运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒的构建
质粒构建 (2)
质粒构建1. 引言质粒是一种重要的实验工具，广泛应用于基因工程、遗传学和生物学研究中。
质粒构建是指将感兴趣的DNA片段插入到质粒中的过程，用于进一步研究DNA序列的功能和相互作用。
本文将介绍质粒构建的基本原理和步骤。
2. 质粒构建的基本原理质粒构建需要以下几个基本要素：•质粒：质粒是一种环状的DNA分子，可存在于细菌、酵母等生物体内。
•DNA片段：DNA片段是质粒构建中要插入质粒的感兴趣DNA序列，可以通过PCR扩增、基因合成等方法得到。
•限制酶：限制酶是一种特殊的酶，能够识别和切割DNA的特定序列。
•连接酶：连接酶是一种酶，能够将DNA片段与质粒连接起来。
基于以上要素，质粒构建的基本原理如下：1.将质粒和目标DNA片段分别进行限制性内切酶切割。
限制酶切割会产生粘性末端或平滑末端的DNA片段。
2.使用连接酶将目标DNA片段与质粒连接起来。
连接酶能够将两条DNA片段的末端连接起来，形成一个完整的质粒。
3.利用转化或转染等方法将质粒导入到宿主细胞中。
质粒在宿主细胞中进行复制和表达。
3. 质粒构建的步骤质粒构建的具体步骤如下：3.1 质粒提取从质粒宿主细胞中提取质粒是质粒构建的第一步。
常用的质粒提取方法包括碱裂解法、盐溶解法、商业提取试剂盒等。
质粒提取的目的是获取纯度较高的质粒样本，便于后续实验操作。
3.2 目标DNA片段的获取目标DNA片段可以通过PCR扩增、基因合成等方法得到。
PCR扩增需要设计引物，引物的序列与目标DNA片段的两端相互衔接。
基因合成则需要将目标DNA序列依照设定的序列进行化学合成。
3.3 DNA片段与质粒的连接将目标DNA片段与质粒进行连接，需要使用连接酶。
连接酶则需要根据DNA片段和质粒的不同情况选择合适的连接酶和反应条件。
连接酶反应通常包括连接酶、DNA片段和质粒的混合体系，以及一定的温度和时间。
3.4 转化或转染将连接好的质粒导入到宿主细胞中，以使质粒在宿主细胞中进行复制和表达。
2022年济宁医学院生物技术专业《微生物学》期末试卷B(有答案)
2022年济宁医学院生物技术专业《微生物学》期末试卷B(有答案）一、填空题1、在______菌中，存在一种与芽孢相类似的休眠构造，称为______，它的特点是抗______能力强。
2、朊病毒与真病毒有巨大差别，例如______、______、______、和______等。
3、一个葡萄糖分子经EMP途径后，可获得2分子______、2分子______ 和2分子中间代谢物______（其分子式是______）。
4、蓝细菌的培养可用______培养基。
5、酵母菌的无性繁殖方式主要有______和______。
6、微生物在现代生物分类系统中分别属于______界、______界、______界和______界。
7、评价化学杀菌剂或治疗剂的药效和毒性的关系时，最重要的三个指标是______、______和______。
8、肠道中的正常菌群主要是厌氧菌，如______、______和______等都是其中的优势菌群。
9、λ噬菌体感染宿主后最先转录，并合成一些调节蛋白，通过调节蛋白的作用，其他基因的转录或被激活或被阻遏，从而使它进入______或______途径。
10、体液免疫分子主要包括______、______和______；而______和______分别是非特异免疫和特异免疫的主要体液成分。
二、判断题11、在G－细菌细胞壁的肽聚糖层上，含有一种跨膜蛋白，称为孔蛋白。
（）12、在基团转位运输方式中，除了在运输过程中物质发生化学变化这一特点外，其他特征均与主动运输方式相同。
（）13、利用运动发酵单胞菌进行细菌酒精发酵要比酵母菌酒精发酵时供应更多的氧。
（）14、病毒感染允许细胞都将导致增殖性感染发生。
（）15、捕虫菌目的真菌会分化出菌环或菌网等营养菌丝以捕食线虫等小动物。
（）16、“三域学说”是根据对大量微生物DNA的测定后而提出的。
（）17、真菌菌丝体的生长一般不需要光线。
（）18、在氨化过程中，气体氮转化为硝酸盐，后者供给细菌。
质粒导入大肠杆菌的方法
质粒导入大肠杆菌的方法
1.制备大肠杆菌感受态细胞，将其培养至对数生长期。
2. 用无菌PBS或无菌水将质粒转化至电击装置中，设置适当的电击参数。
3. 将大肠杆菌感受态细胞转移到电击器中，并进行电击处理。
电击后将细胞立即转移到预先加热的SOC培养基中。
4. 在SOC培养基中将细胞恢复2小时后，取适量菌液涂布在含有适量抗生素的LB平板上进行筛选。
5. 鉴定阳性克隆，并进行质粒提取和酶切鉴定。
这种方法简单易行，可高效地导入质粒至大肠杆菌中，是常用的基因工程和分子生物学实验方法。
