实验动物接种方法
病毒的鸡胚培养
病毒的鸡胚培养一、目的掌握病毒鸡胚接种、收获、HA试验方法和原理二、实验内容1、种蛋选择、消毒与孵化：种蛋为健康未免疫ND疫苗、受精率为90﹪以上的新鲜种蛋。
15g高锰酸钾、30mL甲醛/m3熏蒸消毒30分钟，气室向上38.5-39℃孵化，相对湿度60-70%。
每2小时翻番一次。
2、画蛋与打孔：孵化9-11日龄鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置。
于胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打孔。
3、接种与封孔：NDV Lasota种毒以灭菌生理盐水作一定倍数稀释（20倍）,尿囊腔内接种0.1ml/胚，以融化的石蜡封孔，继续孵化，不翻蛋。
每日照蛋一次，弃去72h内死亡鸡胚。
至120h全部取出于4℃冰箱过夜。
4、收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜,吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化。
5、HA效价测定：原理。
1%鸡RBC制备：采取3只青年公鸡血液，抗凝，以生理盐水离心洗涤3次，制成1%RBC悬液。
血凝试验按下表操作。
病毒鸡胚培养病毒培养可用动物接种、鸡胚培养和组织培养法。
鸡胚接种培养是病毒学的重要方法之一，来自禽类的病毒，均可在鸡胚中繁殖，哺乳动物的病毒如蓝舌病病毒、流感病毒等也可在鸡胚中增殖。
目前鸡胚尤其是SPF、鸡胚被广泛利用于分离病毒、制造疫苗和抗原等，其来源丰富，操作简便。
除病毒外，衣原体、立克次氏体也可用鸡胚来培养，衣原体可在鸡胚卵黄囊繁殖，致死鸡胚；部分立克次氏体也可在卵黄囊中繁殖。
[目的要求](1)掌握鸡胚的孵化过程和不同日龄鸡胚的接种途径和接种方法。
(2)掌握新城疫病毒在鸡胚尿囊腔增殖过程，掌握接毒和收毒的方法。
[实验材料]白壳鸡胚、孵化箱、1mL注射器、蛋架、新城疫工系和Ⅱ系弱毒苗等。
[实验准备]1．鸡胚的选择和孵化应选健康无病鸡群或SPF鸡群的新鲜受精蛋。
为便于照蛋观察，以来航鸡蛋或其他白壳蛋为好。
用孵卵箱孵化，要特别注意温度、湿度和翻蛋。
孵化条件一般选择相对湿度为60％，最低温度36℃，一般37．5℃。
动物感染实验实验报告
一、实验目的1. 了解动物感染实验的基本原理和方法；2. 掌握动物感染模型的建立方法；3. 观察和分析动物感染过程中的病理变化；4. 为进一步研究动物感染疾病提供实验依据。
二、实验原理动物感染实验是指将病原体接种于动物体内，模拟人类感染疾病的过程，以研究病原体的致病机制、传播途径、免疫反应等。
本实验采用小鼠作为实验动物，通过腹腔注射方式接种病原体，观察动物感染过程中的病理变化，为研究动物感染疾病提供实验依据。
三、实验材料1. 实验动物：昆明小鼠，体重18-22g，雌雄各半；2. 病原体：大肠杆菌（Escherichia coli），菌株号：ATCC 25922；3. 实验试剂：生理盐水、无菌棉签、注射器、无菌培养皿、显微镜、切片机等；4. 实验设备：恒温培养箱、超净工作台、PCR仪等。
四、实验方法1. 实验动物分组：将昆明小鼠随机分为实验组和对照组，每组10只。
2. 病原体培养：将大肠杆菌接种于LB培养基，37℃恒温培养箱中培养过夜。
3. 病原体接种：取实验组小鼠，用无菌棉签蘸取生理盐水清洁小鼠腹腔，然后使用无菌注射器抽取培养过夜的大肠杆菌菌液，注入小鼠腹腔，剂量为每只小鼠0.1ml。
4. 实验观察：接种病原体后，观察小鼠的饮食、活动、体重等变化，记录死亡时间。
