氨基酸测定方法

4.1 光度分析法[5] [6]

β-氨基丙酸和茚三酮溶液在弱酸的条件下可以生成蓝紫色物质[7]，其颜色深浅主要与β-氨基丙酸的浓度有关。因此可利用此显色反应采用比色法定量测量β-氨基丙酸。我在实验中发现很多因素如浓度、pH 值、反应温度、以及反应时间等对此显色反应有很大的影响。如忽视这些因素会使实验产生很大的误差。就此显色反应的最佳条件我做了初步的探究。

4.1.1试剂的配制：

缓冲液的配制：配制pH= 6.00的NaAc －HAc 缓冲溶液

β-氨基丙酸标准溶液的配制：

用电子天平准确称取1.020 g β-氨基丙酸(生化纯)，溶于250ml pH=6.00缓冲溶液中，得到C = 4.080 g/L 标准溶液。

茚三酮试剂的配制：称取0.5g 茚三酮溶于100ml 蒸馏水中，得到5g/L 的茚三酮水溶液。

4.1.2标准曲线的确定

分别准确移取0.30ml 、0.40ml 、0.50ml 、0.60ml 、0.70ml 、0.80ml 、0.90ml 、1.00ml 标准液于8个比色管中，用pH=6.00的缓冲溶液稀释到5.00ml 再加入1ml 茚三酮水溶液充分摇匀，将其放在沸水浴中加热10min 。冷却到室温，用7230型分光光度计在569nm 下测其吸光度。以吸光度和浓度作一个标准曲线。

4.1.3样品的测定

稀释待测液于0.24mg/ml —0.73mg/ml,调pH 值到6.00，以相同的反应条件，测其吸光值并与上面的标准曲线对照查出稀释液的浓度，再乘以稀释倍数即为β-氨基丙酸的浓度。

4.1.4 标准曲线的测定结果

β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml —0.73mg/ml 范围内与茚三酮水溶液反应，颜色表现出由浅蓝到深蓝的递增变化。用茚三酮比色法测得的一组数据得到的标准曲线如图1：

吸光度加入标液体积(ml)

图 1 标准曲线的测定

Fig 1 Determination of the standard curve

注：在沸水中加热10min ，β-氨基丙酸标准溶液5ml 、茚三酮水溶液1ml 、缓冲溶液pH=6.00

4.1.5样品的测定分析

将待测的一批稀释50倍，母液稀释的程度可以根据以与标准溶液在相同的

反应条件下反应，再观察样品的显色程度而确定。取稀释后的产物液1ml,用pH=6.00的缓冲液稀释到5ml再加入1ml茚三酮水溶液，在沸水中加热10min,测得如下数据如表3：

表3 样品的测定

Table 3 Determination of sample

待测液序号待测液所对应的反应时间吸光度A

1 10h 0.320

2 20h 0.710

3 22h 0.562

4.1.6 浓度对显色反应的影响:

实验表明，β-氨基丙酸与茚三酮水溶液在表3所注的条件反应的最低浓度为0.24mg/ml，随着β-氨基丙酸的浓度变大显色逐渐变深。当浓度大于0.73mg/ml 时，所显颜色过深或生成紫色化合物影响其吸光度。当β-氨基丙酸的浓度在0.24mg/m—0.73mg/ml时，颜色变化明显而且稳定，因此，我选定此浓度范围作为测定范围。得到的数据如表4：

表4 浓度对显色反应的影响

4.1.7 pH值对显色反应的影响[8]

以1.5mg/ ml的标准溶液5ml，加入1ml茚三酮水溶液在沸水中加热10min,观察到的颜色变化如表5：

表 5 pH值对显色反应的影响

缓冲溶液Ph=6.00

显色反应随着pH值得不同，颜色有着明显的变化。当pH值小于3.42时几乎无色，而在pH值在3.78—7.44时颜色变化明显。pH值为6.00，加热不到二分钟即显色；pH值为9.05，加入茚三酮溶液后不加热30s左右即显红棕色；茚三酮水溶液在强碱的条件下带有明显的淡黄色。因此pH值为6.00左右最好。故我选定pH值为6.00。此时显色明显无干扰且稳定。

4.1.8温度和反应时间的影响：

实验表明：温度和反应时间对此显色反应的影响很大。温度太低，反应太慢导致显色时间长，而且显色效果不好。而温度过高，反应时间长对此反应影响也很大，会生成紫色化合物影响其吸光度。在显色反应中，反应时间主要根据具体的颜色变化而定。一般来说，β-氨基丙酸浓度在0.24mg/ml—0.73mg/ml时，在

沸水中加热10min即可，时间太短，反映不完全颜色梯度不明显。时间过长，溶液挥发严重也影响其吸光度。故我把反应时间定在10min左右。

4.1.9其他因素的影响

不同溶剂的茚三酮溶液对显色反应也有一些影响。为了区别它们对显色反应的影响，我做了如下实验：分别称取0.2002g茚三酮三份，分别溶于乙醇、水、丙酮各100ml中，可以观察到：丙酮溶解茚三酮的速度最快，乙醇次之。移取β-氨基丙酸标准溶液(4.080g/l)1ml三份,用pH值为6.00的NaAc－HAc缓冲溶液稀释到5ml再依次加入1ml茚三酮水溶液、乙醇溶液以及丙酮溶液，在沸水中加热。实验表明：在加热2min时，乙醇溶液开始显色；丙酮溶液的显红棕色；水溶液无色。在加热6min时，丙酮溶液的颜色加深；水溶液显浅蓝色；乙醇溶液的所显颜色最深。

乙醇易挥发，在加热的条件下挥发更严重。基于这一点的考虑，我采用茚三酮水溶液。而茚三酮的用量对此显色反应的影响不大，可以选择5ml的被测液与1ml(5g/l)的茚三酮水溶液反应。测定时，最好选择标样与待测液在同一水浴。这样可以减少误差提高测定的准确度。

另外，当被测液中含有其他的氨基酸或是含氨基的化合物也可以与茚三酮发生显色反应，影响测定结果。总之，茚三酮比色法作为一种β-氨基丙酸的定量检测方法具有操作简单、成本低的优点。只要控制好反应条件就能得到较好的测量结果。

三．茚三酮比色法：

1原理：氨基酸在一定pH范围内，能与茚三酮生成兰紫色化合物。可以用比色法定量测定。

2试剂：

（1）磷酸缓冲液（pH.8.04）制备方法如下：

称磷酸二氢钾4.5350g。定容500ml

称NAH2PO4·12H2O 11.9380g分别溶解定容500ml

取磷酸二氢钾10ml与磷酸氢二钠190ml混合即为pH8.04的缓冲液

（2）2%茚三酮溶液：

称茚三酮1g→溶于35ml热水→加入40mg氯化亚锡（SnCl2·H2O）搅拌过滤（作防腐剂）→于冷暗处过夜→定容50ml

①氨基酸标液

称干燥氨基酸（如异亮氨酸）0.2000g→溶解定容100ml→摇匀→吸10ml于另外100ml容量瓶定容100ml，即得200Ug/ml标液

3操作方法：

（1）绘制标准曲线：