生物催化剂的发现
酶
二、酶的生物学意义
6CO2+6H2O+能量
N2 + 3H2
某些微生物 植物 动物
C6H12O6+6O2↑
2NH3
N2+3H2
500℃ ,300大气压
Fe
2NH3
三、酶是生物催化剂
1．酶与一般催化剂的共同点
（1）用量少而催化效率高
（2）能加快化学反应的速度，但不改变平衡点，
反应前后本身不发生变化
（3）降低反应所需的活化能
（5）酶的催化活力与辅酶、辅基和金属离子有关
转换数（turnover number, TN or kcat）:
每秒钟或每分钟，每个酶分子转换底物的分子
数。(每秒钟或每分钟每摩尔酶转换底物的摩尔数)
（2）高度的专一性
一种酶只作用于 一种或一类化合 物，以促进一定 的化学变化，生 成一定的产物， 这种现象称为酶 作用的特异性。
酶的专一性有下列几种情况：
例 2H2O2→2H2O+O2
反 应 非催化反应 钯催化反应 H2O2酶催化
活化能 75.24kJ/mol 48.9kJ/mol 8.36kJ/mol
• （4）本身不发生化学变化。
2．酶作为生物催化剂的特殊点
（1）高的催化效率
以摩尔为单位进行比较，酶的催化效率比化学催 化剂高107～1013倍，比非催化反应高108～1020倍。 例 2H2O2→2H2O+O2 1mole H2O2酶 能催化 5×106mole H2O2的分解 1mole Fe3+ 只能催化6×10-4mole H2O2的分解
脲酶 脲酶
H2N—C—NH.HCl + H2O 无反应
（3）立体化学专一性
浅析现代化生物工程中酶技术的研究与应用
浅析现代化生物工程中酶技术的研究与应用人类生命物体的基本特征之一就是不断地进行新陈代谢，新陈代谢是由许多有机化学反应组成的，如动植物的消化反应和各种物质的合成与分解等。
这些反应在体内进行地很快，原因是有生命的动植物体内存在着的一种生物催化剂一酶的作用。
酶制剂是在1833年由法国化学家佩思和珀索发现的，他们从麦芽提取液的酒精沉淀物中得到一种对热不稳定，而且能加速淀粉转变成糖的物质，称之为淀粉酶制剂。
1926年隆姆首次从刀豆中提纯得到脲酶结晶。
生物化工行业经过70多年的发展，对酶的分子结构，酶作用的机理及酶系统的自我调节已形成了一个完整的工业体系。
整个行业也出现了一些新的发展态势，在阐明生命活动的规律，探索工业、农业、畜牧业、医药及对疾病的诊断、治疗均有重要的意义。
新陈代谢包含了一些重要的有机化学，对于生命周期的循环起着重要的保障作用。
作为常见的生物催化剂，酶的存在有利于加快新陈代谢速度，从根本上保证了相关化学反应的持续进行。
最初的淀粉酶主要是从麦芽提取液中得到的。
此后随着现代生物工程技术的不断发展，研究工作者对于各种生物酶的结构和特性有了更加深入的了解，为这些酶应用范围的扩大奠定了坚实的基础。
1.1生物酶的主要特点生物酶本质上是一种蛋白质，主要产生于某些机体活细胞，在实际的应用中具有良好的催化效果。
常见的酶促反应主要是指生物酶参与的反应，对相关物质代谢速度的加快带来了一定的保障作用。
生物酶的主要特点包括:(1)高效的催化效率。
相对而言，酶的催化效率远远高于一般的催化剂，最大为1013倍;(2)稳定性差。
作为机体活细胞的蛋白质，生物酶很容易受到各种存在因素的影响，导致蛋白质现象的出现，从而使酶失去了活性。
这些内容客观地反映了生物酶稳定性差的特性;(3)专一性非常强。
一般的催化剂在实际的应用中可能会有多种选择。
而生物酶只针对一种化合物发挥自身的催化作用，具有高度的专一性;(4)酶活力可以随时调节。
蛋白酶在存在的过程中有着良好的特性，不同类型蛋白酶通过一定的机制实现彼此间的有效结合，才能具有更好的催化活力。
第二章 酶1
三、酶活性的调节
