微生物生化鉴定

常用生化试验 一．糖、醇发酵试验 1.糖、醇发酵试验 原理：各种细菌因含有发酵不同糖、醇的酶，所以分解糖、醇的能力个不相同。有的能分解某些糖、醇类，有的则不能分解。有的分解某些糖、醇类发酵产酸产气，有的仅产酸，而不产气。根据这些特点，可鉴别细菌。 培养基：糖发酵试验应用的培养基种类很多，大致可分为液体，半固体，固体（高层、斜面）等几类。可根据试验的要求和细菌的特性来选择。 2.乙酰甲基甲醇试验（V-P试验） 原理：某些细菌如产气杆菌，分解葡萄糖产生丙酮酸，并将丙酮酸脱羧，变为乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境下，被空气中的氧氧化成二乙酰，二乙酰与培养基内蛋白胨中精氨酸所含的胍基起作用，生成红色的化合物。故在培养基中加入少量含胍基的化合物，如肌酸、肌酐可增加胍基含量。试验中加入的α-萘酚为催化剂，可加速此反应，使反应颜色增加，提高反应的敏感性。大肠埃希菌不能将丙酮酸脱羧，故V-P试验呈阴性。 培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 3.甲基红试验（MR试验） 原理：许多细菌如大肠埃希菌等，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸再次被分解，产生甲酸、乙酸、乳酸等，这样使培养基的PH降至以下。这时加入甲基红指示剂呈红色。若细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其他物质（如醇、酮、醛、气体和水等），则培养基的酸度仍在以上，故加入甲基红指示剂呈黄色，为阴性反应。 培养基：磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基 MUG葡萄糖醛酸苷酶试验 原理：细菌的葡萄糖醛酸苷酶在碱性条件下，作用于4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖醛酸甘（4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide简称MUG）的β葡萄糖醛酸甘键，使其水解，释放的4-甲基伞形酮在366nm紫外灯下产生蓝白色荧光。 培养基：MUG培养基 4.β-半乳糖苷酶试验 原理：肠杆菌科细菌发酵乳糖，依靠半乳糖苷渗透酶和β-半乳糖苷酶两种不同的酶作用，能水解邻硝酸酚-β-D半乳糖苷（O-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,ONPG），而释放出黄色的邻硝酸酚。发酵乳糖的细菌具有上述两种酶，可迅速分解乳糖。迟缓发酵乳糖的细菌只有β-半乳糖苷酶，而缺少半乳糖苷渗透酶或是其活性很弱，不能将乳糖很快运送到菌细胞内，通常需要延长培养时间数天，乳糖才被分解。本实验主要鉴别肠道细菌，乳糖发酵及乳糖迟缓发酵菌为阳性反应，非乳糖发酵酶为阴性。本试验可作为迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴定方法。 5.葡萄糖氧化-发酵（O/F）试验 原理：细菌对糖的代谢分为氧化型和发酵型两种。在有氧环境下氧化完全，生成二氧化碳和水。在无氧环境下，进行不完全的分解（发酵），生成酸类、醇类和气体。氧化型的细菌在无氧环境中，不能分解糖。发酵型的细菌无论在有氧或是无氧的环境中均可分解糖。 