5. 病理组织学观察：取实验组和对照组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏等组织，进行切片、染色，显微镜下观察病理变化。
6. PCR检测：提取实验组和对照组小鼠组织中的DNA，进行PCR检测，分析病原体在动物体内的复制情况。
五、实验结果1. 实验组小鼠在接种病原体后，出现食欲下降、活动减少、体重下降等症状，部分小鼠死亡。
2. 病理组织学观察结果显示，实验组小鼠的肝脏、脾脏、肾脏等组织出现不同程度的炎症、坏死等病理变化。
3. PCR检测结果提示，实验组小鼠组织中的DNA呈阳性，表明病原体在动物体内成功复制。
六、实验讨论1. 本实验通过腹腔注射大肠杆菌，成功建立了小鼠感染模型，为研究动物感染疾病提供了实验依据。
第二章鸡胚接种方法
接种方法：
选 10 － 12 日龄鸡胚检卵后，标出气室边界和胚胎 位置。用碘酒消毒鸡卵钝端（气室上方）的蛋壳，在 气室上方靠近胚胎侧的卵壳上钻一孔，钻孔区再次用 碘酒消毒。用无菌眼科小剪子沿钻孔周围剪去少许， 开一小窗，勿损伤内层壳膜，经小窗向气室内滴入一 滴无菌液体石蜡。将卵置照卵灯上，可清楚地看到胚 胎的位置。将注射器瞄准胚胎的腭下胸前，刺入后注 入0.1－0.2ml接种物。用沾有碘酒通过火焰的小块胶 布将窗口封上。接种后的受精卵根据接种的病毒在 33℃、35℃或37℃的条件下孵育48－72小时。
第三天
胚长0.55cm，胚重20mg， 尿囊开始长出，胚的位 置与蛋的长轴垂直，开 始形成前后肢芽，出现5 个脑胞的原基，眼的色 素开始沉着，有35对体 节，照蛋时，可见胚和 伸展的卵黄囊血管形似 蚊子，俗称“蚊虫珠”；
第4天
胚长0.77cm，胚重50mg， 孵黄囊血管包围蛋黄达 1/3，肉眼明显看到尿囊， 羊膜腔形成，胚和蛋黄 分离，由于中脑迅速生 长，胚胎头部明显增大， 舌开始形成，照蛋时蛋 黄不容易转动，胚与卵 黄囊血管形似蜘蛛，俗 称小蜘蛛；
病毒分离培养
方法
应
用价值ຫໍສະໝຸດ 存 在 问 题自身带病毒； 有的接种后不敏感； 动物饲养问题 敏感病毒谱窄 设备技术要求条件高
应用最早； 动物 方法简便； 接种 结果易于观察 鸡胚 来源客观，易于管理，带 培养 病毒机会少；多途径接种 细胞 应用广泛，敏感病毒谱广 培养
鸡胚培养法的优点：
1. 它的组织分化程度低，可选择适当途径 接种，病毒易复制，感染病毒的膜和液体 含大量病毒。 2. 是个整体，有神经血管的分布及脏器的 构造。 3. 来源充足，操作简单，通常是无菌的， 对接种的病毒不产生抗体。
动物实验技术2
小鼠的皮内注射
4.肌肉注射 (i.m)
因小鼠肌肉较少，一般不作肌肉注 射。如实验必须作肌肉注射时，由助手 抓住小鼠两耳和头部皮肤，并提起。操 作者用左手抓住小鼠一侧后肢，右手取 连有 6 号针头的注射器，将针头刺入大 腿外侧肌肉，将药液注入。 小鼠一侧后肢的用药量不超过 0.1mL。
5.腹腔注射 (i.p)
小 鼠 的 尾 静 脉 注 射
7.脑内注射 常用于微生物学动物实验，将病原体等接种于被检动物脑内， 观察接种后的各种变化。 8.涂布给药 小鼠常采用浸尾方式经尾皮给药，用以定性地判定药物或毒物 经皮肤的吸收作用。 9.呼吸道给药 呈粉尘、气体、蒸气或雾等状态存在的药物或毒气，均需通过 呼吸道给药。 10.脚掌注射法 小鼠脚掌注射时一般取后脚掌，一次最大注射量为 0.25mL。
3.皮内注射 (i.d)
常用于观察皮肤血管的通透性变化及观察皮 内反应，多用于接种、致敏实验等。皮内注射通常 选用背部脊柱两侧的皮肤。先将注射部位及其周围 的被毛剪去，酒精棉球消毒局部。然后用左手将皮 肤捏成皱襞，右手持有 5 号针头的注射器，使针 头与皮肤呈 30 °角刺入皮下，然后将针头向上挑 起并稍刺入，即可注射。注射后，可见皮肤表面鼓 起一小丘。注射后5分钟再拔出针头、否则药液会 从针孔漏出。通常小鼠皮内一次注射量不超过 0.05mL。
