细胞工程复习资料
动物细胞工程复习课
7.体细胞核移植技术还存在什么问题？ ①成功率非常低； ②绝大多数克隆动物还存在健康问题
9.过程：
取供体细胞 供体细胞培养 取卵母细胞 培养到 MⅡ中期
卵母细胞去核
5.原代培养与传代培养有何区别 ? 将动物组织消化后的初次培养就是原代培养。 当原代培养的细胞贴满瓶壁后，用胰蛋白酶处理， 制成细胞悬浮液后再次分瓶继续培养就是传代培养 6.动物体细胞培养技术能将一个分化的体细胞培养 成为一个动物体吗？为什么？ 不能，因为高度分化的动物细胞丧失了发育成动 物体的能力。 7.为什么要将组织分散成了单个细胞再进行培养？ 单个细胞容易和周围环境进行物质交换——获得 营养物质、氧气等，排出代谢废物；
治疗性克隆（P49） 需要胚胎移植吗？
克隆人与治疗性克隆的区别
属于个体水平，目的产生新个体，而治疗性克 隆则属于细胞（或组织、器官）水平，目的是 治疗疾病。
动物细胞融合技术
1.过程：
动物细胞 A 动物细胞 B 诱导方法 成功标志
诱导，融合 （膜融合、质融合） 2个完整的 杂交细胞AB 有丝分裂 （核融合）
2.单克隆抗体的应用：
单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高
１.作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质， 并与抗原特异性结合 优点：准确、高效、简易、快速 2.用于 治疗疾病：主要用于癌症治疗 运载药物：制成“生物导弹” 优点:疗效高、毒副作用小
免疫 经过免疫的 注射抗原 B淋巴细胞
骨髓瘤 细胞
单 克 隆 抗 体 的 制 备 过 程 ：
注意：动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放 在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细 胞
细胞工程复习
（5）若①是胡萝卜根尖细胞，则培养成的④ 的叶片的颜色是 绿色 ，这说明根尖细胞 含有与叶绿体形成相关的基因 。 （6）若利用此项技术制造治疗烫伤、割伤的 药物——紫草素，培养将进行到（填编号） ② 。
下图为细胞融合的简略过程图，请回答：
（1）若A、B是植物细胞，在细胞融合 之前已经用纤维素酶和果胶酶 处理，除 细胞壁 ；A、B到细胞C的过程中，常 去了 用的物理方法是电刺激、振动、离心，融 合完成的标志是产生新的细胞壁 。 （2）若A、B是植物细胞则形成的D细胞 还要应用 植物组织培养 技术把D细胞培养 成植株。 （3）若A、B是动物细胞，一般取 自动物胚胎或出生不久的幼龄动物的器官或组织 ， 然后用胰蛋白酶使其分散开来。A、B到C 的过程中，常用的不同于植物细胞的手段 是 ，所形成的D称为 杂种细胞 。 灭活的病毒诱导
12. 不能人工诱导原生质体融合的方法是 A.振动 B. 电刺激 D C. PEG试剂 D. 重压
13. 植物体细胞杂交的结果是（ A ） A. 产生杂种植株 B. 产生杂种细胞 C. 原生质体融合 D. 形成愈伤组织
14. 植物体细胞杂交的目的中错误的是（ D ） A. 把两个植物体的优良性状集中在杂种植株上 B. 获得杂种植株 C. 克服远源杂交不亲和的障碍 D. 实现原生质体的融合
8.“生物导弹”是指（ ） D A.单克隆抗体 B. 产生特异抗体的B淋巴细胞 C. 杂交瘤细胞 D. 在单克隆抗体上连接抗癌药物
9. 利用下列细胞工程技术培育出的新个体中， 只具有一个亲本的遗传特性的是（ ） D ① 细胞和组织培养 ② 细胞融合 ③ 动物胚胎（分割）移植 ④ 克隆羊技术（多 利） A. ①② B. ②③ C. ①③ D. ①④
6. 用高度分化的植物细胞、组织和器官进行组 织培养可以形成愈伤组织，下列叙述错误的是 （ ） B A. 该愈伤组织是细胞经过脱分化和分裂形成的 B. 该愈伤组织的细胞没有全能性 C. 该愈伤组织是由排列疏松的薄壁细胞组成 D. 该愈伤组织可以形成具有生根发芽能力的胚 状结构
人教版教学课件《植物细胞工程》复习课件
思考5、植物的组织培养和植物的体细胞杂交比较
名称 原理 植物组织培养 细胞的全能性 植物体细胞杂交 细胞膜具有一定的流动性和细胞的全 能性
过程
①选材：选取根尖、茎尖、形成 层部位、最容易诱导脱分化 注意 ②光照：脱分化过程不需光照， 事项 再分化过程一定要有光 ③整个过程要在无菌条件下 生生不息 生命不止
生生不息 生命不止
考点探究2 植物的体细胞杂交
下图是植物体细胞杂交示意图，请据此回答：
