蓝舌病病毒基因和蛋白的特点及利用
蓝舌病病毒非结构蛋白研究进展
DAIRY HEALTH 452020·10蓝舌病病毒非结构蛋白研究进展赵瑶1,2，易华山1,2,3，马鲜平1,2，李前勇1,2,3，谢远兵4（1.西南大学动物科学学院，荣昌 402460；2.重庆市兽医科学工程研究中心，荣昌 402460；3.西南大学医学研究院免疫学研究中心，荣昌 402460；4.重庆市永川区动物疫病预防控制中心，重庆 402160）中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号：1004-4264（2020）10-0045-05DOI: 10.19305/ki.11-3009/s.2020.10.011开放科学(资源服务)标识码(OSID)微信扫描二维码听独家语音介绍与作者在线交流摘 要：蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)感染动物宿主细胞后，病毒非结构蛋白进行表达而参与病毒基因的复制、基因组的组装及病毒粒子的释放。
BTV基因组至少编码NSP1、NSP2、NSP3/NS3a和NSP4 4种非结构蛋白（non-structural proteins，NSPs），这些NSPs在BTV基因组的复制、组装及拮抗宿主细胞干扰素免疫应答等方面发挥重要的作用。
本文就BTV主要结构蛋白、非结构蛋白最新的研究进展进行了综述，为BTV新型疫苗的研发、病毒诊断及病毒基因组复制及组装机制提供基础。
关键词：蓝舌病病毒；结构蛋白；非结构蛋白收稿日期：2020-04-01基金项目：重庆市基础研究与前沿探索专项项目基金（cstc2018jcyjAX ..................0615）&中央高校基本科研业务专项基金（XDJK2018C060..................&.XDJK2018C059）资助。
作者简介：赵瑶（1994-），女，云南泸西人，硕士生，研究方向为临床兽医感染与免疫。
通讯作者：易华山（1980-），男，甘肃临夏人，理学博士，研究方向为兽医临床感染与免疫。
山东省规模化牛场蓝舌病血清学调查
山东省规模化牛场蓝舌病血清学调查陈伟1，斯张国1，祝夕超2，蔺晓月3，李法凯3，孙圣福3*1.山东省济南市动物疫病预防与控制中心，济南 250099；2.山东省莱州市程郭畜牧兽医站，山东烟台 261437；3.山东省动物疫病预防与控制中心，济南 250100摘要［目的］了解山东省规模牛场蓝舌病的发病和流行情况。
［方法］采用血清学检测方法抽检山东省25个牛场（13个奶牛场、12个肉牛场）的738份血清样品（奶牛血清383份，肉牛血清355份）进行蓝舌病抗体检测，并测定个体阳性率和群体阳性率。
［结果］25个牛场中，3个牛场存在蓝舌病抗体阳性，群体阳性率为12.00%；738份样品中，3份样品为阳性，个体阳性率为0.41%。
［结论］2022年山东省规模化牛场存在蓝舌病的感染。
关键词牛；蓝舌病；ELISA；血清学调查；抗体检测Serological investigation of blue-tongue disease in large-scale cattlefarms in Shandong ProvinceCHEN Wei1, SI Zhangguo1, ZHU Xichao2, LIN Xiaoyue3,LI Fakai3, SUN Shengfu3*1.Animal Disease Prevention and Control Center of Jinan City, Shandong Province, Ji'nan 250099, China;2.Chengguo Animal Husbandry and Veterinary Station of Laizhou City, Yantai 261437, China;3.Animal Disease Prevention and Control Center of Shandong Province, Ji'nan 250100, ChinaAbstract[Objectives] To understand the incidence and prevalence of blue-tongue disease in large-scale cattle farms in Shandong Province.[Methods] 738 serum samples including 383 cow serum and 355 beef serum from 25 cattle farms including 13 dairy farms and 12 meat cattle farms in Shandong Province were randomly selected to test the antibody against blue-tongue disease with serological detec‐tion methods. The positive rates of individual and population were measured.