本科实验讲义word版

医学免疫学实验讲义（供临床医学、口腔、护理、药学、预防医学等使用）青岛大学医学院免疫学教研室

二00六年六月

目录

实验一直接凝集反应——血型 (1)

实验二类风湿因子胶乳凝集试验 (3)

实验三抗链球菌溶血素“O”胶乳试验 (4)

实验四试管凝集反应 (5)

实验五单向琼脂扩散试验 (8)

实验六双向琼脂扩散试验 (10)

实验七对流免疫电泳 (13)

实验八火箭电泳 (16)

实验九免疫电泳 (19)

实验十补体在溶血反应中的作用 (21)

实验十一密度梯度离心法分离单个核细胞 (23)

实验十二 E玫瑰花环形成实验 (24)

实验十三人外周血Ｔ淋巴细胞亚群的检测 (27)

实验十四淋巴细胞转化试验 (29)

实验十五动物过敏性休克 (32)

实验十六肥大细胞脱颗粒试验 (33)

实验十七中性粒细胞的吞噬作用 (36)

实验十八巨噬细胞的吞噬作用 (37)

实验十九间接免疫荧光法检测抗核抗体 (39)

实验二十酶联免疫吸附试验 (42)

实验二十一免疫层析实验 (45)

实验二十二血清三碘甲状腺原氨酸（T3）放射免疫测定 (47)

实验二十三免疫印迹实验 (50)

实验室规则

一、每次实验前必须将有关的课堂讲授理论及实验讲义进行预习，以了解本次实验内容及目的、方法，以免发生错误，并可提高实验效果。

二、进入实验室必须穿隔离衣。不准穿拖鞋。

三、在实验室内绝对禁止吸烟及饮食。

四、一切标本及材料应严格按照指定的方式进行使用及观察，不得随意乱动，更不得携出室外。

五、凡用过的吸管、玻片应放在指定的消毒缸内，其他物品也应放在指定地点，不得乱放。

六、应爱护显微镜，用完后应清洁镜头，显微镜对号入座。

七、实验完毕后，整理桌面、地面、用具等，需培养的物品要放入孵育箱，关好水、电、门窗。

八、爱护公物，损坏公物，应向教师报告，进行登记，酌情处理。

九、应用易燃品要严防火灾，严禁酒精灯互相直接碰头点燃，以免酒精外溢，引起燃烧。

十、必须认真观察实验结果，按时交实验报告。

实验一凝集反应（Agglutination）——血型

颗粒性抗原与相应的抗体在一定条件下出现凝集物的现象称为凝集反应，或称直接凝集反应（direct agglutination）。若将可溶性抗原吸附或偶联至无关载体颗粒，使之成为致敏的载体颗粒，再与相应抗体结合而出现的凝集现象称为间接凝集反应（indirect agglutination），如果载体颗粒是红细胞，则称间接血凝。如将抗体吸附在载体颗粒上，然后与相应的可溶性抗原结合而出现的凝集现象称为反向间接凝集反应。

一、原理

红细胞表面具有不同的抗原，而在人类血清中天然存在有对红细胞的不同凝集素（抗体）。当红细胞与相应凝集素混合时，在有电解质参加下，可以产生凝集现象。根据人类红细胞膜上抗原的不同，可分为Ａ、Ｂ、Ｏ和ＡＢ四种血型。Ａ型血的红细胞膜上有Ａ抗原，血清中则含有抗Ｂ抗体；Ｂ型血红细胞膜上有Ｂ抗原，血清中含有抗Ａ抗体；Ｏ型血红细胞膜上不含Ａ和Ｂ抗原，血清中含有抗Ａ和抗Ｂ抗体；ＡＢ型血红细胞膜上同时有Ａ和Ｂ两种血型抗原，血清中无抗Ａ和抗Ｂ抗体。当不同血型的人进行输血时，红细胞表面抗原与相应的凝集素结合，在补体的作用下可发生溶血现象，故临床上给病人输血时，必须进行血型鉴定。同时尚需进行交互配血试验，以复查定型时有无错误，或其它不规则凝集素的存在。