(1)图中完成植物体细胞融合的过程是(填编号)_________________。 (2)图中④过程是_________，⑤过程是_________，④⑤过程合称_________。 (3)图中①过程用到的酶是_________，作用的结果是形成_________。之所以要用它们是要 除去_________________，除去的原因是_______________。 (4)在②过程中，可用的化学诱导剂是_________，可用的物理方法是_________。若在容器 中放置若干a和b结构，诱导完成且假设所有细胞都发生了融合，然后经③过程，形成的d细 胞的类型有_________种(这里仅考虑2个原生质体的相互融合)，从中选出_________进行培 养。
终点：杂种植株
生生不息 生命不止
思考3、植物体细胞杂交的成果和未解决的问题是 什么？
成果：克服不同生物远缘杂交的障碍，出现自然界没有的新品
种。
未解决的问题：未能让杂种植物按照人们的需要表现出亲代的 优良，因为生物基因的表达是相互调控、相互影响的。
生生不息 生命不止
思考4、植物的体细胞杂交与植物的有性杂交易错 警示。
生生不息 生命不止
细胞1中含有本物
高考生物一轮复习第47讲植物细胞工程
【考向探究】
（优P342）
2.(2021福建高考)科研人员利用植物体细胞杂交技术培育矮牵牛新品种,
技术流程示意图如下。
下列叙述正确的是( D )
A.愈伤组织是幼嫩叶片通过细胞分化形成的 B.获得的杂种植株都能表现双亲的优良性状 C.可用聚乙二醇诱导原生质体甲和乙的融合和细胞壁再生 D.用纤维素酶和果胶酶处理愈伤组织以获得原生质体
【考向探究】
（优P340）
1.(2023届云浮期末)菊花组织培养的过程如图所示,正确的是( C )
幼嫩的菊花茎段 消毒 培养 愈伤组织 新植株 移栽
A.①过程可以用高压蒸汽法对基段进行消毒处理 B.②过程将外植体的1/4~1/2插入诱导愈伤组织的培养基中 C.④过程应当给予光照,促进叶绿素的合成以便于进行光合作用 D.整个过程中细胞发生了基因突变和基因重组
D.在进行细胞悬浮培养的过程中,需要通入无菌空气
【下节复习巩固】 （第1课时） 1.植物组织培养流程图：
脱分化 外植体
避光
愈伤组织
再分化 生芽、生根 生长发育 试管苗
光照 （或胚状体）
（植物体）
2.决定脱分化和再分化的关键激素是 生长素和细胞分裂素 ; 3.植物组织培养利用的原理： 植物细胞具有全能性 ； 4.植物组织培养的生殖方式 无性生殖 ，
【强基础】 考点三 植物体细胞杂交技术
融合成功的标志
去①除
再生出
杂交完成的标志
细胞壁
细胞壁
A细胞
人工诱导 原生②质体
去①除 细胞壁
融合 正在融合的 原生质体
B细胞 原生②质体
脱分化 再分化
④
⑤
③
杂种细胞 愈伤组织 培育出杂
种植株
2023届高考生物二轮复习专题9 考点2 植物细胞工程和动物细胞工程-讲义(通用版)
考点二植物细胞工程和动物细胞工程1．植物组织培养的过程——原理：植物细胞的全能性(1)植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。
(2)脱分化阶段不需要光，再分化阶段需要光。
(3)生长素与细胞分裂素的比值高时，促进根的分化、抑制芽的形成；比值低时，促进芽的分化、抑制根的形成。
(4)体内细胞未表现全能性的原因：基因的表达具有选择性。
2．植物体细胞杂交技术——原理：植物细胞的全能性、细胞膜的流动性3．针对二类目标(试管苗、细胞产物)的培养流程4．动物细胞培养(以贴壁细胞为例)——原理：细胞增殖(1)动物细胞培养过程①动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同：第一次：处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞；第二次：使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。
②保障无菌、无毒的措施：对培养液和培养用具进行灭菌处理及在无菌条件下进行操作，定期更换培养液。
③区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。
(2)干细胞5．单克隆抗体的制备——原理：细胞膜的流动性、细胞的增殖(1)3种细胞特点不同：①B淋巴细胞：能分泌抗体，不能大量增殖。
②骨髓瘤细胞：能大量增殖，不能分泌抗体。
③杂交瘤细胞：既能分泌抗体，又能大量增殖。
(2)2次筛选目的不同：①第1次：获得杂交瘤细胞。
②第2次：获得能分泌所需特异性抗体的杂交瘤细胞。
6．动物体细胞核移植技术——原理：动物细胞核的全能性(1)核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：①克隆动物遗传物质来自两个亲本。
