新生小鼠genotyping protocol
PCR法鉴定RorcγtGFP突变小鼠子代基因型
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Objective Methods Results Conclusion To investigate the feasibility of PCR in the genotype identification of Rorc t mutation mouse offspring.The genome DNA was extracted from the tails of six newborn mice produced by a male Rorc t(-/-)mouse and a female Rorc t(-/+)mouse.Rorc t gene fragments were amplified by PCR and then detected by agarose gel electrophoresis.Three mice had Rorc t(-/-)genotype with 241bp gene fragment,while three mice possessed Rorc t (-/+)genotype with 174bp and 241bp gene fragments.PCR-based method is simple and feasible for the genotype identification of Rorc t mutation mouse offspring.mouse;orphan receptor;genotype;PCR???????GFP GFP PCR Rorc t 法鉴定突变小鼠子代?GFP 基因型陈嵘，阿彩岭，周英，樊翌明祎（广东医学院附属医院皮肤科，广东湛江）524001ＰＣＲ－ｂａｓｅｄｇｅｎｏｔｙｐｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｉｌｉａｌｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎＲｏｒｃｔｍｕｔａｔｉｏｎｍｉｃｅ?ＧＦＰCHEN Rong-yi,E Cai-ling,ZHOU Ying,FAN Yi-ming (Department of Dermatology,Affiliated Hospital of Guangdong Medical College,Zhanjiang 524001,China)摘 要：关键词：中图分类号：文献标识码：文章编号：目的方法结果结论ＤＯＩ：PCR()Rorc t Rorc t(-/-)Rorc t(-/+)6DNA PCR PCR 3PCR 241bp Rorc t(-/-)3174bp 241bp Rorc t(-/+)PCR Rorc tR 394.1A 1005-4057(2012)05-0477-06-0603-0310.3969/j.issn.1005-4057.2012.06.003探讨聚合酶链式反应法鉴定突变小鼠子代基因型的可行性。
生物技术本科毕业论文pcr方法在apoe基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用
湖北中医药大学本科生毕业论文题目：PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用姓名：学号：专业：生物技术年级：2008级实习单位：武汉大学心血管病研究所指导老师：完成日期：2012 年5 月1 日PCR方法在ApoE基因敲除小鼠基因型鉴定中的应用作者肖明瑶指导者张艳摘要目的为ApoE基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。
方法设计两对引物扩增野生型ApoE基因和ApoE缺陷突变基因的DNA片段，用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度，然后用PCR鉴定方案检测小鼠基因型并将所得基因型结果与已经过经典的Southern blot方法检测得到的基因型结果比较。
结果野生型仅在155 bp处有一条条带，突变纯舍子仅在245 bp处有一条条带，杂合子则在155和245bp处出现两条条带。
用PCR方法获得的ApoE基因分析结果与经典的Southern blot方法获得的结果完全一致。
