高级分子生物学

课 程 论 文 课程名称：高级分子生物学 任课老师：谭晓风（教授） 姓 名：

2007年7月8日 木本植物分子生物学的研究进展 (中国林科院林业所,北京100091) 摘要 分子生物学是近40年发展起来的一门新兴边缘科学,最初的发展主要以 微生物为研究对象,木本植物进展相对缓慢。随着研究的深入,以树木为受体的 分子生物学也取得了令人瞩目的成绩,树木转基因、基因表达调控、基因图谱、寻 找数量性状位点、基因组变异和进化等方面的研究相继开展起来。 关键词 分子生物学 基因工程 调控 基因图谱

分子生物学研究是1953年Watson和Crick提出了DNA双螺旋结构而真正揭开序 幕的。近40多年来,特别是基因工程研究的深入开展,无论是理论上还是实践上,都涌现 出一批突出的成果,其中微生物方面的进展最快,植物分子生物学研究要稍慢一些。 对树木来说,由于其生长周期长,基因组结构比较复杂,遗传操作不易,使得树木分子 生物学研究,与农作物等其它草本植物相比,一直处于比较落后的位置。近几年来,随着分 子生物学研究技术的不断成熟,对基因分子生物学理论和实践认识的不断提高,木本植物 分子生物学也取得了一些长足的进步。主要表现为:从树木基因组中分离和克隆新的有益 操作基因;转基因树木种类不断增多;以树木为受体研究某些外源基因的表达和功能;树 木基因图谱工作也开展起来,并以得到的基因连锁图谱为工具,分离和寻找合适的数量性 状位点 1 树木转基因研究的深入发展 70年代以来,基因重组技术和植物肿瘤发生分子生物学研究相继取得重大突破,使 得植物基因工程迅速发展起来。80年代中后期,由于迫切需要培育出具有抗性的优良树 种,促使树木基因工程也取得了飞速发展。 到目前为止,进行了遗传转化的树种有:杨树、核桃、刺槐、麻栎、桤木、桉树、苹果、李、 猕猴桃、鹅掌楸、胶皮枫香树、火炬松、欧洲赤松、白云杉、挪威云杉、花旗松等20余种。真正获得转基因植株的有杨树、核桃、苹果、李、葡萄。其中作为林木基因工程模式植物的杨树基因工程发展最快。 1987年Fillatli等人利用根癌农杆菌的Ti质粒为载体将NPTII基因导入杨树杂种 NC5339内,并经Southern Blot证明确有外源基因的存在,这是以树木为受体首次转化 获得的转基因植株[15]。次年他们运用同样方法又把抗除草剂草苷膦基因aroA基因转入 杨树杂种体内[16]。1990年王善平等人利用改造的Ti质粒,采用叶盘法转化毛白杨外植 体,结果表明转化苗中含有特异的胭脂碱活性[11],1991年,卜学贤、林忠平等人,分别利用 Ri质粒和Ti质粒进行毛白杨的遗传转化,获得转化植株,经Southern Blot证明呈阳性 反应[12]。以上这些工作的成功,都证明遗传转化技术的可行性。 在此基础上,以树木遗传改良为目的转化外源基因的工作也同时开展起来。目前导入 木本植物的外源基因主要有:来自沙门氏菌的aroA基因和来自吸水链霉菌的bar基因, 两者都能使受体植物获得对除草剂的抗性,来自苏云金杆菌的Bt基因和马铃薯、慈菇、水 稻等的蛋白酶抑制剂基因,它们能赋予或增强受体植物的抗虫性或对机械损伤的保护反 应能力[10,13,16~19]。1988年美国依阿华大学林学系,首先利用从马铃薯中提取的蛋白抑制 剂基因(proteinase inhibitor z)为目的基因,与NPTII基因构成嵌合基因,以根癌农杆菌 的Ti质粒为载体,对杨树杂种无性系NC5339进行了转化,获得了抗卡那霉素的植株[19], 其抗虫效果未见报道。1991年中科院微生物所的田颖川和中国林科院的韩一凡合作,利 用Ti质粒的双元载体系统把苏云金杆菌δ-内毒素基因(Bt基因)转入到欧洲黑杨中,获 得了转基因植株,Southern Blot证明该基因稳定插入到杨树基因组中,虫试测定表明,其 毒杀鳞翅目害虫舞毒蛾和杨尺蠖的能力高达76%~100%[10]。