麻醉时
静脉注射必须缓慢，同时观察肌肉紧张性、角膜反射和对皮 肤疼痛的反应，当这些活动明显减弱或消失时，要立即停止注射， 并进行抢救。 ① 采取保温措施。在麻醉期间，动物的体温调节机能受 到抑制，会出现体温下降，影响实验结果。 ② 必须保持动物气道的通畅和组织(眼球、舌、肠等器 官)的营养。 ③ 出现麻醉过深情况后，应立刻采取抢救措施。
小 鼠 的 灌 胃 方 法
病毒的分离与鉴定
病毒的分离与鉴定简介：病毒是一种微生物，属于病原体的一种。
它可以寄生于宿主细胞中，并利用宿主细胞的代谢系统繁殖。
为了进行研究和控制病毒的传播，科学家们需要对病毒进行分离和鉴定。
本文将介绍病毒的分离和鉴定的方法和步骤。
一、病毒的分离病毒的分离是指将病毒从混合物中单独提取出来。
以下是一些常用的病毒分离方法：1. 细胞培养法：这是一种常用的病毒分离方法。
首先，将病毒样本接种到细胞培养基中培养，待病毒感染细胞后，观察细胞形态的改变、病毒颗粒的释放等现象，进而证实病毒的存在。
2. 动物接种法：这是一种直接将病毒样本接种到实验动物体内的方法。
通过观察动物是否出现病征，如发热、无食欲等，可以初步判断病毒的存在。
3. 超速离心法：这是一种利用离心的原理将病毒从样本中分离出来的方法。
通过对病毒样本进行一系列的离心操作，可以使病毒沉积于管底，从而得到纯净的病毒悬液。
二、病毒的鉴定病毒的鉴定是指确定分离的病毒属于哪一种或某一类病毒的过程。
以下是一些常用的病毒鉴定方法：1. 电子显微镜观察法：使用电子显微镜观察病毒的形态、结构和大小等特征。
这种方法可以给出病毒的直接信息，帮助科学家们确定病毒的种类。
2. 免疫学方法：通过免疫学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光等，检测病毒与抗体的特异性反应。
根据反应结果，可以初步鉴定病毒的种类。
3. 分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学方法，可以对病毒样本进行基因分析，进一步确认病毒的物种。
这些技术可以检测病毒的基因序列，通过与已知病毒的序列进行比对，鉴定病毒的种类和亲缘关系。
结论：病毒的分离和鉴定是研究和控制病毒传播的重要步骤。
通过适当的分离方法，可以有效地将病毒从样本中提取出来，并通过鉴定方法确定病毒的种类和特性。
病毒的分离和鉴定是研究和治疗病毒相关疾病的基础，也为疾病的监控和防控工作提供了重要的支持。
注意，为了确保实验室安全，病毒的分离和鉴定应在合适的实验条件下进行，并且遵循相关的实验规范和操作流程。
中和试验
中和试验中和试验是病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力的试验方法。
所属分类：免疫学概述动物受到病毒感染后，体内产生特异性中和抗体，并与相应的病毒粒子呈现特异性结合，因而阻止病毒对敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，使病毒失去感染能力。
中和试验(Neutralization Test)是以测定病毒的感染力为基础，以比较病毒受免疫血清中和后的残存感染力为依据，来判定免疫血清中和病毒的能力。
两种试验方法介绍中和试验常用的有两种方法：一种是固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合，另一种是固定血清用量与等量系列对数稀释(即十倍递次稀释)的病毒混合。