[Results] 3 out of 25 cattle farms had positive antibodies against blue tongue disease, with a population positivive rate of 12.00%. 3 of the 738 samples were positive, and the individual positive rate was 0.41%.[Conclusions] In 2022, there were infections of blue tongue disease in large-scale cattle farms in Shandong Province.Keywords cattle; blue-tongue disease; ELISA; serological investigation; antibody testing收稿日期：2023-10-27基金项目：山东省重点研发计划（2022CXG020711）；布鲁氏菌新型疫苗的研制与应用作者简介：陈伟，女，1978年生，高级畜牧师。
25型蓝知病病毒VP7和VP2蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备中期报告
25型蓝知病病毒VP7和VP2蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备中期报告此次中期报告的主要内容分为以下几部分：一、研究背景及意义蓝知病是一种重要的牛病毒病，由蓝知病病毒（BTV）引起。
该病毒属于Reoviridae科，其主要病原是家畜，对养殖业造成极大的经济损失。
BTV的研究对理解病毒形态学、遗传学和病理学等方面具有重要意义。
其中VP7和VP2蛋白是BTV固有蛋白，也是病毒颗粒的主要结构蛋白，对病毒的稳定性和感染力有着重要作用。
因此，研究VP7和VP2蛋白的表达与制备，有助于深入了解BTV的病理机制、病毒学特性及其感染和免疫机制。
二、研究进展1. VP7和VP2蛋白的原核表达该研究采用大肠杆菌表达系统，构建了pET-28a-VP7和pET-28a-VP2原核表达质粒，并进行了转化。
随后，通过IPTG诱导和SDS-PAGE分析，确定了VP7和VP2蛋白的最佳诱导条件和表达量。
2. VP7和VP2蛋白的纯化为了纯化VP7和VP2蛋白，我们采用了His-tag标记的Ni-NTA亲和层析纯化方法。
经过操作优化，分别得到了纯度较高的VP7和VP2蛋白。
通过Western blot验证，证实纯化得到的蛋白具有特异性。
3. VP7和VP2蛋白的单克隆抗体制备我们将纯化得到的VP7和VP2蛋白，用于Balb/c小鼠免疫。
通过ELISA筛选和Limiting dilution扩增等方法，最终成功获得了VP7和VP2蛋白的单克隆抗体。
三、研究总结本研究成功地构建了VP7和VP2蛋白的表达和纯化体系，并成功制备了VP7和VP2蛋白的单克隆抗体。
这为BTV的病毒学和免疫学研究打下了坚实的基础，对研究BTV 的感染机制、病理和免疫学等方面有着重要的意义。
牛蓝舌病流行病学及防控技术研究进展探究
王颖
（ 黑 龙江 省 五 大 连 池 市尾 山 农 场 畜 牧 科
１ ６ ４ １ ４ ２）
蓝舌病（ Ｂ ｌ ｕ ｅ ｔ ｏ ｎ ｇ ｕ ｅ ， Ｓ Ｔ ） 是 由 呼肠 孤 病 毒 科 环 状 病 毒 属 的 蓝 舌 病病毒（ Ｂ ｌ ｕ ｅ ｔ ｏ ｎ ｇ ｕ ｅ ， Ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ， Ｂ Ｔ Ｖ ） ￣ Ｉ 起 的一 种 烈 性 传 染 病 ， 可 以 通 过 库 朦 在 反 刍 动 物 间传 播 。 反 刍 类 动 物 感 染 蓝 舌 病 后 的 平 均 病 死 率 约为 ３ ０ ％， 其 中绵 羊 的病 死 率 则 可 高达 ８ ０ ％ 。蓝 舌 病 是 Ｏ Ｉ Ｅ规 定 的上 报 疫 病 （ 以 前 被 列 为 Ａ类 动 物 疫 病 ） 。我 国农 业 部 将 其 列 为 一 类动物疫病 。 蓝 舌 病 严 重 危 害 我 国 畜 牧 业 及 产 品 进 出 口贸 易 的 发
展。
蓝 舌 病 主 要 通 过 库 朦 等 嗜 血 媒 介 昆虫 吸 吮 带 毒 血 液 后 ， 使 病 毒 在 昆 虫 体 内增 殖 并 且 在 叮 咬 易 感 动 物 过 程 中进 行 传 播 的非 接
触性传染病 。 主要 的传播方式有 ： ①运 输动物或动物制品。 ② 因风 引起 的被动型媒介飞行导致长距离传播 。 ③ 被动或主动的昆虫蓝舌 病的发生 、 流 行 与库 朦 等 昆虫 的 分 布 、 生 活 史 和 习性 密 切相关 ， 多呈地方性流行 ， 以早 秋 与 晚 夏 多 发 ， 具 有 很 明 显 的 季 节
性。
１病 原 学
１ ． １ 病 毒粒 子 结 构