二、材料

(一)标准抗A及抗B血清。

(二)生理盐水，小试管，毛细吸管，载玻片，牙签或小玻棒，刺血针，酒精棉球等。

三、方法

(一)用酒精棉球消毒被检者的耳垂或指尖，用刺血针扎破皮肤，然后用毛细吸管采血，并将其注入含生理盐水的小试管内，混匀使之成为血球悬液(浓度为1％)。

(二)取洁净玻片一张，用蜡笔在中间划分为二，并于其上角分别标记“抗A”“抗B”，分别将标准抗A和抗B血清加一滴于其上。

(三)用毛细吸管取待检红细胞悬液各加一滴于抗A及抗B血清中，然后用牙签或小玻棒将其搅拌均匀。

(四)将玻片平持手中，前后左右转动，使之充分混匀，置室温中10 ~ 15分钟。观察有无凝集发生，如观察不清，可放在低倍显微镜下观查。

四、结果

如有凝集，可见红细胞凝集成小块，背景液体较澄清；无凝集者，红细胞呈均匀分散，背景液体混浊。检查结果可参阅下表：

不同血型检查结果

抗Ａ血清抗Ｂ血清血型

＋— A

—＋ B

—— O

＋＋ AB

五、注意事项

(一)室温保持在20℃左右。若低于10℃以下，易出现冷凝集现象而造成假阳性的误判结果。

(二)用牙签或小玻棒将待检红细胞悬液分别于抗A及抗B血清混匀时，不能用同一端同时在两种血清中搅拌，而应分别用两端搅拌。

六、报告要求

结合实验结果，分析血型鉴定在实际应用中有何意义？血型不合输血引起的溶血是如何发生的？

实验二类风湿因子胶乳凝集试验

（RF latex agglutination）

一、原理

利用人IgG致敏的颗粒性胶乳抗原与相应抗体的免疫凝集反应，测定患者血清中的类风湿因子（RF）

二、材料

1．变性IgG致敏胶乳悬液

2．阴、阳性对照血清。

3．血清稀释液：生理盐水。

4．黑色方格玻璃板、吸管、试管、吸量管等。

三、操作

1．将待检标本用生理盐水1:20稀释备用。

2．在黑色方格玻璃板上取三个格，每格分别加稀释待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清1滴，然后每格均加一滴胶乳试剂。

3．充分混匀，2分钟内观察结果。

四、结果判断

肉眼观察凝集强弱，出现清晰凝集者为阳性，无明显凝集者为阴性。若需作定量测定，可将血清作倍比稀释，重复上述测定，以血清最高稀释度所出现的凝集，即为RF滴度。

五、注意事项

1．使用前将试剂充分摇匀。

2．血清和试剂的液滴大小要一致。

3．血清和试剂要充分混合。

4．反应以室温为宜。

六、报告要求

RF实验的原理及实验结果记录。

实验三抗链球菌溶血素“O”胶乳试验

一、原理

正常机体的血清中含有一定量的抗链球菌溶血素“O”抗体（ASO），实验开始时首先加入一定量的溶血素“O”溶液，可全部结合正常血清中的ASO，患者血清中ASO超过正常范围，所以可以与随后加入的溶血素“O”致敏的胶乳颗粒（ASO胶乳试剂）反应，出现凝集。