②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。
③外界环境可能引起不可遗传的变异。
(2)克隆动物的产生是无性繁殖，而试管动物则是在体外受精形成受精卵，由受精卵发育成的个体，因此属于有性繁殖。
1．(2017·海南，31)甲、乙两名同学分别以某种植物的绿色叶片和白色花瓣为材料，利用植物组织培养技术繁殖该植物。
回答下列问题：(1)以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是_________________________________________________________________。
细胞工程复习题
一、名词解释1、接触抑制：细胞汇合相互接触后失去运动的现象。
2、原代培养：从体内取出细胞或组织的第一次培养。
3、传代：也称再培养，无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。
4、细胞系：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系。
5、密度抑制：细胞数量到一定数量后引起抑制增殖的现象。
6、细胞株：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养物称细胞株。
7、无血清培养基：又称化学限定性培养基或化学成分明确的培养基。
指不需要添加血清就可维持细胞在体外较长时间生长和繁殖的合成培养基。
8、天然培养基：来自动物体液或利用组织分离提取的一类培养基。
如血浆、血清、组织浸出液、淋巴液等。
9、合成培养基：人们用各种化学物质设计出的用于细胞培养的培养基。
10、细胞工程：是按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。
11、细胞融合又称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合形成一个细胞的过程。
12、体外活细胞染色：在体外培养条件下，用某种染料对活细胞或组织进行染色，而不影响活细胞生命活动的一种方法。
利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。
13、体外受精（IVF）：人为操作使成熟的卵子与精子在合适的体外环境中完成受精过程。
14、发育阻滞：体外受精的早期胚胎在体外发育中往往会停滞在某一阶段不再发育，即发育阻滞。
15、胚胎移植：也称受精卵移植，是将良种母畜配种后的受精卵或早期胚胎取出，移植到具同种生理状态的母畜体内，使之继续发育成新个体，所以也成“借腹怀胎”。
16、细胞脱分化：一定培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程就是细胞脱分化。
17、细胞再分化：脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在一定条件下，重新分化为各种类型的细胞，并进一步发育成完整植株。
第2章细胞工程-备战2023年高考生物一轮复习知识清单2
第2章细胞工程细胞工程的发展历程1．1960年，科金用真菌的___________分解番茄根的细胞壁，成功获得了原生质体。
（P32）2．1971年，卡尔森诱导烟草种间___________融合，获得了第一株体细胞种间杂种植株。
（P32）3．1974年，土壤农杆菌的___质粒被发现。
之后，该质粒应用于植物分子生物学领域，促进了植物细胞工程与分子生物学技术紧密结合。
（P32）4．1951年，张明觉等发现了______________________现象。
（P33）5．1958年，格登用非洲爪蟾进行___________实验，成功培育出性成熟个体。
同一时期，我国科学家童第周等开展了鱼类细胞核移植工作。
（P33）6．1975年，米尔斯坦和科勒等创立了___________技术。
（P33）7．2017年，我国科学家首次培育了______________________。
（P33）8．细胞工程是指应用细胞生物学、分子生物学和发育生物学等多学科的原理和方法，通过_________、_________或_________水平上的操作，有目的地获得特定的细胞、组织、器官、个体或其产品的一门综合性的生物工程。
（P31）第1节植物细胞工程一、植物细胞工程的基本技术1．________________________________________________________________________，即细胞具有全能性。