Ｂ Ｔ ｖ粒 子 呈 现 二 十 面 体 对 称 ， 核衣 壳直径 ５ ０ ～ ６ ０ ｉ ｒ ｍ， 加 上 外 ３临床 症 状 面一 细 绒 毛 状 外 层 ， 病毒粒子 的总直径 达 ７ ０ ～ ８ ０ ｎ ｍ． 成 熟 病 毒 密 蓝舌病容易引起病牛高热 ， 导 致 血 管 通 透 性 改 变 。 临 床 症 状 度为 １ ． ３ ３ ７ ｇ ／ ｅ ａ ｒ ３ 、 无囊 膜 ， 被一个外层囊膜样结构包 围。 病 毒 粒 子 可 见 病 牛 高 热 ， 出血性病理变化 ， Ｅ ｌ 腔 出现 炎症 、 水肿、 充血 ， 病 情 的绒 毛层 在 氯 化 艳 中离 心沉 淀 以后 会 不 明 原 因 消失 。 病 毒 衣 壳 是 加 重 后 导 致 面部 水 肿 、 舌充血发绀 ， 粘膜糜烂 ， 出血 ， 鼻腔炎症 ， 皮 由３ ２个 直 径 ８ － １ １ ｎ ｍ， 呈 中 空 的 短 圆 柱状 大 型 壳粒 组成 。 肤无 毛区域发 生充血 、 出血 ， 蹄部蹄叉肿 胀 、 发炎导致跋 行 ， 怀 孕 １ － ２理 化 特 征 牛流 产 或 先 天 畸形 胎 。 自然 发 病 病 例 的病 理 变 化 主 要 为 肌 肉 、 皮 蓝舌 病病毒不 耐热 ， ６ ０ ℃加 热 ３ ０ ｍ ｉ ｎ即 可 灭 活 ． ７ ５ ～ ９ ５ ℃则 迅 肤 、 心脏 、 口腔 、 瘤 胃 和蹄 部 ， 有 糜烂并伴 有 出血点 、 坏 死 和 溃 疡 速 灭 活 。蓝 舌 病 病 毒具 有 血 凝 特 性 ， 位 于病毒粒子最外层 的 Ｖ Ｐ ２ 面 。骨 骼 肌 严 重 坏 死 和变 性 。皮 下 组 织 有 充 血 现 象 。唇 内侧 和 牙 蛋 白与血凝活性有关 ， 可 凝 集 绵 羊 和 人 ０ 型 红 细胞 ． 且 血 凝 特 性 床 、 舌表皮粘膜脱落 。 肺部病变严重 ， 肺 泡 和肺 间质 充血 、 水肿 。 脾 不受 温度 、 Ｐ Ｈ、 缓 冲系统及 红细胞种类 的影响 ， 血 凝 抑 制 具 有 型 脏 淋 巴结 水 肿 、 轻微肿大 。 蹄 部蹄 叶炎 并 常 发 生 。 蹄 冠 上 皮 脱 落 但 特异性 。 同时 ， 蓝舌病病毒还是高效干扰素（ Ｉ Ｎ Ｆ ） 诱 生剂 ， 科研人员 不发 生无 水 疱 。 给小 鼠静 脉 注 射该 病 毒 ， 经８ ｈ后 测定 其 血 浆 中的 Ｉ Ｎ Ｆ浓 度 ， 高 达 ４诊 断 方 法 ６ ０万 单 位／ ｍＬ ， 是 迄 今 己 知 的 比任 何 其 他病 毒 性 或 非 病 毒 性 诱 导 我 国根 据 国 际 常用 的方 法 和 我 国 多 年 的 实 践 ， 病 毒 分 离 是 采 剂都 高 ５ ～ １ Ｏ倍 的 干扰 素 诱 生 剂 。 用鸡 胚 静 脉 接 种 的 方 法 ， 然 后 病 毒 分 离 物 定 性 鉴定 可 通 过 免 疫 荧 １ ． ３病 毒 的 培 养 光试 验 进 行 ， 定 型 鉴 定 用 病 毒 中和 试 验 进 行 。 需 要 利 用 病 毒 分 离 Ｂ ， Ｉ ’ ｖ可 以在 鸡 胚 、 细胞 以 及绵 羊 身 上 获 得增 殖 。一 般 使 用 ９ ～ 鉴定 、 血 清 学 检 测 和 病 毒 核 酸 检 测 等 实 验 室 检 测 手 段 进 行 确 切 诊 １ ２日龄 的 鸡 胚 ， 通 过 静 脉接 种 病 料 来 进 行 Ｂ Ｔ Ｖ的 分 离 鉴 定 。 采 用 断 。 病 毒 分 离 鉴定 是 Ｏ Ｉ Ｅ推 荐 的 Ｂ Ｔ ｖ诊 断 方 法 之 一 ，其 灵 敏 度 静脉接 种方 式分 离 病毒要 比传统 的卵 黄囊接 种敏 感性 高 １ ０ ０ ～ 高， 但完成整个检测过程需 １ ～ ２月 ， 具有检测周期长的局限性 。 目 １ ０ ０ ０倍 ， 但 该 方 法 对 操 作 人 员 的技 术 水 平 要 求 较 高 。Ｂ Ｔ ｖ 既 可 以 前 用 于 蓝 舌 病 定 性 的 国 际 通 用 方 法 是 琼 脂 免 疫 扩 散 试 验 和 酶 联 使用昆虫 源性细胞（ 如Ｋ Ｃ细胞 、 Ｃ ６ ／ ３ ６细 胞 等 ） 进行 分离鉴定 ， 也 免 疫 吸 附 试 验 ， 蓝 舌 病 的定 型方 法 是 血 清 中和 试 验 用 。 可以用哺乳动物 源性细胞（ 如Ｂ ＨＫ 一 ２ １ 细胞 、 Ｍ Ｄ Ｃ Ｋ 细胞 、 Ｖ ｅ ｒ ｏ细 ５防 治 胞 等） 进 行 分 离 鉴 定 。哺 乳 动 物 源 性 细 胞 通 常 在 接 种 Ｂ Ｔ Ｖ后 ３ ～ ５ 在流行地区可在每年发病季节前一个月接种疫 苗 ． 在 新 发 病 天出现细胞病变 ， 主要 表 现 为 细胞 变 圆 、 折光性增强等 。 因 为鸡 胚 地 区 可 用 疫 苗 进 行 紧 急 免 疫 接 种 。为 防 止 本 病 传 人 ， 严 禁 从 有 本 对Ｂ Ｔ ｖ的敏感性比细胞系要高 ， 所 以在 分 离 鉴 定 Ｂ Ｔ ｖ时 ． 一 般 采 病 的 国 家 和 地 区 引 进 牛 ， 加 强 国 内疫 情 监 测 ， 切 实 做 好 冷 冻 精 液 用 先 接 种 鸡 胚 再 接 种 细 胞 的分 离 方 法 。 直接接种绵羊来分离 Ｂ ｒ Ｖ 的管 理 工 作 ，严 防 用 带 毒 精 液 进 行 人 工 授 精 。