊子轻轻按压纸片使药敏纸片与培养基表面密贴；药敏纸片应在培养基表面均匀分布，各纸片中心距离大于

24mm，纸片距边缘距离大于15mm，这样一个直径90mm的培养皿可贴7个药敏纸片。

培养

最后将贴好药敏纸片的平板倒置放于37℃±1℃恒温培养箱培养16-18h后取出观察结果。

8结果观察与判定

抑菌圈直径观察

抑菌圈直径以肉眼见不到细菌明显生长的边缘为限（变形杆菌可蔓延生长至某些抗微生物的抑菌圈内，表现为一种细薄微弱的生长，形成一层明显的抑制性生长环，对于这种情况应忽略不计；对于磺胺类药物，应忽略抑菌圈内轻微的细菌生长，少于20%的菌苔，以明显的边缘为抑菌圈直径）。

根据药敏片周围抑菌圈的大小，判定药物的敏感度

敏感：表示被测菌株所引起的感染可以用常用量该抗菌药物治愈。

中介：表示被测菌株对常规用药体液或组织中的药物浓度的反应率低于敏感菌株，使用高于正常给药量有疗效。

耐药：表示被测菌株不能被常用剂量药物抑制，临床疗效不佳。

判定

不同菌株结果判定标准不同；不同药物判定标准不同。最终判定结果应以WS/T125-1999列表中对应的标准为准。也可以根据以下标准进行判定：

9.注意事项

要求待检病料新鲜、无污染。

整个试验操作过程注意无菌操作。

培养基厚度：要求厚度为4mm，直径90mm的培养皿约25ml/平皿；菌液一定要比浊；尽量选用同一品牌、大小相同的棉拭子涂布细菌；自制药敏片的厚度必须是新华1号滤纸。

药敏片保存：长时间不用放于-20冷冻保存，平时常用可放于4-8℃冷藏；药敏片从冰箱拿出要与室温平衡20min后打开盖使用，以免潮湿影响结果。

10.参考文献

《六和养殖事业部化验室标准操作规程（SOP）》-2007版。

《纸片法抗菌药物敏感试验标准》WS/T 125-1999。