影响酶促反应速度的因素包括： 底物浓度、酶浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。
参与酶活性调控方式包括：
基因表达调控、激素、反馈抑制、蛋白酶激活、可逆共价修 饰、别构调节等。
（一）共价修饰
1.不可逆共价修饰：蛋白酶解激活
酶原与酶原的激活
有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体， 必须在一定条件下，这些酶的前体水解一个或几个特定的 肽键，致使构象发生改变，表现出酶的活性。这种无活性 酶的前体称为酶原（zymogen）。 酶原向酶的转化过程称为酶原的激活。酶原的激活实 际上是酶的活性中心形成或暴露的过程。
协同效应： 寡聚酶（几个亚基）中，每个亚基的一个结合部位， 一旦一个效应物结合以后，会引起（诱导）酶分子构 象变化，使得酶分子上的电子分布被改变， 结果是使 后面的配体对酶的亲和力发生相应的改变。 如果一个效应物结合以后，后面的配体更容易结合，则 为正协同效应。 如果一个效应物结合以后，面后的配体更难结合，则为 负协同效应。 但同促协同效应一般为正协同效应。
（一）不可逆抑制作用： 抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引 起酶活性的抑制，且不能采用透析等简 单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不 可逆抑制作用。 酶的 不可 逆抑制 作用包 括专一 性抑制 （如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制）和 非专一性抑制（如路易士气对巯基酶的 抑制）两种。
（二）可逆抑制作用： 抑制剂以非共价键与酶分子可逆性 结合造成酶活性的抑制，且可采用 透析等简单方法去除抑制剂而使酶 活性完全恢复的抑制作用就是可逆 抑制作用。 可逆抑制作用包括竞争性、反竞争 性、和非竞争性抑制几种类型。
断裂或形成 酶活性中心外的必需基团：维持酶活性中心的空间构象
（三）酶促反应的特点与机制
生物催化简介
使用比色计或荧光计检测显色或荧光底物， pH指示剂显色反应和荧光共振能量转移还可以 实现高通量实时检测。
基于比色法和荧光检测的高通量筛选
显色或荧光底物的高通量筛选
大部分荧光和显色底物都带高酸度的苯酚或苯胺 离去基团，当前广泛应用的是以硝基苯和伞形酮 衍生物作为底物的检测方法。
采用随机的基因突变或基因重组技术结合定向的 突变体筛选方法的分子进化技术称为定向进化。
这一技术使人们避开了对酶的构效关系的研究这 一难题，并成功地用于酶的稳定性、底物特异性、 立体选择性等酶的催化特性和酶的催化能力的改 进和新兴的代谢途径工程。
酶分子的定向进化
定向进化是一个由构建突 变体库，突变体表达，表 达后筛选三个步骤组成的 循环递进过程，需要：
红外检测技术是一种新颖的 有发展前途的高通量筛选技术， 它不需要生色基团或荧光基团 的加入，避免了比色和荧光检 测方法的局限性，但是这种技 术目前还无法进行定量，只能 检测催化活性较高的酶，对酶 活的进一步研究还需借助传统 方法，方法本身还需要进一步 的发展和完善。
借助复杂的仪器设备的高通量筛选
– 单一碳源的选择性培养基，使能够利用反应底物的微生物获得生长优势 而大量增殖，无法利用反应底物的微生物由于无法获得营养生长受到抑 制，从而得到所需的目的菌株。
– 互补的方法，即在有营养缺陷的培养基上筛选能合成该种营养物质的菌 株。
检测培养基筛选法 通常是在培养基中加入某种试剂或化学药物，使培养后发生某种可以
生物催化简介
生物催化与转化是以细胞或酶作为催化剂进行物质转 化，大规模生产化学品、医药、能源、材料的科学。