定 期 进 行 药 浴 、 驱 也 是 一 种 敏 感 而 有 效 的方 法 ， 但 在 实 际 操作 中 采 用 较 少 。 虫， 控 制 和 消 灭媒 介 昆 虫 ． 做好牧场的排水工作 。 对 患 病 牛要 精 心 ２流 行 病 学 护理 ， 饲 喂 易 消化 的饲 料 ， 每 天 用 温 和 的消 毒 液 冲洗 口腔 和 蹄 部 。 牛感染 蓝舌 病毒后 带毒 时间长ｆ ６ 个 月 以上 ） ， 无 明显 的 临 床 预 防 继 发 感 染 可 以用 磺 胺 药 或 者 抗 生 素 ， 必 要 时 将 阳性 病 牛予 以 血清 学阳性动物要 定期复检 ， 限制 流 动 ， 就地饲养 实用 ， 不 症 状 。 蓝 舌 病 病 毒 可 在 反 刍 动 物 及 媒 介 昆虫 库 朦 体 内 增 殖 ， 导 致 补 杀 。 持续性病毒血症（ ２ １ 天～ ６个 月１ 而形成传染源 。 蓝 舌 病 病 毒 在 绵 羊 能 留作 种 用 。 体存在 的时 间比牛长 ． 但 仅 当公 牛 发 生 病 毒 血 症 时 。 才 能 从 公 牛 参考文献 ： 精 液 中分 离 到 蓝 舌 病 病 毒 ， 并且经交配传播给母牛和犊牛 。 『 １ １ 苗 志强， 郑明 学， 古 少鹏 ， 郭彦 ， 刘 峥． 蓝 舌 病 的流 行 状 况 及
蓝舌病病毒在细胞内生长特性和在抗原快速纯化中的应用
Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｆ ｏ ｒ ｓ ｏ ｌ ｖ ｉ ｎ ｇ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｏ ｂ ｌ ｅ ｍｓ ｏ ｆ ｉ ｎ ｅ ｆ ｆ ｉ ｃ ｉ ｅ ｎ ｔ ａ ｎ ｄ ｔ ｉ ｍｅ － ｃ ｏ ｓ ｔ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎ ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｂ ｌ ｕ ｅ － ｔ ｏ ｎ ｇ ｕ ｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ａ ｎ ｔ ｉ ｇ ｅ ｎ，ａ ｎ ｅ ｗ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｉ Ｓ ｒ ｅ ｐ ｏ ｒ ｔ ｅ ｄ ｈ ｅ ｒ ｅ ．Ａｔ ｆ ｉ ｒ ｓ ｔ ， ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｃ ｅ ｎ ｔ ｒ ａ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｂ ＴＶ ｉ ｎ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ｏ ｃ ｕ ｌ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗａ ｓ ｄ ｅ ｔ ｅ ｒ ｍｉ ｎ ｅ ｄ ｂ ｙ Ｉ ＰＸ ｓ ｔ ａ ｉ ｎ ， ｔ ｈ ｅ ｎ ｔ ｈ ｅ ｂ ｅ ｓ ｔ
病 病毒抗 原 的方 法 。进行 了蓝舌病 病毒 在 细胞 内生 长特 性 的研 究 ， 采 用酶 染 色等 方法 对 不 同接 种 量、 不 同培 养 时间的 细胞 内病毒含 量进 行测 定 ， 发 现 可 以在 感 染 细胞 未产 生病 变前 收 获 细胞 ， 通过
简单加 工 获得 高浓 度 的 病 毒 抗 原 。该 方 法 快速 高 效 ， 适 用 于蓝 舌病 的 抗 原 生 产 ， 用于蓝舌病 Ｃ — Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 以及 琼 脂扩散 实验 中。该方 法可推 广 用 于其 它病 毒 的纯化 中。
ｈ ａ ｒ ｖ ｅ ｓ ｔ ｔ ｉ ｍｅ ｗｅ ｒ ｅ ｄ ｅ ｃ ｉ ｄ ｅ ｗｈ ｅ ｎ ｍｏ ｓ ｔ ｆ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ａ ｒ ｅ ｉ ｎ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ，ｎ ｏ ｔ ｙ ｅ ｔ ｒ ｅ ｌ ｅ ａ ｓ ｅ ｄ ｉ ｎ ｔ ｏ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｍｅ ｄ ｉ ｕ ｍ． Ｔｈ ｅ ｈ ａ ｒ ｖ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｒ ｅ ｌ ｅ ａ ｓ ｅ ｈ ｉ ｇ ｈ
绵羊蓝舌病的综合防控
绵羊蓝舌病的综合防控朱泽慧，贾俊兰，白雪飞（内蒙古乌兰察布市察哈尔右翼前旗动物疫病预防控制中心内蒙古乌兰察布012200）病属于我国一类动物传染病，对绵羊危害最大，严重制约绵羊健康和养殖的持续发展。
绵羊蓝舌病可导致绵羊黏膜溃烂、跛行、流产，具有较高的发病率和死亡率，可造成严重的经济损失。