(一) 定血清－稀释病毒法(病毒中和试验)1.病毒毒价的测定毒价单位：衡量病毒毒价(毒力)的单位过去多用最小致死量(MLD)，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致全组试验动物死亡的最小剂量。
但由于剂量的递增与死亡率递增不呈线性关系，在越接近100%死亡时，对剂量的递增越不敏感。
而一般在死亡率越接近50%时，对剂量的变化越敏感，故现多改用半数致死量(LD50)作为毒价测定单位，即经规定的途径，以不同的剂量接种试验动物，在一定时间内能致半数试验动物死亡的剂量。
用鸡胚测定时，毒价单位为鸡胚半数致死量(ELD50)或鸡胚半数感染量(EID50)。
用细胞培养测定时，用组织细胞半数感染量(TCID50)。
在测定疫苗的免疫性能时，则用半数免疫量(IMD50)或半数保护量(PD50)。
(1) LD50的测定(以流行性乙型脑炎病毒为例)。
测定方法：将接种病毒，并已发病濒死的小鼠，无菌法取脑组织，称重、加稀释液充分研磨，配制成10-1悬液，3 000r/min离心20分钟，取上清液，以10倍递次稀释成10、10、10……10，每个稀释度分别接种5只小鼠，每只脑内注射0.03ml，逐日观察记录各组的死亡数。
本例高于50%病毒稀释度的对数－6，距离比例为0.5，称释系数的对数为－1。
微生物接种方法
微生物接种方法微生物接种是生物实验中的一项基本技术，也是各种微生物检测和研究中不可缺少的步骤。
本文将介绍一些常见的微生物接种方法，包括平板划线法、斜面接种法、液体培养基接种法和穿刺接种法等。
平板划线法是一种常用的微生物接种方法，其目的是将菌种纯化，得到单一的菌落。
该方法通过在固体培养基上划线，使菌种在培养基上繁殖并形成菌落。
具体步骤如下：(1)将固体培养基灭菌后倒入培养皿中，待凝固后加入适量菌液。
(2)用接种环取适量菌液，在培养皿表面划线。
(3)将培养皿放入适宜的温度下培养，观察菌落的生长情况。
(4)根据需要重复划线操作，直至得到单一的菌落。
斜面接种法是一种常用的微生物接种方法，其目的是将菌种接种到斜面培养基上，以便于观察和保存。
该方法通过将菌液加入到灭菌后的斜面培养基中，使菌种在斜面上繁殖并形成菌落。
具体步骤如下：(1)将斜面培养基灭菌后放置在实验台上，用无菌操作法加入适量菌液。
(2)将接种环放入菌液中沾取少量菌种，然后在斜面培养基上划线接种。
(3)将培养皿放入适宜的温度下培养，观察菌落的生长情况。
(4)根据需要重复划线操作，直至得到单一的菌落。
液体培养基接种法是一种常用的微生物接种方法，其目的是将菌种接种到液体培养基中，以便于微生物的生长和繁殖。
该方法通过将菌液加入到灭菌后的液体培养基中，使菌种在液体培养基中繁殖并形成微生物。
具体步骤如下：(1)将液体培养基灭菌后倒入试管中，加入适量菌液。
(2)用摇床或其他设备将试管中的培养基混合均匀。
(3)将试管放入适宜的温度下培养，观察微生物的生长情况。
微生物接种技术是生物工程中一项重要的技术，广泛应用于生物制品制造、环境生物治理、医学诊断等领域。
本文将介绍微生物接种技术的基本原理、应用场景以及发展前景。
微生物接种技术是指将目的微生物通过一定的方式引入到培养基或发酵系统中，使其在特定的环境下生长繁殖，以达到特定的生物制品或环境治理的目的。
该技术的主要环节包括菌种选择、接种量确定、接种方法选择和培养条件控制等。
(动物传染病学实验课件)7 实验七 鸡的解剖,病料处理和接种
实验方法
1. 外部检查 2. 采血 3. 处死和消毒 4. 打开胸腹腔 5. 暴露内脏 6. 记录病变
1.外部检查