但是，在生物的生长发育过程中，并不是所有的细胞都表现出全能性，比如，芽原基的细胞只能发育为芽，叶原基的细胞只能发育为叶。
这是因为在特定的时间和空间条件下，细胞中的_____________________。
（P34）2．植物组织培养是指__________________________________________________________________________ ___________________________（如图）。
细胞工程专题复习
班级：_____ 姓名：_________ 编制： 审核： 2014.04.08 细胞工程复习学案 山东省昌邑市第一中学细胞工程复习学案【复习目标】1.植物组织培养与动物细胞培养的比较2.植物体细胞杂交与单克隆抗体制备（动物细胞融合）的比较A ．B 试管中细胞全能性最高 B ．D 试管中培育出的个体都是纯合子C ．A →B 的过程不需要光照D ．A →D 的细胞分裂都是有丝分裂【合作探究】探究点一 植物体细胞杂交与动物细胞融合（单克隆抗体制备）的比较 1. 写出两种技术的实验流程：植物体细胞杂交技术 单克隆抗体制备2．对比两种技术实验流程，完成下表探究点二克隆动物（动物细胞核移植）与试管动物的比较1.写出克隆动物与试管动物的实验流程克隆动物试管动物【变式训练】1.植物体细胞杂交与动物细胞工程中所用技术与原理不相符的是（）A．纤维素酶、果胶酶处理和胰蛋白酶处理`──酶的专一性B．植物组织培养和动物细胞培养──细胞的全能性C．原生质体融合和动物细胞融合──生物膜的流动性D．紫草细胞培养和杂交瘤细胞的培养──细胞增殖2．用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是（）A．都需用CO2培养箱 B．都须用液体培养基C．都要在无菌条件下进行 D．都可体现细胞的全能性【随堂练习】1.(08上海生物)制备单克隆抗体所采用的细胞工程技术包括（）①细胞培养②细胞融合③胚胎移植④细胞核移植A．①② B．①③ C．②③ D．③④2. 利用动物细胞融合技术可获得杂交瘤细胞，下列针对单个杂交瘤细胞的叙述不正确的是( )A．需经筛选过程方可获得 B．具有双亲细胞的遗传物质C．可分泌多种特异性抗体 D．体外培养条件下可大量繁殖3.草莓主要利用其植株的茎进行无性繁殖，种植的世代多了往往会因病毒的积累而减产，为此农户都希望得到无病毒的幼苗进行种植。
在最短的时间内获得大量无病毒幼苗的最佳方法是（）A．花药离体培养B．选取成熟组织进行培养C．利用茎尖进行组织培养 D．人工诱导基因突变4.利用下列细胞工程技术培养出的新个体中，只具有一个亲本遗传性状的是（）①细胞和组织培养②细胞融合③胚胎移植④克隆牛A.①②B.②③C.①D.③5．以SARS病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体，以下正确的是( ) A．用纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，产生的血清抗体为单克隆抗体B．体外培养单个浆细胞可以获得大量针对SARS病毒的单克隆抗体C．将等量浆细胞和骨髓瘤细胞混合，经PEG诱导融合后的细胞不一定为杂交瘤细胞D．利用该单克隆抗体与SARS病毒核衣壳蛋白特异性结合的方法不一定能诊断出SARS 病毒感染者。
高三生物一轮复习课件：第35讲 细胞工程
细胞分裂素浓度 品种B组织培养阶段
（μmol/L）
生长素浓度 （μmol/L）
Ⅰ诱导形成愈伤组织 m1
n1
Ⅱ诱导形成幼芽
m2
n2
Ⅲ诱导生根
m3
n3
（1）Ⅰ阶段时通常选择茎尖、幼叶等作为外植体，原因是_细__胞_分__化_程__度_低__，_容__易诱导产生愈伤组_。织 （2）在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ阶段中发生基因选择性表达的是___Ⅰ_、__Ⅱ__、_Ⅲ_______阶段。 （3）为确定品种A的Ⅰ阶段的最适细胞分裂素浓度，参照品种B的激素配比（m1>2．0）， 以0．5 μmol/L为梯度，设计5个浓度水平的实验，细胞分裂素最高浓度应设为
训练5．（2020年山东省高考生物试卷（新高考)·13）两种远缘植物的细胞融合后会导致一方 染色体被排出。若其中一个细胞的染色体在融合前由于某种原因断裂，形成的染色体片段 在细胞融合后可能不会被全部排出，未排出的染色体片段可以整合到另一个细胞的染色体 上而留存在杂种细胞中。依据该原理，将普通小麦与耐盐性强的中间偃麦草进行体细胞杂 交获得了耐盐小麦新品种，过程如下图所示。下列说法错误的是（C ）
具有什么作用?