本文对绵羊蓝舌病的流行病学、临床症状、诊断等方面进行综述，重点讨论绵羊蓝舌病的综合防控措施，为绵羊蓝舌病的诊断和防治提供参考。
；蓝舌病；流行病学；综合防控绵羊蓝舌病是一种由吸血性节肢动物传播的病毒性疾病，病原为呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒[1]。
蓝舌病病毒可感染多种反刍动物，但以绵羊的临床症状和病理变化最严重，而其他动物常为隐性或亚临床感染。
绵羊蓝舌病在世界范围内的反刍动物群体内广泛传播，已造成严重的经济损失。
有研究统计，1996年暴发的蓝舌病疫情造成全球约30亿美元的经济损失，而由蓝舌病造成的绵羊养殖业的损失仍在持续增加[2]。
因此，绵羊蓝舌病的综合防控工作是降低绵羊养殖业受蓝舌病影响的重要工作。
1绵羊蓝舌病的流行病学蓝舌病病毒可感染多种反刍动物，如家养反刍动物中的牛、羊等，野生反刍动物中的鹿、羚羊，但在所有的动物中，绵羊对蓝舌病病毒最易感，且临床症状和病理变化最为严重，而其他动物易感程度相对较低，且多呈隐性感染或仅表现亚临床症状[3]。
绵羊蓝舌病是一种由吸血性节肢动物（如蠓、蚊）传播引起的疾病，该病的传播与蠓、蚊的活动密切相关，因此该病呈季节性发病，常发于夏秋季节，且在有水的低洼地区发病较多。
此外，最近有研究发现，除蠓、蚊、蜱、虱等虫媒外，蓝舌病可通过胎盘进行垂直传播，而幼畜通过摄入带有病毒的初乳也可染病。
患病的公畜的精液可带有蓝舌病病毒，并可通过交配行为感染母畜。
肉食动物食用染病动物后可经口传播蓝舌病病毒，而弱毒疫苗也可散毒。
2绵羊蓝舌病的临床症状绵羊蓝舌病的潜伏期和临床症状可因感染蓝舌病的血清学、绵羊的身体情况、饲养管理水平、虫媒群体情况的不同可出现较大的差异，通常潜伏期为3～10d ，病程为6～14d ，发病率为30%～40%，病死率2%～90%不等[4]。
蓝舌病研究进展
中图分类号 ： ８ ５ 文献标识码 ： Ｓ５ Ａ
文 章 编 号 ：０ ３ ４ ８ （ ０ ８ Ｏ — ０ ４ ０ １０ － ８ ９２０ ）１００ － ４
尤其是南非 ， 直至 １４ 年才在非洲以外的塞浦路斯 ９３ 第一次爆发流行。此后 ， 该病先后在世界各地爆发 。 截止 １７ 年我国尚未确认该病存在。１７ ９９ ９９中 国 云南 首 次 报 导 绵 羊 蓝 舌 病 ， 随后 湖北 （９３ 、 １８ ）安
收稿 日期 ：０ ７ １ － ９ ２ ０ — １２
段， 据此 ， 建立起每一个 Ｂ Ｖ血清型 Ｐ Ｒ 非常方便 Ｔ Ｃ，
地用于牛 、 羊群和传播媒介——库蠓。Ａ ｅ ｒ ｅ ｖｙ ｅ ｒ ｒＢ ｗ
等（９ ５ ） １９ 年 在美 国南部和西部通过分子流行病学 研究提示血清型之间基因片段有 自然重组现象。每 隔 ｌ ０年 Ｂ Ｖ ０型 ２和 ９片 段 同 源序 列 发 生置 换 ， Ｔ１ 这就致使产生一种强毒株 ，引起疾病严重爆发 ， 并
毒 ； 用 Ｖ ２的型 特 异性 ， 过 扩增 Ｒ Ａ 利 Ｐ 通 Ｎ ２核 酸 片
１５ 年就有美利奴和欧洲其它绵羊引入南非 ， ６２ 发现 过一种与绵羊蓝舌病相似的急性热性传染 病的记 载。直到 １ 世纪后期 ， ９ 已经意识到由于绵羊的引进
使南非出现这样一种导致绵羊致死的疾病 ， 并且 由 Ｔ ｅｅ 在 １０ ｈｉｒ ９５年确定 了南非这种致反刍动物死亡 ｌ
羊敏感 ， 发病死亡率较高 ， 并可感染牛和其它多种 反刍动物且呈隐性感染 ，一般不表现临床症状 ， 但 可成为传播本病的重要传染源之一。又是一种典型 的非接 触性 病毒性 传染病 。其 病原 蓝舌 病病 毒
（ ｌｅ ｎｕ ｉ ｓＢ Ｖ Ｂｕｔ ｇｅ ｒ ，Ｔ ）是 呼肠 孤病 毒科 环 状 病 毒 ｏ Ｖｕ 的成 员 。该 病 在 非 洲 大 陆 流行 已有 很 长 的 历 史 。
蓝舌病病毒分子生物学研究进展
部 包绕 着 Ｖ Ｐ １ 、Ｖ Ｐ ４ 、Ｖ Ｐ ６ 和Ｄ ｓ Ｒ Ｎ Ａ基 因组 ，Ｖ ｐ ３自身具 有 光滑 表 面 ， 可供 Ｖ Ｐ ７附着 ，Ｖ ｐ ３ 和Ｖ ｐ ７ 共 同构 成 了病 毒 的核 心 ，所 以 ，Ｖ Ｐ ３蛋 白对 于 Ｂ Ｔ Ｖ的毒粒 结构 具有 十 分 重要 的作 用 。
１ ． ４ Ｍ ４ 基因
Ｍ ４基 因全 长 ２ ０ １ ｌ ｂ ｐ ， 编码 Ｖ Ｐ ４蛋 白 ， 共６ ５ ４ 个 氨 基酸 ， 被 认 为 具 有 某 些 催 化 活 性 。研 究人 员通 过 高 度 纯化 的 Ｖ Ｐ ４ 和含有 Ｖ Ｐ ４的 重组 的 Ｃ Ｌ Ｐ ｓ 证明 了Ｖ Ｐ ４ 具 有 Ｒ Ｎ Ａ的 ５ ’的三 磷 酸 酶 活 性 ，Ｖ Ｐ ４能够 通 过 磷 酰 胺共 价 结合 Ｇ Ｍ Ｐ ， 并催 化 Ｇ Ｔ Ｐ — Ｐ Ｐ ｉ的交换 反应 。 １ ． ５ Ｍ ５ 基因
不 同血清 型 的 Ｌ ２基 因长度 不 同 ， 约３ ０ ０ ０ ｂ ｐ左右 ， 且 存 在较 大 的差异 。来 自不 同地 区 的 同一血清 型 的毒株 之 间 也会 存 在 较 大 差 异 。Ｌ ２编 码 Ｂ Ｔ Ｖ的外 壳 蛋 白 Ｖ Ｐ ２ ， Ｖ Ｐ ２是 血 清型 特 异性 抗 原 ，也是 病 毒血 凝 素抗 原 ， 在 感