二、材料

⒈溶血素“O”溶液。

⒉ ASO胶乳试剂（溶血素“O”致敏的胶乳颗粒）。

⒊阳性控制血清。

⒋阴性控制血清。

⒌生理盐水。

6．黑色方格玻璃板、试管、吸管、毛细滴管、小木签等。

三、方法

1．血清标本用生理盐水1:50稀释，不必灭活。

2．在反应板各格子上分别滴加稀释血清以及阳性和阴性对照血清一滴，各再滴加溶血素“O”溶液一滴，轻轻摇动2分钟，使其充分

混匀，均匀分布于方格内。

3．滴加ASO胶乳试剂一滴，轻轻摇动8分钟，室温为20℃，将反应板平放在实验桌上，有清晰凝集者为阳性，不出现清晰凝集者为阴性。

4．阳性者的1:50稀释血清，进一步稀释为1:80，再重复步骤2和3，有清晰凝集者为强阳性。

四、结果判断

在规定的时间内观察，有清晰凝集者为阳性，不出现清晰凝集者为阴性。

五、注意事项

1．加入ASO胶乳并轻轻摇动8分钟后，应尽快记录结果，此后时间再出现的清晰凝集不列为阳性。

2．室温若分别降低或升高10C，反应时间则分别延长和缩短2分钟。

六、报告要求

ASO胶乳实验的原理及实验结果记录。

实验四试管凝集反应（Tube Agglutination）

一、原理

试管凝集反应为半定量试验方法，用已知抗原作为诊断菌液与一系列稀释的受检血清混合保温后，观察每管内抗原凝集程度，以判定待检血清中有无相应的抗体及其效价。通常以产生明显凝集现象的最高血清稀释度为血清中抗体的效价，亦称滴度(titer)。

二、材料

(一)待检血清用生理盐水1∶10稀释（0.1毫升血清原液 + 0.9毫升生理盐水）

(二)伤寒杆菌“H”诊断菌液

(三)伤寒杆菌“O”诊断菌液

(四) 生理盐水、试管、吸管等

三、方法

(一)稀释血清

1．洁净小试管16只，分两排排列于试管架上，每排8只，依次用蜡笔注明号码，每管用吸管加入生理盐水0.5毫升。

2．吸取1∶10待检血清0.5毫升，加入第1排中的第1管，于管内连续吹打三次，使血清与盐水充分混合(吹打时注意勿使液体溢出管外)，吸出0.5毫升注入第2管。同样予以混合后吸出0.5毫升注入第3管，以此类推作倍比稀释到第7管，自第7管中吸取0.5毫升弃去，第8管做对照。

3．同法，吸取1∶10待检血清0.5毫升加入第二排中的第1管，并依次如上法予以稀释。

血清菌液含量表

血清 1 2 3 4 5 6 7 8 菌液（ml） 1∶10 1∶20 1∶40 1∶80 1∶160 1∶320 1∶640 盐水伤寒杆菌“O”

伤寒杆菌“H”

最后稀释度 1∶20 1∶40 1∶80 1∶160 1∶320 1∶640 1∶1280对照

(二)加菌液

1．吸取伤寒杆菌“H”菌液，加入第一排各管中，每管0.5毫升(由盐水对照开始，依次由后向前加入)。此时血清稀释倍数又增加1倍。

2．同法于第二排中加入伤寒杆菌“O”菌液0.5毫升。

3．将各管振荡混匀，放37℃水浴箱中2～4小时或放入37℃孵育箱中过夜，次日取出观察结果。以出现“++”凝集的最高血清稀释度(血清的最后稀释度)为该抗体效价。

四、结果

如血清中含有与该菌相应的抗体，则可与该菌起凝集反应，凡能凝集者则细菌之凝集块下沉于管底，上面液体完全澄清或略为澄清，依照凝块之大小与液体澄清的程度而决定反应的强弱，并以“+”表示之。

“++++”细菌完全凝集，凝集块大，管底可见大而边缘不整的白色凝集块，液体澄清

“+++”细菌大部分凝集，凝集块较大，液体稍微混浊

“++”细菌部分凝集，液体混浊

“+”细菌极少数凝集，液体混浊

“-”不凝集，液体浑浊度与对照管相同

五、注意事项

(一)先观察盐水对照管，管底沉淀物呈园形，边缘整齐，轻轻振摇，细菌分散仍呈混浊现象。

(二)实验管应自第1管看起，如有凝集，可见管底有沉淀凝集块，边缘不整齐，液体上部澄清。“H”菌液的凝集呈棉絮状，轻摇即升起，容易摇碎。“O”菌液的凝集呈紧密颗粒状，不易摇碎，往往粘于管底，因每管抗原抗体比例不同，凝集程度有差别。

六、报告要求

记录并分析实验结果。了解待测血清对伤寒杆菌“H”或伤寒杆菌“O”的凝集效价的临床意义。

实验五单向琼脂扩散试验

(Single Agar Diffusion Test)

