褐化、白化、玻璃化、黄化的现象的解释

do:i 10. 3969 / j. issn. 1673- 2006. 2010. 11. 019

植物组织培养中的常见问题与对策

王桂荣

(宿州职业技术学院, 安徽宿州市234000)

摘要: 探讨了影响植物组织培养的主要因素, 分析了污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等产生的原因, 并提出了解决措施。认为: 污染主要是由灭菌不彻底和环境不洁造成的,

加强外植体和培养基的灭菌, 对培养环境及用具彻底消

毒, 可大大降低污染率。培养时间和培养基的组成影响畸形胚的发生, 缩短培养时间, 调整培养基中激素含量, 可

使畸形胚转化为正常苗。培养基的种类、温度、通气状况等会影响玻璃苗的发生, 选择适当培养基, 降低温度, 增强

光照, 改善通风等可使玻璃化率降低。植物品种、取材部位及环境条件与褐变的发生密切相关, 选择适宜的外植

体, 进行暗处理, 添加抗氧化剂和吸附剂等可有效控制褐变。培养基中铁含量不足, 激素配比不当等会导致黄化,

正确添加培养基的各种成分, 增强光照, 及时转接可减少黄化。

关键词: 组织培养; 污染; 褐化; 畸形胚; 玻璃苗

中图分类号: Q945. 4文献标识码: A文章编号: 1673- 2006( 2010) 11- 0054- 04

收稿日期: 2010- 04- 10

作者简介: 王桂荣( 1972- ), 女, 安徽宿州人, 实验师, 主要

从事植物及植物生理实践教学与实验室管理。

植物组织培养技术广泛应用于植物脱毒快繁、育种、种质保存、获得次生代谢产物、突变诱发、细胞工程和基因工程等方面, 而且在医药、食品工业、能源工业、环境保护各个领域显示出极大的生产潜力,产生了巨大的经济效益和社会效益, 已成为当代生物科学中最有生命力的一门学科。但在植物初代培养和继代培养过程中经常会遇到一些问题, 如污染、畸形胚、玻璃苗、褐变、黄化等, 影响实验结果, 甚至导致实验失败, 给科研和生产造成损失。本文根据近年的研究文献及本人的工作实践, 对这几个问题产生的原因及解决措施进行了论述, 以供参考。

1. 1污染产生的原因

污染是在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌, 导致培养失败。造成污染的原因有多种, 培养环境不清洁, 母株预处理不当, 外植体灭菌不净,培养基受菌污染, 实验所用仪器消毒不彻底, 操作程序不当等都会造成污染。细菌污染的主要特征是培养材料周围出现粘液菌斑或培养基中出现混浊雾状痕迹, 主要由外植体、操作器具、培养基灭菌不严引起。真菌污染的特征是菌斑呈绒毛状、絮状, 有不同颜色的孢子, 多由如操作不慎真菌孢子从瓶口落入造成污染。另外还有内生菌造成的潜伏性污染[ 1] 。

1. 2防止污染的对策

1. 2. 1严格消毒, 规范操作程序接种室、超净工作台、培养室要定期消毒, 培养室相对湿度控制在70% 左右。室内污染源主要是空气中

的真菌和细菌, 可用75% 的酒精室内喷雾,也可用高锰酸钾和甲醛混合熏蒸。接种前用70%的酒精擦洗超净工作台, 并且打开紫外线灯照射30分钟, 保证超净工作台处于无菌状态。严格无菌操作, 接种工具全部消毒, 接种人员自身要全面消毒等。每次操作都要用酒精灯烧烤接种针, 在操作过程中, 尽量不说话, 头部不要伸入操作台内, 快速完成接种过程。

1. 2. 2外植体和培养基的灭菌

在组织培养过程中, 选择不易污染且易表达全能性的外植体是成功建立组织培养体系的决定因素之一, 所取外植体材料为较幼嫩的茎、叶时, 可先将材料用清水冲洗干净, 用吸水纸吸干, 再以70% 的酒精浸泡, 无菌水冲洗后, 用2% ~ 10% 的次氯酸钠浸泡。如李慧等在草莓茎尖组织培养中比较了5种不同灭菌方法: 漂白粉饱和上清液浸泡材料15~ 30分钟, 10% 次氯酸钠浸泡10 ~ 15分钟, 10% ~ 12%过氧化氢浸泡10~ 20分钟, 5% ~ 10% 新洁尔灭溶液浸泡10~ 15分钟, 0. 1% 的升汞浸泡8~ 10分钟。实验结果表明, 前4种灭菌剂安全性较高, 但灭菌时间长, 往往会使接种材料的表面氧化褐变; 升汞杀菌效果较好, 但浸泡时间长会造成材料中毒。因此, 根据外植体材料的不同把握好不同灭菌剂的灭菌时间和使用浓度至关重要。外植体切割时, 把消毒后的外植体分成3份放在不同的无菌培养器皿中防止交叉污染。以茎尖作为外植体时, 在无菌条件下对枝条进行暗培养, 待抽出黄色的新芽时, 再采下芽作为外植体, 可明显减少污染。外植体经流水冲洗后, 在2~ 4的低温下处理1 天左右, 可用0. 3% ~ 0.6% 次氯酸钠或0.