结论用PCR方法分析ApoE基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点。
关键词聚合酶链反应基因型基因打靶载脂蛋白EGenotype identification of ApoE Gene Knockout Mice withPolymerase Chain ReactionObjective This study was to explore a simple and quick polymerase chain reaction（PCR）method for genotyping of ApoE knockout mice.Method Two pairs of primers were designed to amplify genomic DNA fragment of wild-type ApoE gene and the same region on ApoE targeting veceor respectively.A gradient PCR strategy was used to test the best annealing temperature. Results A 155bp band was found in wild-type ApoE mice,a 245 bp band in homozygous mutated ApoE mice and both bands in hetemzygous mice.The genotyping results were completely coincided with those from typical Southern blot. Conclusion PCR is a simple,fast and practical method for the genotyping of ApoE gene knockout mice.Key words Poiymerase Chain Reaction genotype gene targeting ApoE载脂蛋白(apolipoprotein，ApoE)是清除乳糜微粒和极低密度脂蛋白的受体的配体，因此，缺乏ApoE则会导致血液循环中富含胆同醇的物质积累而更加容易引起动脉粥样硬化(atl-rosclerosis，AS)病灶形成。
基因工程小鼠饲养繁育及鉴定策略
基因工程小鼠饲养繁育及鉴定策略基因工程小鼠是研究基因功能和疾病机制的重要模型生物，它们通过基因工程技术进行特定基因的敲除、突变或过表达，从而模拟人类疾病的发生和发展过程。
然而，饲养和繁育基因工程小鼠以及对其进行鉴定是一个复杂而关键的过程。
本文将介绍基因工程小鼠饲养繁育及鉴定的策略。
一、基因工程小鼠饲养繁育策略1. 选择合适的饲养环境：基因工程小鼠对其饲养环境的要求较高，应提供适宜的温度、湿度和光照条件，以及清洁的饮水和饲料。
饲养箱应定期消毒，确保小鼠的健康生长。
2. 选择合适的饲料：基因工程小鼠的饲料应根据其基因改造的特点进行调整。
例如，敲除特定基因的小鼠可能需要特殊的饲料补充物来维持其生存和生长。
3. 繁殖管理：基因工程小鼠的繁殖需要进行严格的管理。
通常采用配对交配的方式进行繁殖，确保后代的基因遗传稳定。
此外，对于一些特殊基因型的小鼠，可能需要进行人工授精或胚胎移植等技术手段来实现繁殖。
4. 健康监测：定期对基因工程小鼠进行健康监测，包括体重、行为观察和疾病筛查等。
如发现异常情况，应及时采取相应的处理措施，以保证小鼠的健康状况。
二、基因工程小鼠鉴定策略1. 基因型鉴定：通过PCR、Southern blotting、Western blotting等技术来检测基因工程小鼠是否成功敲除、突变或过表达目标基因。
这些技术可以通过检测目标基因的DNA或蛋白质来确定小鼠的基因型。
2. 表型鉴定：基因工程小鼠的表型鉴定是评估其外部表现和生理特征的过程。
通过观察小鼠的行为、外貌、器官形态等方面的变化，可以初步判断基因改造对小鼠的影响。
3. 功能鉴定：基因工程小鼠的功能鉴定是评估其基因改造对生物学功能的影响。
可以利用行为学实验、生理学指标测定、组织学分析等技术手段来评估小鼠的功能变化，进一步揭示基因改造对生物过程的影响机制。
4. 遗传稳定性鉴定：基因工程小鼠的遗传稳定性鉴定是评估其基因改造是否稳定传递给后代的过程。
转基因小鼠制备实验方法
转基因小鼠制备实验方法1.计划设计：首先确定研究目的和研究对象基因的功能。
根据目的，选择适合的转基因策略。
2.构建转基因载体：根据研究对象基因的序列，设计合成含目标基因的转基因载体。
一般可选择质粒、病毒载体或者合成RNA/DNA方式构建转基因载体。