一、原理

本试验为一定量试验，将一定量抗体均匀混入琼脂中倾注于玻片上，待凝固后打孔，将抗原加入孔内，抗原由圆孔中央向四周扩散，若遇相应抗体便发生特异性结合，在二者比例合适处围绕孔的周围形成乳白色的沉淀环，环的大小与抗原含量成正比，因此事先用不同浓度的已知抗原做实验绘制标准曲线，利用标准曲线便可求出未知抗原的含量(本实验以IgG定量测定为例)。

二、材料

（一）器材：

1.载玻片。

2.打孔器（外径3mm）。

3.不锈钢挑针。

4.微量注射器（10ul）。

5.有盖搪瓷盒（内铺有湿润的海绵垫）。

6.测定尺。

7.温箱、三角烧瓶等其它常用仪器。

（二）试剂：

1.pH 8.6，0.1M巴比妥缓冲液。

2.1％琼脂凝胶：称取10g优质琼脂粉置1000ml三角烧瓶中加人蒸

馏水500ml，水浴煮沸使琼脂熔解，然后再加入500ml上述热pH 8.6

巴比妥缓冲液，同时加万分之一硫柳汞，混匀后分装于150ml?三

角烧瓶中，4℃冰箱保存备用。

3.1％鞣酸。

4.参考血清：IgG。

参考血清均事先用国家标准抗原进行过标化，标明其中各种免疫球蛋白的含量。

5.诊断血清（抗体）：羊抗人IgG血清。

6. 待检血清（抗原）：人血清。

三、方法

(一)称取优质琼脂3克，加生理盐水200毫升，在水浴中加热融化。

(二)吸4ml琼脂待其冷却至50～60℃，加入Ab(按工作浓度)，混匀后

立即倒入玻璃板上，厚度为1.2毫米，待凝固。

(三)用打孔器(或用直径与其一致的钢管或玻璃管)打孔，孔距1.2 ～

1.5厘米，两排距离2厘米。如下图：

(四)加入不同稀释度(1:10、1:20、1:40、1:80)的抗原约10微升，抗

原液面与琼脂板相平为宜。

(五)置湿盒内，37℃。24小时后取出泡入生理盐水内2—3小时换水数

次，再泡在1％鞣酸内10分钟。

四、结果

以毫米为单位测量沉淀环和直径，以已知的抗原浓度为横坐标，沉淀环的直径为纵坐标，绘制标准曲线，然后从标准曲线上即可查到待测样品中IgG的含量。

注：1.IgG含量可用国际单位(I.U/ml)表示，也可用mg/ml表示。 2.血清中IgG正常值范围：

IgG：12.0±2.62mg/ml

IgA：2.00±0.50mg/ml

IgM：1.10±0.30mg/ml

五、注意事项

(一)打孔时，应注意使孔之边缘整齐。

(二)加样时，样品液面应与免疫板平齐，过多或过少将影响其准确性。

六、报告要求

绘图记录和解释实验结果。

实验六双向琼脂扩散试验

(Double Agar Diffusion Test)

一、原理

在琼脂内抗原和抗体向四处扩散，在最恰当的比例处形成抗原抗体沉淀线，观察这种沉淀线的位置、形状以及对比关系，可作出对抗原或抗体的定性分析。

二、材料

器材：

1.洁净玻片（

2.6×7.6cm）。

2.打孔器（外径3mm），不锈钢挑针。

3.温箱，有盖搪瓷盒，微量加样器。

试剂：

1.pH 8.6，0.1M巴比妥缓冲液。

2. 1.2％琼脂凝胶：称取12g优质琼脂粉,置1000ml三角烧瓶中，加

蒸馏水500ml，水浴煮沸使琼脂溶解，然后加入500ml上述缓冲液，

内加万分之一硫柳汞后混匀，分装150ml三角烧瓶内，4℃保存备

用。

3.诊断血清（甲胎蛋白抗体），待测血清，阴性对照血清。

三、方法

1．取一清洁载玻片，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1.2%琼脂制成琼脂板。

2．凝固后，用直径3毫米打孔器打孔，孔间距为5毫米。孔的排列方式如下图所示。

图双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图

3．用微量加样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。

4．加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24—48小时。

四、结果观察：

若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原——抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。

五、结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。

①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见下图。

图双扩散试验结果示意图

A：已知抗体 a、b：阳性对照

c、d、e、f：被检材料

②抗原浓度与沉淀线形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图。