优点：一个生物催化剂可以催化一系列底物甚至很多非天然底物；酶 具有高度的选择性尤其在立体和区域选择方面具有化学催化剂无法比 拟的优越性；生物催化反应通常反应条件温和具有环境友好性。
生物柴油催化剂
制备生物柴油的催化剂研究进展早在2 0 世纪80年代初期, 美国和德国的科学家研究了采用脂肪酸甲酯或乙酯反应合成脂肪酸单酯代替柴油, 这种最初定义为“生物柴油”的物质有着与柴油十分相似的理化性质, 但具有燃烧完全, 无污染排放等诸多优点。
近年来, 由于石油资源的日益枯竭和人们环保意识的增强, 生物柴油已经成为一个研究的热点, 并且制备有多种方法，即高温热裂解法[、酯交换法等。
目前, 由植物油生产生物柴油的方法多采用甲醇酯交换法。
1 酸性催化剂酸催化酯交换交换过程一般使用布朗斯特酸进行催化。
较常用的催化剂有浓硫酸、苯磺酸和磷酸等。
浓硫酸价格便宜、资源丰富, 是最常用的酯化催化剂。
酸催化酯交换过程产率高。
但反应速率慢分离困难, 易产生三废。
2碱性催化剂（1）无机碱催化剂碱催化酯交换反应的速率比酸催化要快得多。
常用无机碱催化剂有甲醇钠氢氧化钠、氢氧钾、碳酸钠和碳酸钾等。
甲醇钠在用于制备生物柴油的碱催化剂中活性相当高, 但易溶于脂肪酸酯。
然而,油脂中若含有水, 甲醇钠活性将大大降低。
氢氧化钠和氢氧化钾相对于甲醇钠的价格要便宜些。
传统的酯交换工艺中多用Na O H 作催化剂, 在反应过程中, 氢氧化物与醇反应产生水。
使部分酯类水解产生羧酸。
羧酸与氢氧化物发生皂化反应。
大大降低了生物柴油的产率且分离比较难。
（2）固体碱催化剂固体碱催化剂用于酯交换反应生产工艺简单,产品后处理方便, 无废水产生。
直接获得产品及副产物甘油, 催化剂可再生, 避免了三废污染。
3生物催化剂一酶脂肪酶是一种良好的酯交换反应的催化剂, 酶作为一种生物催化剂具有高的催化效率和经济性,采用酶催化可以解决目前化学方法生产生物柴油所用的催化剂存在的分离困难、所需能量大等问题。
为此, 人们开始关注酶法合成生物柴油技术。
即用脂肪酶催化动植物油脂与低碳醇间的转酯化反应,生成相应的脂肪酸酯。
此法具有提取简单、反应条件温和、醇用量小、甘油易回收和无废物产生等优点, 是一种极具发展潜力的生物柴油生产方法。
生物催化
编号的第二个数字
表示在类以下的大组.
• 氧化还原酶：表示氧化反应供体基团 的类型； • 转移酶：表示被转移基团的性质； • 水解酶：表示被水解键的类型； • 裂解酶：表示被裂解键的类型； • 异构酶：表示异构作用的类型； • 连接酶：表示生成键的类型.
编号的第三和第四个数字
• 编号的第三个数字：表示大组下面的 小组，各个数字在不同类别，不同大 组中都有不同的含义； • 编号的第四个数字：是小组中各种酶 的流水编号.
1.2 生物催化的产生与发展
远古时代：酒的酿造,饴糖的制作,豆类做酱
酵母发酵的产物, 是细胞内酶作用的结果
用麦曲含有的淀粉酶 将淀粉降解为麦芽糖
在霉菌蛋白酶作用下,豆类蛋白质水解 得豆酱和豆鼓,压榨后制得酱油
• 1878年,Kuhne第一次提出 “酶”(Enzyme)的概念,意为“在酵母 中”(in yeast); • 1894年,Emil Fischer发现了酶对底物 (酶作用的物质)的专一性现象,提出了 “锁和钥匙”模型; • 酶晶体的获得,才认识到酶是蛋白质,是 由酰胺键连接的氨基酸组成; • 1926年,Sumner从刀豆中得到脲酶结晶, 催化尿素水解,产生CO2和NH3.
现 状
• 1996年生物催化剂已占世界催化剂90 亿美元市场的11%; • 美国EBC成功开发了一种生物脱硫的新 工艺; • 我国:生物催化丙烯腈制丙烯酰胺、有 机废水发酵法制氢技术、生物发酵法 制造甘油已建成投产或通过中试验证.