3.构建胚胎干细胞（ES）或受精卵DNA库：通过开展反转录聚合酶链反应（RT-PCR）方式，从小鼠胚胎组织中制备出RNA，然后利用逆转录酶将RNA转化成cDNA；之后，利用特定引物扩增目标基因的cDNA片段，将其克隆到适当的表达载体中，最终构建ES细胞库或者受精卵DNA库。
4.转染、筛选和克隆：将所构建的转基因载体导入到ES细胞或者受精卵中，使其整合到其基因组中。
然后，采用药物筛选、DNA分子标记、PCR和Southern blot等方法对转染后的细胞进行筛选和鉴定，获得含有目标基因的ES细胞克隆或者转基因小鼠胚胎。
5.基因敲除或添加：6.培养和培育：将获得的转基因ES细胞或者受精卵注入到养殖母鼠子宫中进行妊娠，然后等待幼鼠出生。
根据需要，可将转基因小鼠进行进一步培养、繁殖和鉴定。
为了进行转基因小鼠的后代繁殖，需要对转基因小鼠进行基因型鉴定和表型分析。
7.基因鉴定和表型分析：通过PCR、Southern blot、Western blot、RT-PCR或者其他的基因鉴定技术，对转基因小鼠的基因型进行鉴定。
同时，可以通过行为学、生理学和病理学等方法对转基因小鼠进行表型分析。
8.数据分析与结果解读：对表型数据进行统计分析，绘制图表或者进行统计学分析。
根据实验设计和方法，对实验结果进行解读，并得出相关结论。
总结起来，转基因小鼠制备是一个复杂而严谨的实验过程。
通过设计转基因载体、构建DNA库、转染和克隆、培养和培育小鼠以及基因鉴定和表型分析，可以成功制备目标基因转基因小鼠，并用于研究其功能、调控机制以及在疾病中的作用。
模式小鼠总 DNA 三种提取方法比较
模式小鼠总 DNA 三种提取方法比较刘甦苏;左琴;周舒雅;王辰飞;贺争鸣;李保文;范昌发【摘要】目的：建立简便、快捷、经济的模式小鼠总DNA提取方法，以快速鉴定大批量模式小鼠基因型。
方法采用苯酚抽提法、异丙醇沉淀法、鼠耳煮沸法提取同种模式小鼠总DNA，对比DNA纯度、得率、耗费时间，并比较基因型鉴定结果。
结果苯酚抽提法得率最高，异丙醇沉淀法最低；而纯度则按照苯酚抽提法、异丙醇沉淀法、鼠耳煮沸法顺序递减；在耗时上鼠耳煮沸法最短。
三种方法提取的DNA均可做模版用于基因型鉴定。
结论鼠耳煮沸法操作简单、成本最低，快速、基因型鉴定结果可靠，可用于规模化的基因型鉴定实验中。
%Objective To establish a simple , fast and economic total DNA extraction method to serve the rapid identification of model mouse genotype in large number of mice .Methods Three methods, i.e.phenol extraction, isopropyl alcohol precipitation and mouse ear boiling methods were used to extract the total DNA from ten C 57-rasmodel mice.The purity and yield of DNA obtained by the three methods were compared , and polymerase chain reaction ( PCR) assay was used to compare the efficacy of the three extraction methods .Results Among the three methods , phenol extraction was the best and isopropyl alcohol precipitation was the poorest in DNA yield .In terms of DNA purity , the phenol extraction was the best and the mouse ear boiling method was the poorest .All the three methods could be used to extract the total DNA from mice serving as template of PCR reaction for the mouse genotype identification .The time consumption of three methods are 12.5 hr ,13 hr and 0.18 hr.Mouse ear boiling