葡萄糖氧化-发酵试验有助于假单胞菌、硝酸盐阴性杆菌、粪产碱杆菌的鉴别。 培养基：氧化发酵试验培养基 6.石蕊牛乳试验 原理：牛乳中含有大量的乳糖和酪蛋白，营养丰富，一般细菌均能在其生长，但各种细菌对这些物质的分解能力不同，可观察的反应也不同，在培养基中加入石蕊是作为酸碱指示剂和氧化还原指示剂，可观察到不同的反应结果。 产气荚膜梭菌对牛乳具有强烈的发酵反应，产酸、产气、凝固、胨化几乎同时发生。所产生的气体，可将培养基表层的凡士林冲至管口，牛乳可全被胨化变清，这种“暴风雨”样的发酵现象称为“汹涌发酵”，为该菌所特有。乳链球菌可使牛乳培养基产酸、凝固，并可使石蕊还原。 培养基：石蕊牛乳培养基 二．氨基酸和蛋白质代谢试验 1.靛基质试验 原理：某些细菌，如大肠埃希菌、变形杆菌等，能分解培养基蛋白胨中的色氨酸，形成靛基质（吲哚）。靛基质无色，与试剂对二甲氨基苯甲醛作用后，形成红色化合物-玫瑰靛基质。本试验常用于肠杆菌科种属鉴别，大肠埃希菌98%为阳性反应，肺炎克雷伯菌、沙门菌为阴性反应。 培养基：胰蛋白胨水培养基 2.硫化氢产生试验 原理：检查肠杆菌科娥硫化氢试验，是利用细菌对于培养基中硫代硫酸钠或硫酸钠、亚硫酸钠的还原作用，生成硫化氢。硫化氢是无色气体，遇硫酸亚铁或枸橼酸铁铵，产生不溶性黑色沉淀物硫化亚铁。 按此原理设计的硫化氢试验，适用于肠杆菌科细菌的鉴定。沙门菌，弗劳地枸橼酸杆菌，缓慢爱德华菌，莱克勒菌属和变形杆菌属为阳性反应，其他细菌均为阴性反应。在沙门菌属中，亦有硫化氢阴性的菌型，如甲型副伤寒、仙台、猪霍乱沙门菌等，伤寒沙门菌中亦有部分菌株为硫化氢阴性。 培养基：三糖铁琼脂或克氏双糖铁琼脂培养基。 3.尿素酶试验 原理：某些细菌，如变形杆菌具有尿素酶，能分解培养基中的尿素而产生大量的氨，使培养基成碱性，培养基中的酚红指示剂呈红色。 本试验常用语鉴别变形杆菌属。变形杆菌属能分解尿素呈阳性反应，其他肠道细菌的尿素酶试验多数为阴性反应。 培养基：尿素培养基 4.明胶液化试验 原理：明胶是一种胶原蛋白，不具有一般蛋白质加热凝固的特性，其水溶液在24摄氏度以下为凝胶状态。明胶可被细菌的胶原酶分解为氨基酸，分解后的明胶，凝固力降低，低于20摄氏度不再凝固，呈液化状态。 本试验为细菌鉴定的常规实验法。铜绿假单胞菌，荧光假单胞菌，腐败假单胞菌等为阳性反应，肠杆菌科细菌很少液化明胶。 培养基：明胶培养基。 5.氨基酸脱羧酶试验 原理：细菌分解氨基酸使其脱羧，生成胺和二氧化碳，此为脱羧反应，需要细菌所产生的脱羧酶完成反应。各种细菌产生的脱羧酶不同，对各种氨基酸底物所产生的胺亦不相同，但均可使培养基变碱，由培养基中的指示剂显示出来。 培养基：氨基酸脱羧酶培养基 6.精氨酸双水解酶试验 原理：细菌分解精氨酸产碱不限于精氨酸脱羧酶。精氨酸可通过精氨酸脱酰胺酶及瓜氨酸酶，经两次水解，先生成瓜氨酸和氨，后形成鸟氨酸、氨及二氧化碳。鸟氨酸又在鸟氨酸脱羧酶的作用下生成腐胺及二氧化碳。 氨和腐氨均为碱性，由培养基中的指示剂显示出来。 培养基：含精氨酸的氨基酸脱羧酶培养基或用Thomley精氨酸培养基，后者常用于假单胞菌属鉴定。 7.苯丙氨酸脱氨酶试验 原理：变形杆菌属可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应。 本试验主要用于肠杆菌科细菌鉴定，变形杆菌属均为强阳性反应，而肠杆菌科其他细菌则为阴性反应。 培养基：苯丙氨酸琼脂培养基。 三．碳源和氨源利用试验 1.