现在又开展了运用多种蛋 白酶抑制剂进行抗虫转基因的工作。另外,还有好几个研究小组正在进行这方面的研究。 加拿大Laval大学的Lise Jouanin正在用从水稻中提出的半胱氨酸型蛋白酶抑制剂进行 转基因试验。 为了提高木本植物纤维产量和质量,比利时Gent大学的Wout Boerjan实验室构建 了反义木质素生物合成关键酶,如0-甲基化转移酶(OMT)和肉桂酸醇脱氢酶(CAD)等 的基因,转入植物体,并获得了转基因植株,结果表明,转基因植株体内木质素合成单体含 量明显变化。加拿大British Columbia大学的Ellis研究小组从杨树中分离出4-香豆素 -辅酶A连接酶(4CL)基因,在反义构建到载体中转化烟草和杨树,研究木质素合成中 该基因的反义效果。在研究中人们认识到类黄酮类物质在树木生根中有很重要的作用,法 国INRA的Lise Jouanin实验室进行了用查尔酮合成酶(CHS)基因转化杨树的工作,获 得了成功[1~2]。 除杨树获得了多种转外源基因的工程植株外,还有核桃、苹果获得了转Bt基因的工 程植株,Southern Blot证明了外源基因整合到受体植物基因组中,其抗虫效果还未见报 道。 2 基因克隆和基因表达调控及其生理反应的研究 木本植物分子生物学基础研究方面的进展明显落后于草本植物。在木本植物中,迄今 已被克隆并阐明了碱基序列的基因总数不超过20个,主要有:与光合有关的基因、与外界 环境胁迫有关的基因、与材质改良有关的基因、外源凝集素基因以及与植物防卫反应有关 的基因。 2.1 与光合作用有关的基因 在木本植物基因表达调控研究中,发现松属等部分裸子植物的一些光合作用相关基 因不受光调控。捕光叶绿素a/b基因(cab)和二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶小亚基基因 (rbcS)是核DNA中与光合有关的两个基因。在被子植物中,这两种基因的表达受光调 控,光照可激活该基因的表达,一旦转入黑暗中,表达立即停止。而在裸子植物的松树中则 不受光调控,黑松、欧洲赤松和花旗松的cab基因和rbcS基因在黑暗中也能同样有高水 平的表达。 有关木本植物叶绿体DNA表达调控的研究进展也比较快。至今已从针叶树中克隆 出了4个叶绿体DNA基因,即:花旗松和黑松的rbcL(二磷酸核酮糖羧化酶加氧酶大亚 基基因)、山地松的psbA(光系统Ⅱ叶绿素蛋白基因)、chlN(叶绿素合成基因)和chlB(叶 绿素合成基因)。已经知道,被子植物rbcL和psbA基因受光调控,但对黑松叶绿体DNA 的研究发现,其rbcL和psbA基因与核DNA的cab基因一样,不受光调控。chlN和chlB 基因最早在原核生物绿藻和苔藓植物地钱叶绿体DNA中发现的。它们与黑暗状态下的 叶绿素合成有关。1991年,Lidholm等首次从山地松叶绿体DNA中发现并克隆了这两个 基因,其他研究者在云杉和银杏等裸子植物叶绿体DNA中也发现了类似的碱基序列。但 在被子植物叶绿体DNA中,迄今尚未发现类似序列。chlN基因和chlB基因在针叶树中 的发现为阐明裸子植物光合作用基因调控机制提供了一个重要线索。 针叶树叶绿体DNA的遗传方式及结构也有很多特殊点。已研究过的草本植物叶绿 体DNA都是母系遗传。但DNA限制性片断多态性分析和种间杂交结果表明,针叶树叶 绿体DNA是父系遗传的,这一点已在花旗松、松及云杉等树种中得以证明[8]。被子植物 叶绿体DNA长度为135~160kb,通常含有一组反向排列的携带有核糖体RNA基因的 重复序列。在花旗松和火炬松的叶绿体DNA中不存在这一反向重复序列,因此其长度较 短,仅为120kb。 2.2 与外界环境胁迫有关的基因 外界环境胁迫引起植物代谢过程中一系列生理效应,以适应可能给植物带来的不利 影响,包括某些特异基因的激活。