提示 ADC的抗体在生物
体内与特定目标细胞或组
织相结合,具有导向作用。 药物起治疗作用。
ADC的作用机制示意图
(2)除了细胞毒素,还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物? 提示 化学药物、抗癌药物等。
(3)单克隆抗体诊断试剂盒和ADC在临床应用上各具有什么优势? 提示 单克隆抗体诊断试剂盒具有特异性强、灵敏度高、可大量制备的优 势。ADC在临床上用于治疗癌症或其他疾病，具有疗效高、毒副作用小 的特点。
4.动物体细胞核移植技术和克隆动物 (1)原理: 细胞核的全能性 ,即动物细胞核中具有该种动物全套的遗传 信息。 (2)类型
细胞工程要点复习笔记
细胞融合（cell fusion)，- 指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。
- 自然过程：受精（四）细胞融合的意义可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。
这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。
融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。
体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。
淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。
二细胞融合的基本原理显微镜下细胞融合过程融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图Fusion protein 在细胞融合过程中的作用三细胞融合的常用方法(一) 仙台病毒法仙台病毒诱导细胞融合经四个阶段：①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞膜上。
并使两细胞相互凝聚；②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需要Ca2+和Mg2+，最适PH 为8.0一8.2；③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和A TP；④融合成巨大细胞，仍需A TP 。
病毒促使细胞融合的主要步骤如下：1. 两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近；2. 通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透；3. 两个原生质体的细胞核互相融合，两个细胞融为一体；4. 进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种细胞。
(二) 聚乙二醇（PEG）法用法简单，融合效果稳定。
PEG的作用机理：PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H 键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。
PEG诱导融合的特点：融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。
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细胞工程复习提纲绪论名词：细胞工程：细胞工程是按照一定的设计方案，通过在细胞、亚细胞或组织水平上进行实验操作，获得重构的细胞、组织、器官以及个体，创造优良品种和产品的综合性生物工程。
第1章细胞培养的设施与基本条件1.细胞工程实验室的要求和基本设置（无菌，6方面工作）要求保持严格无菌环境，避免微生物及其他有害因素的影响。
六方面的工作：无菌操作、培养、制备、清洗、消毒灭菌处理和储藏。
2.动植物细胞工程实验室的设置1. 动物细胞工程实验室的设置(1) 无菌操作室无菌操作室是相对密封、防尘、防菌的工作空间。
理想的无菌操作室应划分为更衣间、缓冲间及操作间三部分。
(2) 培养与观察室(3) 制备室：在该区主要进行培养液及有关培养用液体等的制备。
(4) 储藏室(5) 清洗和灭菌室2. 植物细胞工程实验室的设置(1) 无菌操作室(2) 培养室(3) 鉴定室(4) 清洗室(5) 灭菌室(6) 制备室(7) 驯化移植室3.常用设备1. 动物与植物细胞工程实验室通用的仪器设备(1) 超净工作台(2) 倒置显微镜(3) 电热干燥箱(4) 水纯化装置(5) 冰箱(6) 压力蒸汽消毒器(7) 细胞计数板和电子细胞计数仪(8) 过滤除菌装置(9) 离心机(10) 移液管和吸管(11) 离心管(12) 移液器(13) 天平2. 动物细胞工程实验室的常用仪器设备(1) 培养箱(2) 显微操作仪(3) 细胞融合仪(4) 细胞冷冻储存器(5) 培养用器皿(6) 手术器械3. 植物细胞工程实验室的常用仪器设备(1) 光照培养箱(2) 人工气候室(3) 摇床(4) 培养瓶第2章清洗与消毒1.玻璃器皿清洗步骤及要求一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。
