挥发性脂肪酸测定方法

2.5.1 挥发性脂肪酸总量的比色测定法

2.5.2.1 测定原理

含挥发性脂肪酸的样液，在加热的条件下，与酸性乙二醇作用生成酯，此酯与羧胺反应，形成氧肟酸。在高铁试剂存在下，氧肟酸转化为高铁氧肟酸的棕红色络合物，其颜色的深浅在一个较大的范围内与反应初始物——挥发性脂肪酸的含量成正比，故可用比色法测定。

2.5.2.2 测定方法

⑴试剂

①1：1硫酸：浓硫酸（相对密度1.84，C.P.）加到同体积蒸馏水中稀释配制。

②酸性乙二醇试剂：取30.0mL乙二醇(C.P.)与4.0mL配制的稀硫酸混合。

③4.5mol/L的氢氧化钠：称取180g氢氧化钠(C.P.)溶于水中，冷后以蒸馏水稀释至1L。

④10%硫酸羟胺溶液：称取硫酸羟胺(C.P.)10.0g，溶于100mL蒸馏水中。

⑤羟胺试剂：量取20.0 mL4.5mol/L的氢氧化钠，与5.0mL10%的硫酸羟胺相混合。

⑥酸性氯化铁试剂：将20.0g分析纯FeCl3·6H2O溶于500mL水中，准确加入20.0 mL浓硫酸，并以蒸馏水稀释至1L。

⑵测定程序

①乙酸标准液的配制。精确称取乙酸（分析纯，相对密度1.049，含

量≥99.5%）1.010g(如是液态可吸取0.963ml)，以蒸馏水稀释至100mL （可配200ml，后面配标准系列液100ml不够用），此溶液含乙酸10mg/mL。

准确吸取10 mg/mL乙酸标准溶液0.5 mL、1.0mL、5.0mL、10.0mL、15.0mL、20.0mL、25.0mL、30.0mL，分别置于100.0mL容量瓶内，以蒸馏水定容至刻度，摇匀，即得50mg/L、100mg/L、500 mg /L、1000 mg /L、1500 mg /L、2000 mg /L、2500 mg /L、3000 mg /L的乙酸标准系列液。

②标准曲线的绘制。按上述步骤，取相对密度1.045的乙酸（分析纯）试剂，制成50mg/L、100 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L、1500 mg/L、2500 mg/L、3000 mg/L的标准系列液，分别吸取0.5 mL分置于（25ml）试管中，并准确加入1.7 mL酸性乙二醇试剂，充分混合，于沸水浴中加热3min(应避免试管与加热器壁直接接触)，然后立即以冷水冷却；再加入2.5mL羟胺试剂，充分摇匀，放置1min，然后全部倒进盛有10mL酸性氯化铁试剂的25mL容量瓶（或比色管）中（这一步，我是直接在之前的试管中加入10ml的酸性氯化铁试剂，加完后立即摇匀），然后，充分振荡混匀，以蒸馏水定容至25ml，用721型分光光度计以500nm波长测定其光密度（吸光度），绘制标准曲线，以横坐标表示浓度值，纵坐标表示光密度值（吸光度）--这个随意，我习惯将浓度做纵坐标。

③样品的测定。以4000～10000r/min的离心条件，制取沼气发酵样品澄清液（没条件就多静置沉淀一会），吸取0.5mL样液置于试管中

（12.5cm×1.5cm），准确加入1.7 mL酸性乙二醇试剂，充分混合，于沸水浴中加热3min，应避免试管与加热器壁直接接触。然后立即将试管置于冷水中冷却。加入2.5mL羟胺试剂，并混匀，放置1min，然后全部倒进盛有10mL酸性氯化铁试剂的25mL容量瓶中，用蒸馏水定容，并充分摇匀，静置5min，用分光光度计以500nm波长测定光密度。同样操作做空白试验1份。

计算----我是直接带入做出来的标准曲线拟合方程中，求出浓度，如果稀释了，再乘以稀释倍数。

C×V1

挥发性脂肪酸= V ×103（mg/L）

式中C——样液光密度值相应于标准曲线上挥发酸的含量，mg；

V——测定样液体积，mL；

V1——测定时液样的稀释倍数。

2.5.2.3 注意事项

①此方法是挥发性脂肪酸总量的经验测定法，比蒸馏法测定更为简便、快速。除150mg/L以下的低浓度范围外，其测定值相对误差与气相色谱法测定总值的相对误差相近。

②此法中的反应是在严格的pH值条件下进行的，最适pH值为1.6±0.1。pH值高于2.0时，色度加剧，pH值低于1.0时，颜色难以稳定，易消失。

③酸性己二醇试剂和羟胺试剂宜使用时配，也可在测定中配入。例如，以加入1.5mL己二醇和0.2mL稀硫酸来代替1.7mL酸性己二醇试剂，以0.5mL硫酸羟胺和2.0mL4.5mol/L的氢氧化钠来代替2.5mL羟

胺试剂。

④如果所做的空白测定含量酸量超过200mg/L时必须用氢氧化钠蒸馏提纯己二醇。

⑤酸性氯化铁配制好后，应静置过夜，弃去沉淀。

⑥必须严格遵守操作规程，显色反应必须充分摇动。

⑦比色法没挥发性脂肪酸总量，方便快速，对于特定样品（特别是污水污泥体系）的准确度较高，适合于沼气发酵的常规分析。