- 1 -。
酵母菌的最适温度
酵母菌的最适温度：酵母是基因克隆实验中常用的真核生物受体细胞，培养酵母菌和培养大肠杆菌一样方便。
酵母克隆载体的种类也很多。
酵母菌也有质粒存在，这种2μm 长的质粒称为2μm 质粒，约6 300bp。
这种质粒至少有一段时间存在于细胞核内染色体以外，利用2μm 质粒和大肠杆菌中的质粒可以构建成能穿梭于细菌与酵母菌细胞之间的穿梭质粒。
酵母克隆载体都是在这个基础上构建的。
酵母是一种单细胞真菌，并非系统演化分类的单元。
一种肉眼看不见的微小单细胞微生物，能将糖发酵成酒精和二氧化碳，分布于整个自然界，是一种典型的异养兼性厌氧微生物，在有氧和无氧条件下都能够存活，是一种天然发酵剂。
一般泛指能发酵糖类的各种单细胞真菌，可用于酿造生产，也可为致病菌--遗传工程和细胞周期研究的模式生物。
酵母菌是人类文明史中被应用得最早的微生物。
已知有1000多种酵母，根据酵母菌产生孢子(子囊孢子和担孢子)的能力，可将酵母分成三类:形成孢子的株系属于子囊菌和担子菌。
不形成孢子但主要通过出芽生殖来繁殖的称为不完全真菌，或者叫"假酵母"(类酵母)。
已知极少部分酵母被分类到子囊菌门。
酵母菌在自然界分布广泛，主要生长在偏酸性的潮湿的含糖环境。
2018年2月，酵母长染色体的精准定制合成荣获科技部2017年度中国科学十大进展。
酵母源饲料添加剂能提供丰富的营养物质，调节动物消化道微生物菌群的平衡、提高机体的免疫力、防治消化道疾病以及促进动物生长等多种作用，是一种绿色的饲料添加剂，具有安全无毒、无副作用、不产生抗药性等特点酵母是一种结构相对简单的单细胞微生物，属于真菌类，是兼性厌氧微生物，在有氧和无氧状态下都能生存和繁殖，有氧条件下生长速度更快。
酵母菌具有原核生物的生长繁殖特点，增殖速度快，在温度适合、氧气和营养充足的条件下，一般是出芽方式为主的无性繁殖；在条件苛刻时形成子囊孢子，子囊孢子在适宜条件下可萌发成单倍体营养细胞，甚至可进入有性繁殖阶段。
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2
构建质粒的步骤
构建质粒的步骤构建质粒是一种重要的实验技术，用于在细菌或其他生物体中携带和复制外源DNA。
下面将介绍构建质粒的步骤。
1. 选择质粒载体：首先需要选择适合的质粒载体。
质粒载体是一种环状DNA分子，可以自主复制并在宿主细胞中表达外源基因。
常用的质粒载体有pUC18、pBR322等。
选择适合的质粒载体需要考虑载体大小、复制起点、抗生素抗性基因等因素。
2. 获得外源DNA片段：外源DNA片段可以是来自其他生物体的DNA序列，也可以是人工合成的。
获得外源DNA片段的方法有PCR扩增、限制性内切酶切割等。
3. 切割质粒和外源DNA：使用限制性内切酶将质粒和外源DNA切割成互补的黏性末端。
确保切割后的DNA末端与质粒载体互补，以便进行连接。
4. 连接质粒和外源DNA：通过DNA连接酶将切割后的质粒和外源DNA连接起来，形成重组质粒。
连接时需要考虑连接缓冲液的条件和酶的适宜温度。
5. 转化宿主细胞：将重组质粒导入宿主细胞中，使其能够复制和表达外源基因。
常用的转化方法有热激转化、电击转化等。
转化后，需要在含有抗生素的培养基上筛选出含有质粒的转化子。
6. 确认质粒的构建：通过PCR扩增、限制性内切酶切割或测序等方法，确认质粒是否成功构建，并验证外源基因是否正确插入。
7. 大规模培养质粒：如果质粒构建成功，可以进行大规模培养，以获得足够的质粒量。
培养条件需要根据质粒载体的特性进行调整。
8. 提取质粒：使用质粒提取试剂盒等方法，从大规模培养的细菌中提取质粒。
提取的质粒可以用于进一步的实验研究或应用。
通过以上步骤，就可以成功构建质粒。
构建质粒是分子生物学研究中常用的技术手段，可以用于基因克隆、基因表达、基因敲除等研究中。
同时，构建质粒也是基因工程和生物工程的重要基础。
大肠杆菌基因工程菌株的构建及发酵试验
图 2 OD600 值随时间的变化趋势
图 3 pH 值随时间的变化趋势
4/8
2012 生工大实验
图 3 pO2 值随时间的变化趋势
3.4 GFP 离子交换层析分离
在洗脱过程中先用 Buffer A 洗，没有荧光洗脱。Buffer B 梯度洗脱至 17 管的开始出峰但未见荧光。至 20 管时可见荧光，第 21 管时荧光最强。
水+感受态大肠杆菌 LB 平板培养基 LB+Amp 平板培养基 LB+Amp+ara 平板培养基 5000 个 99 个 776 个
pGLO+感受态大肠杆菌 5000 个 5000 个 1616 个
注；其中 LB 平板培养基菌落过于密集无法计数按 5000 计，pGLO+感受态大肠杆菌接种于 LB+Amp 平板培养基涂布不均菌落