清洗后的玻璃器皿要求干净、透明、无油迹，且无任何残留物质。
2.常用的物理灭菌(1) 紫外线消毒紫外线消毒用于空气、操作台表面和不能使用其他方法进行消毒的器皿。
紫外线的直接作用机制是通过破坏微生物的核酸和蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射产生的臭氧杀死微生物。
紫外线可产生臭氧，污染空气，对试剂和培养液都有不良影响，对人皮肤、眼睛都有伤害。
因此，不能开着紫外灯进行实验操作。
(2) 电离辐射消毒主要指使用放射性核素产生的X射线和加速器等发出的辐射进行灭菌消毒，适用于消毒量大和不适于做高压或过滤等培养用品。
电离辐射灭菌时物品不会升温，可直接对密封包装的物品进行灭菌。
但由于电离辐射的诱变作用很强，不适合消毒活的生物材料。
(3) 湿热消毒消毒物品不能装得过满，应保证其内气体的流通，以防止消毒器内气体阻塞而发生危险。
在加热升压之前，先要打开排气阀排放内部的冷空气，然后关闭排气阀，同时检验安全阀是否活动自如。
继后开始升压，当达到所需压力时开始计算消毒时间。
消毒过程中，操作者不能离开工作岗位，要定时检查压力及安全阀，防止发生意外。
(4) 干热消毒法干热消毒法是用电热烤箱将物品加热到160℃以上，并保持90-120min，以杀死细菌和芽孢。
该法主要用于消毒玻璃器皿。
消毒完毕后不可马上将烤箱门打开，以免温度骤降而使玻璃器皿破裂。
干热消毒的优点是消毒后的器皿干燥、易于储存，缺点是热传导慢。
灼烧也是干热消毒灭菌的方法之一。
(5) 过滤除菌过滤除菌是将液体或气体用微孔薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌目的。
此方法大多用于遇热易发生变性而失效的试剂或培养液。
目前，大多数实验室采用微孔滤膜器除菌，使用这种滤器的关键步骤是安装滤膜及无菌过滤过程。
根据实验室条件和过滤体的要求，可选用加压过滤除菌方法和负压过滤除菌方法。
3.常用的化学消毒剂消毒剂主要是75%酒精、甲醛、环氧乙烷、氯已定、戊二醛、碘伏和磺酊、过氧乙酸、乳酸、2%煤酚皂溶液(来苏儿)、1‰新洁尔灭等。
第3章细胞培养的基本方法1.名词：细胞生长曲线：细胞生长曲线是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标，以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标作坐标图。
细胞分裂指数：细胞分裂指数是指分裂期细胞在全部细胞中所占的百分率，用以表示细胞的增殖旺盛程度。
细胞贴壁率：细胞贴壁率又称接种存活率，用于观察贴壁附着生长细胞，主要反映细胞的生存能力和部分底物材料的生物相容性。
活体染色：体外活体染色就是在体外条件下用某种染色剂(即活体染料)对活的组织或细胞进行染色，而不影响活细胞的生命活动的一种方法。
2.无菌操作技术（基本操作、注意事项）在超净工作台上进行无菌操作。
实验前点燃酒精灯，所有操作均应在火焰近处并经过烧灼进行。
金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火。
烧过的器械要冷却后才能使用，否则易使组织和细胞受损。
已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内的培养液烧焦后会产生有害物质，再用时会将其带到培养基中。
开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞。
胶塞、橡皮乳头过火焰时也不能时间过长，以免烧焦产生有毒气体，危害细胞。
进行培养操作时，动作要准确迅速，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。
为便于拿送用品，工作台面上的用品要有合理的布局。
操作时要有条不紊，保持一定顺序性。
组织、细胞及培养板、培养瓶在使用前，不要过早开启而暴露于空气中，已开启者要尽量避免垂直放置以防止细菌落入。
进行培养操作时，要尽量减少手与器皿的接触面。
操作时不要大声讲话或咳嗽，以免喷出的唾沫把细菌等带入工作台面发生污染。
使用超净工作台必须注意以下几点：(1) 超净工作台要安装在清洁无尘的房间内，最好为隔离好的无菌间内。
(2) 新安装的或长期未使用的工作台，工作前必须对工作台和周围环境用真空吸尘器或不产生纤维的工具进行清洁，再采用药物灭菌法或紫外线灭菌法进行灭菌处理。
(3) 每次使用时，应用75%酒精擦洗台面，并提前以30-50min紫外线处理净化工作区内积累的微生物。
在关闭灭菌灯后应启动送风机使之运转数分钟后再进行培养操作。
(4) 净化工作区内不应存放不必要的物品，以保持洁净气流不受干扰。
(5) 必须经常注意工作区上方微压表的指示，定期清洗和更换过滤器。