个 大 片段 （ Ｌ １ － Ｌ ３ ） ， 节段 基 因组 分 别编码 ３ 个 非结构 蛋 白 （ Ｎ Ｓ Ｉ — Ｎ Ｓ ３ ） 、７个结 构蛋 白 （ Ｖ Ｐ １ 一 Ｖ Ｐ ７ ） 。通 过 双链 Ｒ Ｎ Ａ 基
因组 以 Ｒ Ｎ Ａ为模 板 进行体 外翻 译 ，同时依 据各 基 因 片段 及 所编码 蛋 白的相 互 关 系 ， 查清 了各基 因编 码蛋 白质 和其 分
蓝舌病研究综述
管 尚无权 威 的统计 数据 报道 蓝舌 病对 整个 世 界造 成 的经济 损 失 ，不过 ，据估 算其 每年 造成 损 失在
３ ０亿美 元 以上 ［。蓝舌病 所 带来 直接 的损 失 有死 ３ ］
亡， 产， 流 体重 减轻 ， 产奶 减 少或者 产 肉量减 少 。 更 为严 重 的是一 些 间接 的损 失 ，例 如 一个 国家 爆发 蓝舌病 后 ，其 他 国家都 会 不 同程 度采 取措 施 限制 进 口疫 区 的活 体 动物 、精液 或者 胎 牛血清 等 相 关 制 品。此 外 ，防控 以及 预 防该病 也 需投 入不 少财
该 病 的发 生地仅 限于 南非 ， 发病 的地 区首 次扩展
通常 在感 染病 毒后 表现 出下 列 临床 症 状 ： 发热 ， 面 部水肿 ， 口腔 黏膜 溃疡或 出血 。 易感动 物被 引入 当 有 Ｂ Ｖ毒 株流 行 的地 区或者 Ｂ Ｖ毒株 传播 到 先前 Ｔ Ｔ
未发 过蓝 舌病 的 畜群 中 ， 舌病很 容 易发 生 ＿。 蓝 ２ 尽 ］
毒 嘲 当蓝 舌病 的易感 宿主 ， 。 蓝舌病 病毒 和 昆虫媒 介 同时存在 的时候 ， 蓝舌病能够快 速发展 并传 播 。
一
般 认为 该病毒 的分布 范 围在 北 纬 ４ 。至 南 ０
纬 ３ 。之 间，这 刚好是传 播媒 介— — 某些 种 的库 ５
蠓 的分布 地域 。但在 美 国和 中国 ， 该病 的分布 范 围可 以一直 扩展至 北纬 ５ 。附近 ［。 ９ ０年 以前 ， ０ ９ １４ ］
ｃ ｔ ｒ ｈ ｌ ｆ ｖ ｒ 或 者 流行 性 恶 性 卡 他 热 （ｐ — ａ ａｒａ ｅｅ） ｅ ｉ ｚ ｏ ｉ ａ ｉｎ ｎ ａ ａ ｒ ａ ｅ ｅ ） ９ ３年 ， ｏ ｔ ｃ ｍ ｌ ｇ ａ ｔ ｃ ｔ ｒ ｈ ｌｆ ｖ ｒ 。１ ３
反刍动物蓝舌病的诊断及防控措施
本 病 以幼 龄绵 羊 最 易 感 染 ，
牛、 山羊 等 动 物 的 易感 性 相 对 较
低 ， 一般 不表现任 何症状 ， 多 为 隐性感 染 。病畜 和带 毒畜 是蓝 舌 病 的 主要 传 染 源 ， Ｂ Ｔ Ｖ能 够 在 生 物 传 媒 库 蠓 体 内大 量 增 殖 并 长
期生存 ， 且 能 够 在 昆虫 幼 虫 中越
验 ，在 荧 光 镜 下 ， Ｂ Ｔ Ｖ 可见 细 胞 胞 浆着 染 ，呈 现 星状 绿 色 颗粒 ； 中和试 验 能 够用 于 区别 血 清 型 ，
能 够 长 期 存 活 。Ｂ Ｔ Ｖ 对 胰 酶 敏 感， 对 ０ ． １ ％去 氧 胆 酸钠 、 氯 仿 和
乙醚 有 耐 受 力 ， ３ ％氢 氧 化 钠 和 过氧 乙酸 能够 将其 灭 活 。 ２流 行 病学
腹泻 、 牛 口蹄 疫 、 牛 恶 性 卡 他 热
Ｂ Ｔ Ｖ 的病 畜 在 临 床 上 症 状 差 异 较 大 。总 之 ， 本 病 的临 床 症 状 以
冬， 也 可作 为一 种 重要传 染 源 。
及 牛茨 城 病 等 病较 为 相 似 ， 要 注
中国 动物 保 徭 ２ ０ １ ７ 年ｆ 第 ７ ９ 卷） 第 ３期 ５ １
展， 病牛唇部肿胀 、 流涎 ， 蹄冠、 蹄 叶发 生 炎 症 ， 呈 不 同程 度 的跛 行或卧地不起 ； 妊 娠 病 畜 能 够 出 现 流 产 、胎 儿 积 水 性 无 脑 畸形
本 病 可 通过 流 行 特 点 、 临床
症 状 和病 理 变 化进 行 初 步 诊 断 。
通 过实验 室检查 进行 确诊 。采集 全 血及 病 畜 的淋 巴结 、 肾脏 、 脾 脏、 肝 脏 和 精 液 作 为病 料 ， 进 行 酶 联免 疫 吸附 试验 （ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ） ， 用 ５ ０ ％抑 制为判 定值 ；免疫荧 光 试
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蓝舌病病毒基因和蛋白的特点及利用李辰龙;王洪斌;宋新刚;孙心【摘要】蓝舌病病毒是引起绵羊、牛蓝舌病的病原.该病毒是一种结构复杂的RNA 病毒,对其分子生物学特性的研究,可以阐明其致病机制和遗传学规律,有助于蓝舌病预防治疗的研究.国内对该病毒的研究起步较晚,本文简述了蓝舌病病毒基因结构和蛋白特点及对其的利用,为预防及治疗提供参考.