但对其作用机制还知之甚少,这一研究领域引起了中外 科学家的浓厚兴趣。还有部分科学家正在从外界环境胁迫特异的cDNA基因文库中克隆 和分离对主要环境胁迫发生反应的基因。美国德克萨斯大学Shujun Chang等人正从火炬 松中获得干旱胁迫诱导表达的部分基因,包括咖啡碱辅酶A合成酶、SAM-合成酶、几丁 质酶、与动物表皮基质类似的蛋白质等的基因,德国Pflanzenpathologie生化研究所Di- eter Ernst正从欧洲赤松中获得紫外线诱导表达基因,包括CAD酶,1,2-二苯乙烯合成 酶,羟甲基戊二酰辅酶A合成酶等基因。在其它一些植物中,也发现部分被环境胁迫诱导 的基因。如几丁质酶基因能被机械损伤、真菌感染和干旱胁迫诱导表达。为了获得更多的 针叶树可利用基因,美国林业遗传研究所的Claire Kinlaw正在利用David Neale建立的 遗传图谱标记从火炬松种子的cDNA克隆中筛选单一识别序列。这些序列为研究针叶树 的基因组结构和进化规律提供了有益的分子生物学工具。在此之前主要进行了一些已知 功能基因的分离,如编码光合蛋白、转移因子、糖酵解、胁迫诱导等的基因。最近的研究又 转向一些组织特异性cDNA克隆的筛选[1,9]。 根据已有的实验研究,美国俄勒冈州立大学的Gary Coleman提出了一个假设,解释 树木如何在秋季储存氮源,在春季光合需氮时释放氮源。他认为,树皮和树叶分别积累 32KD的树皮储存蛋白(BSP)和Win4基因编码的叶部蛋白。在日照时间短或氮素水平高 时,BSP在树皮薄壁组织中积累,Win4基因被抑制,在日照时间长和顶芽旺盛生长季节, BSP含量降低,Win4基因编码蛋白大量积累[1]。 2.3 与材质改良有关的基因 尽管针叶树缺乏有效的遗传转化和再生方法,关于其木质素方面的研究仍在继续。美 国北卡罗来纳州立大学的Ron Sederoff等人开展了从火炬松基因组中分离和克隆编码 木质素合成有关酶基因的研究,包括苯丙氨酸氨解酶(PAL)、肉桂酸乙醇脱氢酶(CAD)、 4-香豆素-辅酶A连接酶(4CL)。 美国的Mackay研究小组正致力于不同树种木质部发生的研究。他们讨论了树木材 质形成基因与动物癌症基因的相互关系。他解释,如果树木材质大量形成就是木质部分化 的最终阶段,那么该阶段的基因控制模式应与动物细胞的终端分化因子具有同源性,如 myb癌基因。确实,他从湿地松木质部特异的cDNA文库中克隆了11个类似myb的同源 异形基因,并发现部分基因在木质部中优先表达,表明它参与了材质发育。有两类myb基 因拷贝数很少,它们与大麦的myb33基因具有很高的同源性。另外,加拿大林业服务中心 的研究人员还报道了黑云杉的myb基因。他们从黑云杉雌球果cDNA文库中分离到类似 玉米C1基因。当用带有玉米Bz2启动子的C1基因转化落叶松和云杉的胚性愈伤组织时 实现了表达。进一步实验用C1基因代替黑云杉的myb同源盒,发现两者功能相同[2,9]。 2.4 其它基因 人们早就发现,昆虫危害或其它机械损伤能诱导马铃薯、番茄等植物体内某些损伤诱 导基因的表达,合成出能干扰昆虫消化功能的胰蛋白酶抑制剂。在木本植物杨树中也发现 了类似的基因调控现象[20]。从杨树中克隆出了损伤激活基因的cDNA,通过对其进行测 序得知其表达产物之一类似于大豆胰蛋白酶抑制剂,另一种表达产物类似于几丁质酶。在 杨树木质部的贮存蛋白中,通过对其cDNA序列的分析,也发现了与几丁质酶同源的氨 基酸序列。 能凝集动物红血球的蛋白质—外源凝集素(lectin)常见于草本植物种子中。在木本植 物的接骨木、刺槐和国槐树皮韧皮部中也发现了外源凝集素的积累[14],其积累量呈现季 节性变化;秋冬季大量形成,春季消失。外源凝集素基因的这种表达调控方式被认为可能 同自然界的光周期有关。吉田等(1992)从刺槐中克隆出了外源凝集素的cDNA,并测定了 其碱基序列。