动物细胞培养技术研究进展

动物细胞培养技术研究进展

（张云生西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌 712100）

[摘要]:动物细胞培养是生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，可分为原代和传代培养，有贴壁、悬浮和固定化培养等培养方式。细胞生长具有特殊的生物学性质，需要无菌、恒温和充分的营养环境。动物细胞培养技术在拥有广阔的发展空间和光明前景的同时也面临着诸多问题和挑战。

[关键词]:细胞培养；微载体；中空纤维；微囊；生物反应器

1885年，W Roux尝试使组织离体培养,被认为是组织细胞培养技术的萌芽； 1907年Harrison和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法,用于研究离体动物细胞的培养，标志着细胞培养技术(Cell culture technology)的诞生。此后,随着抗生素、培养基、培养装置以及工艺方法的不断改进，动物细胞培养(Animal cell culture)的研究和应用逐步增多和深入，发展至今已成为在生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法。利用细胞培养开展体外试验，成为了阐释生命现象、发病机理和筛选药物的重要手段；利用细胞培养技术结合细胞融合(Cell fusion) 、细胞杂交(Cell hybridization)以及转基因(Transgene)技术进行基因重组、组织构建是遗传和组织工程的重要工具；利用细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物技术产业的重要部分[1]。

1 基本概念[1,

2 ]

细胞培养是指从体内组织取出细胞模拟体内生存环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，使其生长繁殖并维持结构和功能的一种培养技术。从体内取出细胞首次培养即为原代培养( Primary Culture)，这是细胞培养的最初和必经阶段。当原代培养细胞生长到一定时期，受到群体环境限制，就需要转移到另一容器才能继续生长，称为传代或继代培养( Subculture)。根据原代培物性状的一致性与否，传代成功后称为细胞系( Cell line)或细胞株(Cell Strain)。这些细胞一般可顺利传40～50代次，并保持染色体二倍体数量和接触抑制，传至50代左右时则出现生长停滞，大部分衰老死亡，此类称为有限细胞系/株；在细胞传代的过程中，有些因发生遗传突变获得了持久性增殖能力的细胞称为无限细胞系/株。

2 体外培养动物细胞的生物学特性

动物细胞无细胞壁，机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；倍增时间长，生长缓慢，易受微生物污染；对生长环境和培养环境要求苛刻[3]。

2. 1 细胞生命周期性变化[1]

体外培养的细胞从适应环境、旺盛生长到由于自身和环境限制缓慢或停滞生长经历一个周期变化。

1. 潜伏期(Latent phase)

细胞从接种到适应新环境生长繁殖的一段时间，此间细胞胞质回缩，代谢缓慢。

2. 指数生长期(Logarthmic growth phase)指数生长期是细胞活力最好的时期，细胞增殖旺盛。在接种细胞数量适宜的情况下。指数生长期持续3～5 d后，随细胞数量不断增多，生长空间日趋减少,营养环境恶化，呈现接触抑制(Contact inhibition)。恶性细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产物的影响而发生密度抑

制(Density inhibition)。

3. 稳定期( Stagnate phase)

细胞数量达到饱和密度后，细胞与营养液的交换面积减少，代谢产物积累， pH 值下降，细胞停止增殖,进入停滞期。营养环境继续恶化后,细胞受损直至死亡。

2. 2 体内外细胞的差异

细胞在体外培养后，失去了神经体液调节和细胞间相互影响，生活在缺乏动态平衡的环境中，失去原有组织结构和细胞形态，分化特性减弱或不明显，直至发展成恶性细胞[1,2]。

3 细胞培养环境和生长条件

3. 1 无菌无毒环境

无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。在体外培养的细胞，由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染,或者自身代谢物质积累,就可能会导致细胞中毒死亡。因此，在体外培养细胞时，应及时清除细胞代谢产物,以保持细胞生存环境无菌无毒。

3. 2 恒温

要维持培养的细胞旺盛生长，必须有恒定适宜的温度。偏离适当的温度范围，细胞会受到损伤，影响正常代谢甚至死亡。

3. 3 气体环境

气体是哺乳动物细胞培养所必需的条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。氧气参与三羧酸循环供给细胞能量和生长组分；二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞增殖所需成分，并对调节培养基pH值有重要作用。

3. 4 缓冲环境

该环境的作用是维持细胞渗透压，提供缓冲系统，使培养液的酸碱度维持在培养细胞生理范围内，提供细胞正常代谢所需的水分和无机离子等。

3. 5 培养基

培养基既是细胞培养中供给细胞营养和促进增殖的基础物质，也是细胞生长繁殖的直接环境。培养基分为天然培养基和合成培养基。天然培养基从动物体液或组织中分离提取，如血浆、血清、淋巴液、鸡胚浸出液等；合成培养基是根据天然培养基的成分，模拟合成、配制的培养基。它包含细胞生长的无机盐、氨基酸、维生素、糖类等基本物质和一些特殊的添加成分结合适量添加血清，广泛应用于动物细胞培养。

4 细胞的培养方式

4. 1 贴壁培养(Monolayer culture)

贴壁培养主要适用于贴壁依赖性细胞。一般源于实体组织的细胞需要相互依赖，需贴附于不起化学作用的物质(玻璃或塑料等无活性物质)的表面生长、生存和维持，并最终在附着面生长至单层,铺满平面时便会发生接触抑制。

4. 2 悬浮培养( Suspension culture)

悬浮适应细胞、源于循环系统的细胞及肿瘤细胞等非贴壁依赖性细胞无需支撑面，细胞或细胞聚集体悬浮于液体培养基中增殖。悬浮培养是大规模细胞培养的理想方式。

4. 3 固定化培养( Immobilizing culture)