精神状态 羽毛、皮肤 眼睛、眼结膜 耳、鼻和口腔 泄殖腔
2.翼下静脉采血
3. 处死和消毒
口腔处死法: 将鸡的两翼和后肢保定，再将上 下颌骨打开，然后用剪刀向沿腭骨深处剪下， 就会剪断上颌动脉而致死；
区，然后用接种针分区涂开，置37℃温箱培养。 3.2 病料处理（组织）
无菌操作取病变组织1-2g，用剪刀剪碎后移入匀 浆器，加入5ml生理盐水用匀浆器研磨均匀。取出 1ml研磨的悬液，加入到1.5ml的EP管中，1000rpm 离心10min，取上清500µl（加入双抗1-5%）。
Hale Waihona Puke 3.3 细胞单层接种四、结果观察和检测
❖ 24-48h后观察细胞病变。 ❖ 细菌菌落形态，革兰氏染色，生化鉴定等。 ❖ 收获鸡胚尿囊液，HA、HI或RT-PCR检测。
鸡解剖实验材料
1. 发病鸡 2. 手套、酒精棉球、碘酒棉球 3. 剪刀、镊子 4. 托盘（鸡）、废液桶 5. 消毒液、肥皂 6. 塑料盆（血液、羽毛和离体组织） 7. 塑料桶（浸湿尸体和羽毛）
分子生物学诊断技术是20 世纪七、八十年代发展起来 的诊断方法，具有特异性强、 敏感性和快速等优点，例如 PCR 、 RFLP 、 核 酸 探 针 技 术和基因序列分析等。
可根据需要和条件选择合适 的方法进行诊断。
实时荧光定量PCR （Real-time PCR）
三、方法与步骤
3.1 细菌分离 无菌操作切取病变组织1-2g，涂于平皿的1/4
☺ 检卵 自孵育后的第4天开始检卵，每天一次。 孵育4-5日后即可于检卵灯上检查鸡胚受精与否及
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实验动物接种方法
一、试验目的
熟悉并掌握实验动物的疫苗接种途径与方法
二、试验原理
接种疫苗的目的是激发保护性免疫应答并形成免疫记忆，从而使动物免遭感染的危害。
疫苗种类：根据传统与习惯，疫苗可分为减毒活疫苗、灭活疫苗、抗毒素、亚单位疫苗、
载体疫苗、核酸疫苗等。接种途径的确定应根据疫苗种类、畜禽日龄及免疫目的而定，主要
有以下几种途径：气雾法、注射法（肌肉、皮下、皮内、静脉、腹腔内）、饮水法、点眼、
滴鼻法、灌胃法等。一般活苗采用饮水、喷雾、滴鼻、点眼、注射免疫，灭活苗则需肌肉或
皮下注射。
三、实验材料
1ml注射器、生理盐水、滴管、灌胃器、每两人一只小鼠
四、实验方法
注射法（肌肉、皮下、皮内、静脉、腹腔内）、点眼、滴鼻法、灌胃法。
1．注射接种方法
（1）皮下注射接种（多点注射法）
皮下注射接种是将药液推入皮下结缔组织，经毛细血管、淋巴管吸收进入血液循环的过
程。作皮下注射常选项背或大腿内侧的皮肤。操作时，常规消毒注射部位皮肤，然后将皮肤
提起，注射针头取一钝角角度刺入皮下，把针头轻轻向左右摆动，易摆动则表示已刺入皮下，
再轻轻抽吸，如无回血，可缓慢地将药物注入皮下。拔针时左手拇、食指捏住进针部位片刻，
以防止药物外漏。注射量约为体重。
（2）皮内注射接种（多点注射法）
是将药液注入皮肤的表皮和真皮之间，观察皮肤血管的通透性变化或皮内反应，接种、
过敏实验等一般作皮内注射。先将注射部位的被毛剪掉，局部常规消毒，左手拇指和食指按
住皮肤使之绷紧，在两指之间，用结核菌素注射器连接针头穿刺，针头进入皮肤浅层，再向
上挑起并梢刺入，将药液注入皮内。注射后皮肤出现一白色小皮丘，而皮肤上的毛孔极为明
显。注射量为次。
（3）肌肉注射接种（多点注射法）
小鼠体积小，肌肉少，很少采用肌肉注射。当给小鼠注射不溶于水而混悬于油或其他溶
剂中的药物时，采用肌肉注射。操作时1人保定小鼠，另一人用左手抓住小鼠的1条后肢，
右手拿注射器。将注射器与半腱肌呈90°角迅速插入1/4,注入药液.用药量不超过10g体重.