methodwas significantly lower than that of the other two methods ( P <0.01 ) ,.The obtained total DNA can be stored at conventional -20℃for 7 days and 30 days later still can be used as a template for PCR reaction .Conclusions Among the three methods studied , the mouse ear boiling method is simple and with the lowest cost , so it is feasible for total DNA extraction in scaled genotyping experiments .【期刊名称】《中国比较医学杂志》【年(卷),期】2014(000)007【总页数】6页(P45-50)【关键词】总DNA提取方法;基因型鉴定;PCR反应;模式小鼠【作者】刘甦苏;左琴;周舒雅;王辰飞;贺争鸣;李保文;范昌发【作者单位】中国食品药品检定研究院，国家啮齿类实验动物种子中心，北京100050;中国食品药品检定研究院，国家啮齿类实验动物种子中心，北京 100050;中国食品药品检定研究院，国家啮齿类实验动物种子中心，北京 100050;中国食品药品检定研究院，国家啮齿类实验动物种子中心，北京 100050;中国食品药品检定研究院，国家啮齿类实验动物种子中心，北京 100050;中国食品药品检定研究院，国家啮齿类实验动物种子中心，北京 100050;中国食品药品检定研究院，国家啮齿类实验动物种子中心，北京 100050【正文语种】中文【中图分类】R332随着基因工程技术的不断发展和完善，基因工程小鼠越来越多的应用于生命科学研究中，已渗透到医学、发育生物学、遗传学、动物育种学等各个领域。
【资料】鼠模型
【资料】⿏模型近交系⼩数的出现在基础医学中的影响是⽆与伦⽐的，尤其在免疫学中的作⽤，若不是近交⼩⿏的出现，免疫学可能就夭折了，现在免疫学是基础学科中最活跃进步最快的学科。
在⼤多数情况下，我们对于实验动物的选择是盲⽬的，除了跟⽂献就再⽆别的办法，与此同时，实验动物是研究机构中最受冷落的学科。
现在提供⼀份实验⼩⿏介绍，希望⼤家能有收获。
近交系动物品系特征及⽤途⼀、⼩⿏近交品系特征及⽤途简介1.A/J：(1)遗传背景：①起源：1921年L.C.Strong博⼠⽤冷泉港Cold Spring Harbor albino⽩化原种和Bagg albino⽩化原种杂交后，近交培育⽽成。
1928年引到Cloudman，1947年引到Jax，1988年引⼊IMLAS(中国医学科学院实验动物研究所)。
②近交代数：196代(Jax,1984)③⽑⾊和⽑⾊基因：⽩化，aa、bb、cc。
④组织相容性基因：H-2a(A，A/J，A/He，A/SnSf，A/WySN)。
H-1(no a or c)H-3(no a or b)。
(2)品系特征：①免疫：44%6⽉龄母⿏，红斑狼疮细胞和抗核抗体阳性，缺乏补体C5，对抗原注射的免疫应答良好，⼲扰素产量低，蛋⽩激酶补体Ｃ的活性是其它品系⼩⿏的⼀半。
②肿瘤：乳腺肿瘤发病率中等，肺肿瘤发病率⾼，原发性肺肿瘤雄性为6%，雌性为32 %，⾮⽣育雌性为26%。
可作为致癌作⽤的活体测试动物，⼴泛⽤于肿瘤学研究。
③微⽣物、寄⽣⾍：对伤寒、沙门⽒菌、补体C5有抗⼒，对狂⽝病毒有⼀定的敏感性，对单核细胞增多性利斯特菌敏感，对Calmette-Guerin杆菌有抗⼒，对绿脓杆菌有较强的敏感性，由于其带有Hc°等位基因，因此其对新型隐球菌敏感，其它敏感性见于N.N.Nesbitt and E.Skamene.J.Leuk.Biol.36:357,1984。
④⽣理：⾎压低，收缩压仅为81mmHg，红细胞⽐容48％，粒细胞百分率低。
基因敲除小鼠制备的流程
基因敲除小鼠的制备流程基因敲除小鼠已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的实验动物模型，在生命科学、人类医药和健康研究领域中发挥着重要的作用。
基于胚胎干细胞的基因打靶技术、EGE技术（基于Crispr cas9技术）是当下比较火热的基因敲除小鼠制备技术。