%Bluetongue virus is the cause of sheep, bovine bluetongue diseasepathogen. Bluetongue virus is a complex structure of the RNA virus, the research on the molecular biological characteristics, can clarify the patho-genesis and genetics law, have treatment to help blue tongue disease prevention study. The domestic research of bluetongue virus started late, this paper describes the disease virus gene structure and protein characteristics of blue tongue and to its use, in order to provide reference for the prevention and treatment.【期刊名称】《中国动物保健》【年(卷),期】2015(017)005【总页数】3页(P66-68)【关键词】蓝舌病病毒;基因蛋白;免疫预防【作者】李辰龙;王洪斌;宋新刚;孙心【作者单位】东北农业大动物医学院黑龙江哈尔滨150030;东北农业大动物医学院黑龙江哈尔滨150030;哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069;哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069【正文语种】中文蓝舌病病毒（bluetongue virus,BTV）属于呼肠孤病毒科、环状病毒属，是环状病毒属的代表种。
绵羊对BTV最易感，牛、山羊和鹿亦可感染该病毒。
BTV是引起家养和野生反刍动物蓝舌病的病原体，几乎完全通过特定种类库蠓叮咬传播[1]。
蓝舌病是世界动物卫生组织(OIE)法定报告疾病名录中规定的A类传染病。
该病对畜牧业造成了严重影响，导致了巨大的经济损失。
我国对BTV的研究起步较晚。
本文简述了蓝舌病病毒基因结构和蛋白特点及对其利用，为预防及治疗提供参考。
BTV颗粒较大（直径约70～80 nm），呈20面体对称，无囊膜，由外层的核衣壳、核衣壳外的细绒毛状层以及10个大小不一的双股RNA基因片段组成。
病毒颗粒的外层衣壳由VP2和VP5两种主要蛋白构成，内层衣壳由VP3、VP7)两种主要蛋白和VP1、VP4和VP6三种次要蛋白构成[2]。
BTV的基因组为双链、分节段RNA，以高度有序的形式存在于核芯中。
BTV病毒有10个大小不一的双股RNA片段组成。
10个基因片段分别编码7种结构蛋白(VP1-VP7)和4种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3a、NS3b)。
10个独立的RNA片段分别命名为L1-3、M4-6、S7-10除S10节段外每个节段编码一种蛋白[3]。
3.1 三种少量蛋白VP1、VP4、VP6BTV病毒进入易感细胞的过程中会脱去外层衣壳，形成由5种结构蛋白(VP1、VP3、VP4、VP6和VP7)和10条基因组dsRNA组成的核芯颗粒。
VP1蛋白具有RNA依赖的RNA聚合酶活性[4-5]，表达的重组VP1蛋白在缺少其他核芯蛋白的情况下，依然可以有效地进行RNA的合成；而且其不仅能以病毒自身的RNA为模板进行RNA合成，还可以以外源RNA为模板合成RNA。
但自然条件下，BTV的VP1蛋白不会以宿主RNA为模板进行RNA合成。
VP4特异性识别病毒自身RNA的机制目前还不明确。
VP6蛋白富含赖氨酸和精氨酸，可以结合并催化dsRNA解螺旋，VP6蛋白核酸结合活性具有浓度依赖性，而且与构象有关，其可以催化粘末端或平末端dsRNA 解螺旋。
VP6蛋白较保守，被认为是一种群特异性抗原[6]。
3.2 四种衣壳蛋白VP2、VP3、VP5、VP73.2.1 两种内衣壳蛋白VP3、VP7分别有L3和S7节段编码。
病毒的内衣壳由VP3和VP7组成，包裹着3种少量蛋白和病毒基因组，是病毒的核心颗粒，同时VP3和VP7构成的内衣壳是外层衣壳组装的基础。
2种蛋白都高度保守，属群特异性抗原。
VP3蛋白在BTV病毒的衣壳成分中在最内层，对维持病毒核芯颗粒结构的完整性非常重要。
VP3蛋白分为A和B两种构形，其化学组成完全相同，但有不同折叠方式。
这种构象上的微小差异使VP3蛋白形成闭合的亚核芯层结构。
VP3亚核芯层为VP7蛋白三聚体的附着提供了“脚手架”[7]。
同时，VP3亚核芯层还与包裹的3种少量蛋白和基因组dsRNA紧密结合。
VP3蛋白的保守性对于维持病毒粒子的结构非常重要。
VP7蛋白也具有保守性，这种保守性决定了病毒较强的群属特异性，VP7蛋白在病毒的血清学诊断方面用来判定群属性。
VP7蛋白以三聚体形式组装在VP3蛋白构成的亚核芯层表面，形成内衣壳的外层。
BTV的VP7蛋白含有RGD（精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸）三肽基序，位于蛋白的168～170 aa位，RGD基序是病毒在宿主体内整合家族蛋白识别的一种配体位点，介导病毒与宿主细胞膜的吸附[8]。