(4) 静脉注射接种
将小鼠放在金属笼或鼠夹中,通过金属笼或鼠夹的孔拉出尾巴,用左手抓住小鼠尾巴中
部.小鼠的尾部有2条动脉和3条静脉,2条动脉分别在尾部的背侧面和腹侧面,3条静脉呈品
字型分布,一般采用左右两恻的静脉.拔去沿尾部静脉走向的毛,置尾巴于45-50℃温水中浸
泡几分钟或用75%酒精棉球反复擦拭尾部,以达到消毒和使尾部血管扩张及软化表皮角质的
目的.行尾部静脉注射时,以左手拇指和食指捏住鼠尾两侧,使静脉更为充盈,用中指从下面
托起尾巴,以无名指夹住尾巴的末梢,右手持4号针头注射器,使针头与静脉平行(小于30°
角),从尾巴的下1/4处进针,开始注入药物时应缓慢,仔细观察,如果无阻力,无白色皮丘出
现,说明已刺入血管,可正式注入药物.有的实验需连日反复尾静脉注射接种,注射部位应尽
可能从尾端开始,按次序向尾根部移动,更换血管位置注射接种。注射量为体重。拔出针头后，
用拇指按住注射部位轻压1-2min，防止出血。
应当注意，此途径因绕过淋巴结，故不利于细胞免疫的建立。
（5）腹腔注射
左手提起并固定小鼠，使鼠腹部朝上，鼠头略低于尾部，右手持注射器将针头在下腹部
靠近腹白线的两恻进行穿刺，针头刺入皮肤后进针3nm左右，接着使注射针头与皮肤呈45°
角刺入腹肌，穿过腹肌进入腹膜腔，当针尖穿过腹肌进入腹膜腔后抵抗感消失。固定针头，
保持针尖不动，回抽针栓，如无回血、肠液和尿液后即可注射药液。注射量为体重。
2. 滴鼻接种
左手保定住小鼠，右手用滴管吸取疫苗，对准鼻孔滴入1-2滴疫苗。待完全吸入后方能
松手，吸入不准的要重滴。
3. 点眼接种法
左手保定住小鼠，右手用滴管吸取疫苗，对准眼睛滴入1-2滴疫苗。待完全吸入后方能
松手，吸入不准的要重滴。
4. 灌胃法
小鼠专用灌胃针由注射器和喂管组成，喂管长约1nm，喂管尖端焊有一金属小圆球，金
属球中空，用途是防止喂管插入时造成损伤。金属球弯成20度角，以适应口腔与食道之间
弯曲。
将喂管插头紧紧连接在注射器的接口上，吸入定量的药液；左手捉住小鼠，右手拿起准
备好的注射器。将喂管针头尖端放进小鼠口腔，压迫鼠头部，使口腔与食管成一直线。轻轻
转动针头以刺激鼠的吞咽，将针头顺咽后壁轻轻插入食管下段，如遇阻力，可轻轻上下滑动，
不能强行插入。一旦感觉阻力突然消失有落空感时，轻抽注射器，如无气泡抽出，则表明针
头已进入胃。如此时动物安静，呼吸无异常，可将药液注入。若动物出现剧烈挣扎，进针阻
力很大或动物呼吸困难，则可能是插入气管内，此时必须立即退出重插。操作时动作轻柔以
防损伤食管及膈肌。一般灌胃针头插入长度小鼠为 cm。用中指与拇指捏住针筒，食指按着
针竿的头慢慢往下压，即可将注射器忠的药液灌入小鼠的胃中。
五、注意事项
1. 注意安全，避免被动物咬伤。
2. 注射器要避免重复使用，注射部位的消毒要彻底。