枸橼酸盐利用试验 原理：枸橼酸盐培养基是一综合性培养基，其中枸橼酸钠为碳的唯一来源，磷酸二氢铵为氮的唯一来源。有的细菌如产气肠杆菌等，可以利用枸橼酸盐作为碳源，能在此培养基上生长，并且分解枸橼酸盐而最后产生碳酸盐，使培养基变为碱性。这样培养基中的溴麝香草酚蓝指示剂由绿色变为蓝色，为枸橼酸盐利用实验的阳性反应。若细菌不能利用枸橼酸盐作为碳源，则在此培养基上不能生长，培养基不变色，为枸橼酸盐利用实验的阴性反应。 本试验主要用于肠杆菌科细菌鉴定，大肠埃希菌、志贺菌属、爱德华均属和耶尔森菌属均为阴性，沙门菌属，克雷伯均属，枸橼酸杆菌和魔秀变形杆菌通常为阳性反应。此外，铜绿假单胞菌、洋葱假单胞菌和嗜水气单胞菌亦为阳性。 培养基：西蒙枸橼酸盐培养基 2.丙二酸盐利用实验 原理：当细菌利用丙二酸盐作为唯一碳源时，丙二酸钠可被分解成碳酸钠，使培养基变碱。沙门菌亚属ⅡⅢ及肺炎克雷伯菌为阳性反应，枸橼酸杆菌属、肠杆菌属和哈夫尼亚菌属有不用生物型反应，其他各菌属为阴性反应。 培养基：丙二酸钠培养基。 3.其他有机酸盐利用试验 原理：酒石酸受细菌酶的作用，可分解为乙酸，草酸等比较简单的有机酸。枸橼酸经细菌酶的作用进入三羧酸循环被分解为琥珀酸、乳酸、乙酸等。这些有机酸的生成，使培养基的PH值下降，这可由培养基中的指示剂变化显示出来。同时未分解的酒石酸和枸橼酸可与加入的醋酸铅试剂形成铅盐沉淀，故可判断反应程度。 细菌的酒石酸分解酶对各种酒石酸光学异构体的分解具有特异性，故可用于细菌的鉴别，此外，粘液酸经分解后也可形成简单的有机酸，亦可由PH降低时指示剂颜色变化进行判断。 本试验用于肠杆菌科细菌鉴别。沙门菌属大部分菌属的右旋酒石酸盐利用试验为阳性，志贺菌属为阴性，沙门菌属对左旋酒石酸盐有不同反应，其他菌属均为阴性，不分解粘液酸的只有志贺菌属。 培养基：有机酸盐培养基 四．酶类试验 1.氧化酶试验 原理：某些细菌如奈瑟球菌和铜绿假单胞菌，具有氧化酶，能将盐酸二甲基对苯二胺四甲基对二胺试剂氧化成红色的醌类化合物。 2.细胞色素氧化酶试验 原理：某些细菌如铜绿假单胞菌，具有细胞色素氧化酶，在有分子氧存在的情况下，将试剂盐酸二甲基对苯二胺氧化，并与α-萘酚生成吲哚芬蓝，而出现蓝色。次试验常与氧化酶同时进行。 3.触酶试验（过氧化氢酶试验） 原理：细胞代谢产生的过氧化氢对细菌细胞有毒，而细胞内的过氧化氢酶能催化过氧化氢，使其分解为分子态氧和水，使其解毒。在含有过氧化氢酶的细菌培养物上滴加过氧化氢溶液后，立即产生大量气泡，为阴性反应。绝大多数细菌的琼脂培养物均产生过氧化氢酶，但链球菌属为阳性，故用于鉴别葡萄球菌、微球菌（阳性）与链球菌。乳酸菌及梭菌为阴性。 4.硝酸盐还原试验 原理：某些细菌如肠道杆菌，能还原培养基中的硝酸盐为亚硝酸盐，亚硝酸盐与试剂中的醋酸作用，生成亚硝酸，亚硝酸与试剂中的对氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，在与试剂中的α－萘酚结合成N－α－萘酚偶氮苯磺酸（红色）。本实验在细菌鉴定中广泛使用，肠杆菌科均为阳性反应。 培养基：硝酸盐培养基 5.硝酸盐还原产气试验 原理：有些细菌可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，并将亚硝酸盐分解成氮气，观察有无产气现象，即为亚硝酸盐还原产期试验。本试验常用于鉴别铜绿假单胞菌和其他假单胞菌，前者为阳性反应。 培养基：硝酸盐胨水培养基 6.血浆凝固酶试验 原理：测定葡萄球菌的致病性，通常以能否产生血浆凝固酶为准，产生者为致病菌株，不产