因此，VP7蛋白除了参与病毒颗粒的构成，还可以与宿主细胞膜结合。
但VP7蛋白是否直接参与病毒核心颗粒的穿膜尚不清楚。
3.2.2 两种外衣壳蛋白VP2、VP5二十面体构型的环状病毒核芯颗粒被外衣壳所包绕，外衣壳由VP2和VP5两种蛋白构成。
VP2和VP5蛋白分别由L2和M5节段编码。
VP2蛋白是蓝舌病病毒结构蛋白中变异性最强的蛋白，其氨基酸序列的突变率为22.4%～73%。
VP2蛋白位于病毒粒子的最外层，亲水性强，包含可被中和的血凝抑制（HI）抗体识别的血清型特异性表位，可以诱导产生中和抗体，虽然其部分抗原表位是保守的，但蛋白的突变改变了VP2蛋白的构象，导致表位的空间位置发生改变，使抗体无法中和病毒。
VP2的氨基端很强的变异性，可能决定着病毒存在很多种的血清型，具有种特异性。
BTV的VP2蛋白具有血凝素活性，可以与宿主细胞表面的血型糖蛋白A相结合。
VP5蛋白分子以三聚体形式存在于病毒粒子的外层衣壳中，120个三聚体整齐分布于核芯颗粒的VP7上。
VP5蛋的保守性较VP2蛋白强，不同血清型BTV间同源性为70%以上。
同VP2蛋白一样VP5蛋白也能诱导产生中和抗体。
但因VP5蛋白的同源性较高，所以产生的中和抗体特异性不强，具有群特异性，VP5蛋白的近氨基端处存在两个“两亲性螺旋”，与蛋白的膜融合活性相关。
VP5蛋白插入细胞膜中会破坏细胞膜的完整性，使细胞膜透性化[9-11]。
VP2和VP5组成的BTV的外衣壳蛋白可以引起细胞凋亡，但凋亡并不是由病毒的复制所引起，而是由病毒脱衣壳过程所引起。
抑制内体的酸化可以抑制这种促凋亡作用。
3.3 四种非结构蛋白NS1、NS2、NS3a、NS3b目前，在BTV病毒感染的细胞中已经检测到了4种非结构蛋白(NS1、NS2、NS3a和NS3b)。
4种非结构蛋白在不同血清型BTV之间保守性很强[12]。
非结构蛋白在病毒粒子的组装和运输过程中起重要作用。
NS1在蓝舌病病毒编码的蛋白中表达量最高，是一种型特异性抗原。
BTV的NS1蛋白可以自发聚集成微管结构，NS1蛋白富含半胱氨酸，所有16个半胱氨酸残基在不同血清型的BTV之间是保守的[13]。
NS1蛋白与NS3蛋白表达量之比可能决定了病毒释放方式。
NS1蛋白介导病毒通过细胞裂解释放，而NS3蛋白介导病毒通过出芽方式释放。
病毒释放方式的不同决定了对细胞损伤程度的不同。
NS2蛋白是病毒包涵体(VIB)的主要成分，存在病毒感染的细胞中，主要分布于细胞核附近。
病毒核心颗粒的组装即发生在包涵体中。
NS2蛋白可以被激酶催化磷酸化，磷酸化之后结合单链RNA的活性降低20%～30%，但磷酸化对于包涵体的形成是必须的[14]。
BTV的S10节段是基因组节段中最小的一个。
S10基因的开放阅读框中有2个保守的起始密码子翻译分别产生2种氨基酸组成相似的蛋白-NS3a和NS3b，其在病毒感染的细胞中两种蛋白的表达量都很少。
NS3a/NS3b蛋白翻译后，通过高尔基体运送至细胞膜，可以插入细胞膜中，破坏细胞膜的稳定性，可能与BTV的致病性相关[15]。
NS3a/NS3b可以介导病毒粒子的运输和释放，来帮助病毒粒子的释放[16]。
BTV可以在传播媒介库蠓等的昆虫体内，根据基因特点可以利用昆虫体内的RNA 片段进行复制繁殖，且病毒的流行具有地域性特点，某一种或几种血清型的病毒只在固定的地区流行。
根据BTV基因结构和蛋白，基因片段多，且不同片段特异性编码复制一种蛋白的特点，可以制备基因缺失疫苗，把病毒产生致病性的基因剪切掉，制成基因缺失苗。
如剪切掉控制VP5蛋白两个“两亲性螺旋”合成的基因、剪切掉S10基因阶段控制NS3a和NS3b蛋白合成的片段，然后将基因缺失的病毒在适合的细胞上进行传代培养，收获后加入保护剂制成冻干活疫苗。
接种免疫后即可以有效的对动物进行保护，又避免了病毒在接触传递过程中的返祖增强。
还可以把同一地区流行的几种血清型的具有免疫原性的基因剪切合成在一起，制成基因重组的亚单位疫苗，这样免疫后可以对当地流行的不同血清型的蓝舌病病毒，都可以起到预防作用。
根据BTV血清型区域流行的特点，可以将区域流行的血清型的病毒，制成基因缺失苗或亚单位合成苗的活疫苗后，对经检测蓝舌病病毒阴性的动物，羊或牛进行免疫，然后让库蠓等传播媒介昆虫叮咬，病毒在其体内复制增殖，再叮咬其他动物就会对其进行接种免疫。
也可以直接对库蠓等昆虫进行疫苗接种，然后再通过库蠓对其他动物的叮咬进行间接免疫。
蓝舌病病毒是结构上最复杂的RNA病毒之一，由多种病毒蛋白和多节段的RNA 基因组构成，给研究工作带来了较大的挑战性。
国外BTV分子生物学方面的研究起步较早，目前已经可以通过RNA获得具有感染性的病毒粒子，并正在通过反向遗传技术对BTV的分子进行更加直接和接近真实的研究。
这种方法将成为BTV分子生物学研究中一种更加有效的工具。
目前，对于BTV蛋白功能的研究还存在许多矛盾之处，另外BTV在哺乳动物细胞和媒介昆虫细胞中复制机制的不同还有待阐明。
BTV的分子生物学研究有助于阐明其致病机制和遗传规律，对于蓝舌病的防治具有重要意义，同时对阐明生物分子之间相互作用机制以及分子功能也有很大帮助。