280/260 7 0.15 0.15 0.15 0.68 0.68 0.68 0.86 0.93 0.99 0.25 0.25 0.40 2 0.038 0.038 0.03 0.48 0.48 0.40 1.22 1.45 1.55 0.03 0.03 0.03
表 5 对照标准比值
0.15M 甲酸 0.189 0.226 0.081 0.032 0.836 0.358 0.142 840
0.01M 甲酸+0.05M 甲酸钠 0.134 0.164 0.059 0.016 0.817 0.360 0.098 900
0.1M 甲酸+0.1M 甲酸钠 0.172 0.174 0.098 0.034 0.989 0.563 0.195 720
pH 6.22 6.21 6.32 6.38 6.20 5.80 5.55
乳酸菌基因敲除技术的研究进展
乳酸菌基因敲除技术的研究进展杜胜阳;王斌斌;冯佳;侯斌晓;乔建军【摘要】乳酸菌是革兰氏阳性菌,广泛用于食品、医药、轻工业及饲料工业等行业.对乳酸菌进行遗传操作是调节、优化其代谢途径的基础.通过基因敲除技术改造乳酸菌基因组,可以判断基因组中未知基因所编码产物的功能,有目的、有选择地使乳酸菌生产有益的异源基因产物.基因敲除技术已成为当前乳酸菌分子生物学研究的热点.文中对几种乳酸菌基因敲除策略研究进展及影响敲除效率的因素进行了综述,分析存在的问题并初步探讨展望了乳酸菌敲除技术的未来发展趋势.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2016(042)001【总页数】8页(P244-251)【关键词】基因敲除;乳酸菌;同源重组;单链重组;敲除效率【作者】杜胜阳;王斌斌;冯佳;侯斌晓;乔建军【作者单位】天津大学化工学院制药工程系,系统生物工程教育部重点实验室,天津,300072;天津大学化工学院制药工程系,系统生物工程教育部重点实验室,天津,300072;天津大学化工学院制药工程系,系统生物工程教育部重点实验室,天津,300072;天津大学化工学院制药工程系,系统生物工程教育部重点实验室,天津,300072;天津大学化工学院制药工程系,系统生物工程教育部重点实验室,天津,300072【正文语种】中文乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是一类能发酵碳水化合物且主要产物为乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌的通称。
目前至少分为18个属，包括乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、链球菌属(Streptococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)等。
乳酸菌代谢相对简单，具有很好的生物安全性，是公认的安全级微生物(generally recognized as safe, GRAS)，被广泛用于食品、医药、轻工业及饲料工业等行业[1]。
生化复习资料：酵母单杂交技术
酵母单杂交技术（Yeast One-hybrid method）一、原理酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报道基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。
该方法也是在细胞内（in vivo）分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。
将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin)上游，Pmin启动子下游连接报道基因。
进行c DNA 融合表达文库筛选时，编码目的转录因子的c DNA 融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报道基因表达。
根据报道基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。
二、实验步骤①构建报道子载体：将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到一个最小启动子（minimal promoter，Pmin）上游，其下游连有报道基因；②将构建好的报道子载体转化酵母细胞筛选合适的3-AT浓度；③提取总RNA，合成c DNA双链；④将报道子、c DNA和融合表达载体共转化到酵母中，在相应的缺陷性SD培养基上进行筛选阳性克隆；⑤对阳性克隆进行鉴定，去除假阳性克隆；⑥对所获得的阳性克隆进行测序，为进一步分析打下基础。
