细胞免疫荧光步骤

方法一:

1.首先需要把细胞养在玻璃片上(悬浮细胞需要用多聚赖

氨酸包被过的玻璃片)

2.然后在４%PＦA里面室温下固定30分钟,ＰBS洗两次，

0。1% TX—100室温下作用1－2分钟使细胞膜通透....

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3.接下来进行荧光标记,需要在一个大的容器(面积大,扁

平状的，比如大的培养皿）里面,放一张用水打湿的滤纸,以保持湿度....文档交流仅供参考...

4.剪一片合适大小的parafilm,在上面滴上稀释在1％BＳ

Ａ／TBS中的一抗（稀释倍数依具体抗体而定),每个玻璃片30ｕl足够，把玻璃片盖在上面(细胞面朝下），室温下孵育30分钟，然后在PＢS里洗三次。...文档交流仅供参考...

5.接下来二抗孵育步骤同上.

6.最后，在载玻片加上mouｎting medium(大约每个玻璃

片加1０uｌ),把玻璃片放上去(细胞面朝下），３7度30分钟，然后就可以在荧光显微镜下观察了。...文档交流仅供参考...

7.抗体很重要,不能有非特异性结合。你可以先做WB检测

一下你的抗体,看看有没有杂带.

8.双标的话,可以把两个一抗一起加或者分别标记两次

(可以都试一下看看那种方法合适）。如果一个抗体需要二抗，一个是直接荧光标记的,可以把荧光标记的那个和另外一个的二抗一起加。...文档交流仅供参考...

方法二：

1.选取一抗时要来源于两种不同的动物,我用的是来源于

rabbit和ｒat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，

我用的是donkｅｙ anti—rａbｂit—FＩTC（绿)和do ｎkey anti—rat－Ｔｅx－Ｒed(红）....文档交流仅供参考...

2.我的做法是两种一抗同时孵育,然后两种二抗同时孵

育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，我感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。...文档交流仅供参考...

3.我的阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是

家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是ＰBS+荧光标记物。...文档交流仅供参考...

4.封闭血清与二抗来源动物一致，我用的是10％的正常

donkey血清。

5.其余步骤同一般免疫荧光单标操作。

方法三：

1.片子的制作：可以做细胞爬片,细胞甩片,还有直接在２

4ｗelｌ/12ｗelｌ/96ｗell中直接染色

2.细胞爬片的制作:直接购买公司的已经处理过的细胞

爬片,要是自己制作的话，就用无菌的盖玻片用多聚赖氨酸处理后让细胞自己爬片...文档交流仅供参考...

3.细胞甩片：需要甩片机将细胞悬液均匀甩到玻片上。

4.其实小的ｗelｌ的话，可以直接拿来染色,没问题的。

5.固定：用PBS洗去培养液,用固定液（如甲醇和丙酮;4％

多聚甲醛；酒精.。.）固定细胞.

6.内源性过氧化物酶处理，3%过氧化氢处理细胞（选作，

二抗连HRＰ得必做，其他的如做免疫荧光染色不用做)。...文档交流仅供参考...

7.通透(胞浆蛋白和细胞核蛋白需要做；细胞膜蛋白不需

要做）,一般选用Tritｏn－X1０0来做细胞通透,浓度和时间需要摸索，一般是0。1-5％,处理时间为1－３0分钟，级个别需要到1—2小时。...文档交流仅供参考...

8.封闭:洗去通透液,用二抗同源的血清约10%的浓度in

PＢS中封闭半小时，也可以选用5-10%脱脂奶粉.封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。...文档交流仅供参考...

9.一抗:具体你想做什么样的蛋白,咨询抗体公司如sａ

ｎtａ crｕze，Aｂcaｍ，siｇmａ。.。..选取具体的抗体，但是一抗的稀释浓度也是要摸索,抗体稀释液可以购买抗体公司现成的，对于新手还是挺好的。时间一般是4度过夜或者３7度1小时。一抗最好还是选用外国抗体公司的抗体。...文档交流仅供参考...

10.洗去一抗。

11.上二抗，二抗一般抗体公司会给你推荐的,你在其中选

上一个就行了，自己选国产的也行，就是选在哪个动物体内做的一抗，二抗就选抗那个动物的就行了。二抗的浓度也是需要摸索的,抗体稀释液和一抗相同就行了。二抗的时间一般是3７度半小时。...文档交流仅供参考...

12.底物显色（选作，二抗连得是酶的必做,按试剂盒的说

明书添加就行了,显色时间可能需要摸索，以免显色过度引起假阳性；二抗连得是荧光报告的不用做)...文档交流仅供参考...

13.洗去二抗,染核

14.DAPI或者Hｏeｃｈst染核

15.洗去染核液,加PＢS,上镜观察.

方法四：

(1)细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时,将细胞接

种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中,待细胞接近长成单层后取出盖玻片，ＰBS洗两次；对悬浮生长细胞,取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（１0００rｐm，5mｉn）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。...文档交流仅供参考...

(2)固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕

后的细胞可置于含叠氮纳的ＰBS中4℃保存3个月。P ＢS洗涤３×5 ｍiｎ。...文档交流仅供参考...

(3)通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需

要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5—1５min.通透后用PBS洗涤3×5 min....文档交流仅供参考...

(4)封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min.

(5)一抗结合。室温孵育1ｈ或者4℃过夜。PＢST漂洗3次,

每次冲洗5ｍiｎ.

(6)二抗结合.间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育

1h。PBＳT漂洗3次,每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。...文档交流仅供参考...

(7)封片及检测。滴加封片剂一滴，封片,荧光显微镜检查。方法五:

1．漂洗血清蛋白PH7.2—7.4,3７度 PBS 2小时。

2．－20度甲醇固定20分钟后，自然、干燥 10分钟3．PBS洗净：3ｍin*３

4．1％Tｒｉton：2５min—３0ｍｉn．配成50ulｔrｉton ＋５mlpＢS

5．ＰＢＳ洗净:2*5ｍin

6．羊血清封闭:37度，20分钟

7．一抗,4度过夜，一般要大于１８小时或者3７度１-２小时

8．4度PＢS洗净,3mｉn＊5次

9．二抗 37度小于一小时

10．37度PＢS洗净，3＊３mｉn

11．凉干封片（封闭液PＨ８。５）

细胞免疫荧光步骤:

1.细胞爬片;首先是玻片的处理,普通的盖玻片用砂轮划成自己要的大小的小方块，先用洗衣粉洗干净，用水冲静烤干,然后泡酸过夜,捞酸后流水洗净,烤干,置于器皿