(6) 每次使用超净工作台后要及时清除工作台面上的物品，并用75%酒精擦洗台面使之始终保持洁净，以方便下次实验或其他人的正常使用。
3.相差显微镜（原理和主要装置）相差显微镜是利用细胞内各结构密度的不同而对光产生折射率各有差异的原理，即光波在折射率大的物体中比在折射率小的物体中前进的距离较短，此距离差异叫光程差，由于光程差引起光的相位变化称为相位差或相差。
使用相差显微镜可使用肉眼不能分辨的相位差变为可分辨的振幅差(即明暗差)，使无色透明的物体在镜下反差显著、影像清晰。
主要装置：①环状光阑②相板③中心望远镜4.污染的途径、检测、预防1. 污染途径(1) 空气：空气是微生物及尘埃颗粒传播的最主要途径，工作时减少空气流动是防止污染的重要环节。
(2) 器材(3) 操作(4) 血清(5) 组织样本不同的污染物对细胞的影响有区别。
(1) 细菌的污染及检测多数情况下，培养物受到细菌污染时，培养液短期内颜色变黄，产生大量酸性物质，出现明显混浊现象。
有时静置的培养瓶液体初看不混，但稍加振荡就有很多混浊物飘起。
在倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，有时在细胞表面和周围有大量细菌存在，细胞生长停止并有中毒表现，毒性大的细菌能很快导致细胞崩解死亡。
用青霉素、链霉素预防细菌污染有效。
(2) 真菌的污染及检测在微生物污染中，以真菌污染最多。
真菌种类繁多，形态各异，但污染后易发现，大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面，肉眼可见；有的散在生长，倒置显微镜下可见细胞之间有纵横交错穿行的丝状、管状及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。
瓶外的污染物需及时用酒精棉球擦洗清除，以防其通过瓶口传入瓶内。
抗真菌制剂对预防和排除真菌污染有效。
(3) 支原体的污染及检测支原体污染后，因它们无致死细胞毒性而可与细胞长期共存，培养基一般不发生混浊，细胞无明显变化，实则细胞受到多方面的潜在影响，如引起细胞变形、影响DNA合成、抑制细胞生长等。
常用的检测方法有相差显微镜检测法、DNA荧光处理法、电镜检测法、低张处理地衣红染色观察、免疫学方法、支原体培养法及PCR法等。
支原体污染的防治有了一定进展，但尚未能彻底杜绝，污染仍时有发生。
(4) 病毒的污染及检测当病毒进入细胞后，可借助于宿主细胞的遗传系统进行复制进而装配成新的病毒颗粒，或整合到宿主细胞的DNA内，从而改变培养细胞的生物学性状，影响细胞的生长或干扰实验结果的准确性。
对病毒进行检测主要有细胞直接观察法、动物接种检查法、电子显微镜检查法、免疫学及PCR法等。
(5) 细胞交叉污染及检测细胞间交叉污染是由于在培养操作过程中各种细胞同时进行培养，而所用器具或液体混杂使用所致。
这种污染没有微生物的存在，但使培养细胞不同种类之间发生混乱，细胞生长特性、形态发生变化。
有些变化较轻微，不易察觉，有些则可能由于污染细胞具有生长优势而导致原培养细胞的生长抑制，最终死亡。
常用观察细胞形态、检查细胞的标记物等方法检查交叉污染的细胞。
3. 污染的预防(1) 培养操作前的准备(2) 培养操作时的注意事项(3) 其他注意事项①及早冻存有价值的培养物，重要细胞系(株)的传代工作应由两人独立进行；②购入的未灭活血清应于56℃水浴灭活30min，以使血清中的补体和支原体灭活；③为避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素；④对新引进的细胞株应加强观察，防止外来的污染源；⑤定期用消毒剂清洁CO2培养箱。
5.污染的排除（抗生素）4. 污染的排除(1) 抗生素的应用细胞培养工作采用抗生素多为预防污染。
各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后使用好。
如果发生微生物污染后再使用抗生素，常难以根除。
有的抗生素对细菌仅有抑制作用，而无杀灭效应。
反复使用抗生素还能使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响。
(2) 加温处理根据支原体对热耐受性差的特点，有人把受污染的细胞置于41℃中作用5-10h，最长可达18h，以杀灭支原体。
由于41℃对培养细胞本身也有很大影响，故处理前，应先进行预试验，确定出最大限度杀伤支原体而对细胞影响较小的最佳处理时间。
(3) 动物体内接种除菌法这是一种适用于在连续传代培养中的肿瘤细胞和杂交瘤细胞中，清除细菌与支原体污染的方法。
把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借助动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后从体内取出细胞再进行培养繁殖。
(4) 巨噬细胞吞噬法从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其他细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养物中混合培养。