利用这两种技术制备基因敲除小鼠的流程是什么样的？一、基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠的流程：1.课题设计，订购课题BAC菌；2.按照课题设计，完成打靶载体设计和构建；3.将重组载体电转到胚胎干细胞中，用G418筛选转染后的胚胎干细胞，得到阳性克隆；4.进一步通过PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对上一步得到的阳性克隆进行筛选，得到稳定整合外源基因的胚胎干细胞阳性克隆；5.将胚胎干细胞阳性克隆注射到小鼠囊胚中，并植入到假孕小鼠的子宫内；6.得到嵌合鼠，并获得F1阳性杂合子小鼠。
基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠是目前为止唯一一个可以满足几乎所有基因组修饰要求的打靶技术，但目前只应用在小鼠的基因敲除上，而且其周期长工作量大。
二、利用EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠的流程1.设计构建识别靶序列的sgRNA;2.设计构建致靶基因切割的EGE系统载体质粒；3.利用百奥赛图自主开发的UCA试剂盒对sgRNA/Cas9进行活性检测；4.设计构建打靶载体；5.体外转录sgRNA/Cas9 mRNA;6.小鼠受精卵原核注射sgRNA/Cas9 mRNA和打靶载体；7.获得Fo代小鼠，利用PCR对Fo代小鼠进行基因型鉴定；8.获得F1代小鼠，利用PCR和southern blot杂交技术（基因敲除小鼠检测金标准）对F1代小鼠进行基因型鉴定。
虽然EGE技术（基于Crispr cas9技术）制备基因敲除小鼠看似比基于胚胎干细胞的基因打靶技术制备基因敲除小鼠流程繁琐，其实不然，EGE技术（基于Crispr cas9技术）系统构建简单，基因敲除/敲入效率高，速度快，可实现多基因、多物种基因敲除/敲入，最快2个月即可得到F0代阳性鼠，5个月得到F1F1代杂合子小鼠。
小鼠基因鉴定常见问题_概述及解释说明
小鼠基因鉴定常见问题概述及解释说明1. 引言1.1 概述小鼠基因鉴定是一项关键的科学研究技术，它通过识别小鼠个体的遗传信息和基因组成，为我们解析小鼠表型和功能的分子基础提供了有力的支持。
随着基因研究的发展，对小鼠基因的认知越来越深入，小鼠逐渐成为了研究人类健康和疾病模型中不可或缺的工具。
1.2 文章结构本文将首先介绍小鼠基因鉴定常见问题方面的相关内容，包括针对什么是小鼠基因鉴定、常见的小鼠基因鉴定方法以及小鼠基因鉴定在科学研究中的应用领域等内容。
随后，我们将进一步解释说明进行小鼠基因鉴定的原因、意义和价值，并探讨这一领域未来发展的前景与趋势。
最后，在结论部分对总述概况进行归纳，并展望和建议关于小鼠基因鉴定问题的未来方向。
1.3 目的本文旨在全面了解和阐述小鼠基因鉴定常见问题，旨在帮助读者更好地理解和认识小鼠基因鉴定的重要性和意义。
通过阐述该领域的相关知识，我们希望能进一步促进和推动小鼠基因研究领域的发展，并为相关研究人员提供指导和参考。
2. 小鼠基因鉴定常见问题2.1 什么是小鼠基因鉴定：小鼠基因鉴定是指通过分析和检测小鼠DNA或RNA中的遗传信息，以确定小鼠个体的基因组中是否存在特定的基因变异或突变。
它可以帮助研究人员识别和验证与小鼠表型特征相关的关键基因。
2.2 常见的小鼠基因鉴定方法：常用的小鼠基因鉴定方法包括：- Polymerase Chain Reaction (PCR)：PCR是一种广泛应用于分子生物学领域的技术，可在体外扩增目标DNA片段。
通过PCR反应，我们可以对感兴趣的DNA区域进行快速而精确的放大，从而便于后续分析。
- Southern blotting：Southern blotting结合了电泳和杂交技术，能够检测目标DNA序列。
该方法适用于检测某一特定片段在小鼠基因组中是否存在。
- Northern blotting：类似于Southern blotting，但Northern blotting主要用于检测RNA分子。
小鼠基因型鉴定条带
小鼠基因型鉴定条带
小鼠基因型鉴定条带是指在基因鉴定过程中，通过特定的检测方法观察到的条带状图谱。
这些条带代表了小鼠基因组中特定位置上的DNA片段，可以通过其大小和数量来判断小鼠的基因型。
在小鼠基因型鉴定中，常见的条带类型包括野生型条带和突变型条带。
野生型条带代表小鼠基因组中未发生突变的DNA片段，而突变型条带则代表发生了基因突变。
根据条带的特征，可以判断小鼠是否携带某种突变基因。
除了野生型和突变型条带外，还可能出现杂合子条带。
杂合子条带代表小鼠基因组中同时存在野生型和突变型DNA片段的情况，即小鼠为杂合子。
在进行小鼠基因型鉴定时，通常会进行一系列的检测步骤，包括DNA提取、PCR扩增、电泳等。