内 容
• • • • • • • • • • • 酶的结构和分类 酶的分离与纯化 酶活力测定 酶作用动力学 酶的抑制作用 pH值和温度对酶作用的影响 酶的作用机制 应用酶学 酶法制备L-氨基酸 生物催化反应器 生物有机化学与生物催化
第三章 微生物酶
二、菌种的分离 菌种的分离是整个工作的第一个关键步骤。 菌种的分离是整个工作的第一个关键步骤。分离应注 意以下几个问题： 意以下几个问题： • • 分离培养基的确定。 分离培养基的确定。 分离培养条件的选择，如培养温度、湿度、好氧或厌氧 分离培养条件的选择，如培养温度、湿度、
培养等； 培养等； • 在分离的最初阶段一般不给予严密的培养条件， 在分离的最初阶段一般不给予严密的培养条件，尽可能
八、微生物酶的提取方法 微生物酶的提取工作是为进一步了解酶的特性、 微生物酶的提取工作是为进一步了解酶的特性、完善酶开 发后续工艺的前提和基础。 发后续工艺的前提和基础。酶的提取按照不同的提纯要求又可 分为酶的粗提及酶的精提。 分为酶的粗提及酶的精提。 1.酶的粗提 1.酶的粗提 工业生产上用到的微生物酶一般用量都很大，纯度要求 工业生产上用到的微生物酶一般用量都很大， 也不很高。如果待开发的酶是工业用途的话，则提取方法可 也不很高。如果待开发的酶是工业用途的话， 以比较粗放。具体的提取流程如下： 以比较粗放。具体的提取流程如下：
而且最好是产胞外酶的菌株。 而且最好是产胞外酶的菌株。 • • 产生的酶便于分离和提纯，得率高。 产生的酶便于分离和提纯，得率高。 营养要求低。 营养要求低。
六、最佳产酶条件的初步确定 培养方式的确定——固体法；液体法 固体法； 1. 培养方式的确定 固体法 2. 最佳培养条件组合 3. 胞内酶和胞外酶 胞外酶具有以下一些优点： 胞外酶具有以下一些优点： （1）分离提取容易，且不必破碎细胞，因而也就省去 分离提取容易，且不必破碎细胞， 了去除核酸的工艺； 了去除核酸的工艺； （2）胞外酶的生产不受可获得生物量的限制，因而容 胞外酶的生产不受可获得生物量的限制， 易得到较高的酶产量； 易得到较高的酶产量； （3）胞外酶活性显现的最适条件与产酶菌株的最适生 长条件往往一致。 长条件往往一致。
生化.—酶
乳酸脱氢酶(LDH1～ LDH5)
H H H M LDH2 (H3M) H H M M LDH3 (H2M2) H M M M LDH4 (HM3) M M M M LDH5 (M4)
乳酸脱氢酶的同工酶
3.临床意义
(1)在代谢调节上起着 重要的作用。 (2)用于解释发育过程 中阶段特有的代谢特 征。 (3)同工酶谱的改变有 助于对疾病的诊断。 (4)同工酶可以作为遗 传标志，用于遗传分 析研究。
酶的诱导契合动画
(三)邻近效应与定向排列
酶必须与底物靠近并方向正确才能发生反应。
(四)多元催化
酶是两性电解质， 具有酸、碱双重性质。 有利于酶与底物结合， 提高催化效率。
(五)表面效应
活性中心位于酶分子表面，有利于酶与底物 的接触。
第二节 酶催化作用的特点
(The Characteristic of Enzyme-Catalyzed Reaction)
(一)米－曼氏方程式
1. 酶促反应模式——中间产物学说
E+S
k1
k2
ES
k3
E+P
中间产物
※1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底
物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程 式，简称米氏方程式(Michaelis equation)。
2. 米－曼氏方程式
[S]：底物浓度
Ｖ＝ ──[S] K +
7.小分子有机化合物的作用
反应中起运载体作用，传递电子、质子或其他基团。
Ｂ族维生素与辅酶或辅基的关系
维生素 维生素B1 (硫胺素) 维生素B2 (核黄素) 维生素PP (尼克酰胺) 辅酶或辅基 焦磷酸硫胺素(TPP) 黄素单核苷酸(FMN) 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD) 转移的基团 醛基 氢原子(质子) 氢原子(质子)