如可进一步分析DNA确切的结合位点。
三、图片分析1、选择YM4271[ pHISi3NF4] 克隆株重复进行3-AT 梯度试验，在没有3-AT的SD/-His平板上生长状态很好，在15mM 3-AT存在下被明显抑制，而在30mM 3-AT存在下完全不能生长。
故选择15mM为筛库实验的3-AT工作浓度。
2、经9天培养，在SD/-Leu/-His/ +15mM[3-AT]选择培养基上共长出351个大小不同的阳性候选克隆。
取100个菌落划线于30mM 3-AT和60mM[3-AT]平板，仅有1个克隆被淘汰。
证实15mM[3-AT]的选择是正确的。
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用
大肠杆菌表达载体,构建方法及其应用大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，也是常用的表达宿主。
利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而产生大量目标蛋白。
本文将介绍大肠杆菌表达载体的构建方法及其应用。
一、大肠杆菌表达载体的构建方法1. 选择适合的表达载体：常见的大肠杆菌表达载体包括pET系列、pBAD系列和pGEX系列等。
选择适合的表达载体主要考虑载体的复制起源、选择标记、表达调控元件和蛋白纯化标记等因素。
2. 克隆目标基因：将目标基因通过PCR扩增得到目标基因片段，然后利用限制性内切酶切割载体和目标基因片段，将目标基因片段插入载体中。
3. 进行质粒转化：将构建好的重组质粒导入大肠杆菌中。
可以通过化学法、电穿孔法或热冲击法等方法将质粒导入大肠杆菌中。
4. 筛选与鉴定：经过转化后，利用选择性培养基筛选出含有目标基因的重组大肠杆菌。
通过PCR、限制性酶切和测序等方法对重组菌株进行鉴定，确认目标基因已经成功插入载体。
二、大肠杆菌表达载体的应用1. 蛋白表达：利用大肠杆菌表达载体，可以将目标基因导入大肠杆菌中进行表达，从而大量产生目标蛋白。
这对于研究蛋白的结构、功能及其在生物学过程中的作用具有重要意义。
2. 蛋白纯化：大肠杆菌表达载体常含有蛋白纯化标记，如His标签、GST标签等。
通过这些标记，可以方便地对目标蛋白进行纯化和检测，为后续研究提供了便利。
3. 蛋白互作研究：大肠杆菌表达载体可以用于蛋白互作研究。
通过将目标蛋白与其他蛋白共同表达，可以研究它们之间的相互作用关系，揭示生物学过程中的分子机制。
4. 疫苗研究：大肠杆菌表达载体可以用于疫苗研究。
将目标抗原基因导入大肠杆菌中进行表达，可以获得大量的抗原蛋白，从而用于疫苗的开发和研究。
5. 酶工程：大肠杆菌表达载体可以用于酶工程研究。
通过将目标酶基因导入大肠杆菌中表达，可以进行酶的产量优化、酶的工艺改造等研究，提高酶的生产效率和稳定性。
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运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒的构建
运动发酵单胞菌和大肠杆菌间穿梭质粒的构建
运动发酵单胞菌(Zymomonas.mobilis)是目前发现的乙醇发酵能力最强的.微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种;但由于其可利用的碳源范围窄,所以对其进行基因工程改造首先需要有较好的载体系统.以Z.mobilis内源质粒pZM2和大肠杆菌(E.coli)质粒pBR328、pACYC184为出发质粒,构建了三个Z.mobilis-E.coli之间的克隆型穿梭质粒,即pZB1、pZB21和pZB31.对它们在Z.mobilis CP4中的稳定性、拷贝数的初步比较分析表明:pZB21最稳定、拷贝数最高,pZB31次之,pZB1最差.进一步以pZB21为载体,在Z.mo-bilis CP4中表达E.coli的talB基因,酶活水平为0.087 U/mg蛋白.证明pZB21是能用于基因表达的、较为理想的Z.moblis-E.coli之间的穿梭载体.
作者：邹少兰高卫华刘成张敏华 Zhang Minhua Zou Shaolan Gao Weihua Liu Cheng Ge Jianping Zhang Minhua 作者单位：天津大学,石化中心,天津,300072 刊名：南开大学学报（自然科学版）ISTIC PKU 英文刊名：ACTA SCIENTIARUM NATURALIUM UNIVERSITATIS NANKAIENSIS 年，卷(期)： 2006 39(3) 分类号：Q782 关键词：运动发酵单胞菌穿梭质粒稳定性拷贝数 talB基因。