这些步骤的目的是为了获得清晰的条带，以便准确判断小鼠的基因型。
总之，小鼠基因型鉴定条带是小鼠基因型鉴定的关键指标之一，通过观察条带的特征可以判断小鼠是否携带某种突变基因，以及小鼠的基因型是纯合子、杂合子还是野生型。
小鼠遗传学及其分类命名
BALB/cByJ
A 278bps deletion of the acyl-Coenzyme The Jackson A dehydrogenase, Laborator y short chain, (Acads )locus The NIH Locus intact
小鼠遗传学及分类命名
顾鹏宇 2008-8
• • • • •
遗传学基础知识 实验小鼠起源 实验小鼠的分类及其命名 遗传监测 繁育体系
分子遗传学
基因（GENE）
•编码特定蛋白产物的DNA序列 •基因可能存在可变形式，称为等位基因（allele）
等位基因(Alleles)
homozygous heterozygous hemizygous
实验小鼠起源
家鼠起源
M. musculus 各亚种的地理分布
History of the Laboratory Mouse
• • • • • • • 1100 BC- color-variant mice (China) 1909first inbred strain 1929The Jackson Laboratory 1962nude mouse 1980first transgenic mouse 1989first knockout mouse 1990sconditional/inducible knockouts, knock-in, mouse genome project • 2002RNA interference knockouts?
近交系的命名
• 基于毛色
DBA (Dilute Brown nonAgouti, first inbred mouse) 基于起源 NZW (New Zealand White) 基于表型 NOD (Non-Obese Diabetic) 其它 BALB/c, C57BL, 129
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从小鼠合笼到基因分型
一，小鼠合笼：
1，准备需要合笼的老鼠（要求为性成熟老鼠：8—10周龄），记录老鼠基本信息，包括编
号，性别，出生日期，基因型。
2，挑选需要合笼的公鼠，每笼放一只，记录笼号和卡片流水号，并在卡片上标记该老鼠的
基本信息（编号，基因型）。
3，挑选需要合笼的母鼠，每笼 只，同样在卡片上标记母鼠的基本信息（编号，基因
型），注意，同一笼中母鼠的耳号不能相同。
4，合笼时间的选择 （具体情况具
体分析）。
5，母鼠验栓。合笼次日晨8:00验栓，有阴栓的母鼠更换到仅放有受孕母鼠笼中，在卡片上
标记好母鼠信息（包括与该母鼠交配的公鼠的编号），在原鼠笼的卡片上划掉该母鼠信息。
6，重复步骤5连续三天，将仍未受孕的母鼠统一分装到不含有公鼠的笼中，标记相应信息
卡片，至此合笼结束。
二，新生小鼠基因分型
1，新生小鼠从出生时P0开始计数，到4周龄p28时需要对其进行基因分型且进行分笼。
2，对小鼠耳号的编号方式见下图：
3，按照一窝新生老鼠8只（3只Male, 5只Female）为例，按上图耳号的位置打耳号，编号
方式为（Male）1-1, 1-2, 1-3, (Female)2-1, 2-2, 2-3, 2-4, 2-5, 做好分笼，将打耳号时产生的ear
punch biopsy放于对应编号的PCR管中，管上做对应编号。
4，Add 40μl Sol Ⅰ，Heat to 95℃ 15min，Add 40μl Sol Ⅱ
5，2μl for PCR reaction.
6，PCR结果凝胶电泳，电泳结果拍照并打印，清晰标记每个泳道的对应小鼠编号。
7，按照小鼠编号和电泳结果，在分笼后鼠笼卡片上标记对应小鼠编号的基因型。
相关试剂配方：
Solution Ⅰ Alkaline lysis reagent
Reagent [final concentration] Add of
NaOH 25mM 125μl 1M NaOH
EDTA 0.2mM 20μl 0.5M EDTA
pH 12 (1M HCl adjust pH) Total volume 50ml
Solution Ⅱ Neutralization buffer
Reagent [final] Add of
Tris 40mM 325mg Tris-base
pH 5 (1M HCl adjust pH) Total volume 50ml
背部
右耳