1% 升汞消毒。接种于只含蔗糖的琼脂培养基上培养1周, 使组织培养中的酚类物质渗入培养基中, 取出外植体用0. 1% 漂白粉溶液浸泡10分钟, 转移到合适的培养基上培养, 可大大降低污染率。对于难消毒的材料如种子, 可用0.2% 的升汞消毒3~ 5分钟或用5% ~ 10% 的次氯酸钠浸泡25~ 30分钟。赵永辉[ 2] 等对结缕种子, 先用70%酒精浸泡, 再用5% 次氯酸钠浸泡20分钟, 消毒效果较好。对于有茸毛、表面粗糙不平的材料可先用70% 的酒精浸泡, 或在消毒剂中加几滴表面活性剂吐温80, 吐温80促使灭菌液充分接触材料表面, 以达到充分消毒的目的[ 3] 。针对潜伏性污染,外植体经过消毒后, 放在不含激素和维生素的培养基中, 培养一段时间后取出再消毒。对内源细菌污

染严重的外植体, 可在培养基中加入0. 3% 的丙酸钠等杀菌剂有较好的效果。李颖[ 4] 等的研究证明,继代培养中只有真菌污染, 采用3% 的多菌灵浸泡30分钟可灭菌。任敬民等在台湾青枣的组织培养中, 先用600倍的多菌灵喷洒, 经30秒75% 酒精消毒后, 再用0. 1% 升汞加几滴吐温80 消毒5分钟,既能减少污染又能促进外植体愈伤组织生长[ 5 ] 。对培养基采用微波间隙灭菌法, 微波灭菌具有成本低、效率高、处理后无污染等特点。减少培养基中的有机成分或在培养基中加入适当的青霉素、链霉素等抗生素, 可防止污染。

2畸形胚

2. 1出现畸形胚的原因

体细胞胚胎在早期发育时出现畸形, 形态和生理功能都出现异常, 不能育成苗, 或移栽不能成活的现象叫畸形胚, 如联体胚、子叶畸形胚、

单极胚、多极胚、无极胚、胚轴畸形胚、重新愈伤化胚、玻璃化胚、白化胚等[ 6 ] 。越靠近子叶片, 畸形胚分化率越高,子叶片上的不定胚几乎都是畸形胚。郑泗军等[ 7]认为染色体变异是导致畸形胚形成的原因之一。李克勤等[ 8] 在实验中研究发现, 不同陆地棉品种产生

畸形胚的频率不同, IAA、GA3含量较高的培养基和高温高湿的环境条件是畸形胚产生的原因。张宝红等[ 6] 研究发现随着培养时间的延长, 畸形胚的发生量增加。在MS+ 0. 2 mg /L IAA+ 0. 1mg /L 2, 4- D

+ 0. 1 mg /L KT培养基上, 短期培养的愈伤组织形成的体细胞胚中畸形胚的发生率为34. 4% , 而长期培养的愈伤组织形成的体细胞胚中畸形胚的发生率为93. 1%。

2. 2防控对策

在体胚发育早期, 培养基中加入适当浓度的ABA、NAA、KT, 子叶畸形胚、多极胚和其他畸形较轻的胚状体可在畸形胚的基础上长出正常芽, 逐渐发育成正常苗。当KT 使用浓度为0. 5mg /L时, 最有利于畸形胚萌发转化为正常苗, 转化率可达37.5% [ 8 ] 。增加蔗糖浓度或直接干燥减少水分, 缩短胚性愈伤组织诱导培养时间, 减少种植密度, 选择通风透光条件好的培养器, 都可减少畸形胚的发生。

3玻璃苗

3. 1玻璃苗的发生

植物组织培养中, 出现试管苗含水量高, 嫩梢呈半透明状, 叶片皱缩卷曲, 植株矮小失绿, 叶表无角质层腊质, 组织结构发育畸形的现象, 这时的试管苗称为玻璃苗。玻璃苗生根困难, 移栽后不易成活, 不

能继续培养。玻璃苗多为组培过程中措施不当造成的非遗传生理性失调症状, 进行适当的恢复培养, 多数可恢复正常生长。培养基中离子种类, 比例不适,琼脂浓度低, 培养环境如温度、光照、湿度、pH 值、通气不良等间接影响玻璃苗的发生。周菊华等[ 9] 发现瑞香外植体取材部位不同, 玻璃苗发生频率亦不同, 芽与茎基之间的中段茎易发生玻璃化。李云[ 10]等在珠美海棠试管苗培养中, 发现玻璃苗的产生是光呼吸途径和磷酸戊糖途径被抑制的结果。

3. 2防控对策

选择不易玻璃化的基因型材料及部位作为外植体; 选择适当培养基、糖源及外源激素的种类和浓度, 提高培养基中C a2 + Zn2 + 等离子浓度, 适当提高琼脂用量; 降低培养基的衬质势, 减少培养基中植物材料可获得的水分; 适当提高培养基中蔗糖含量, 降低培养器内部环境的相对温度; 改善培养容器的通风换气条件, 使用透气性好的容器或封口材料如用棉塞封口等都可减少玻璃苗的发生。周菊华等[ 9]

发现, 降低培养温度和相对湿度或用40热击处理, 培养基中增加Fe、P、K、Cu、Mn、Zn等元素, 降低B含量, 可有效防止玻璃苗的发生。黄荣韶等在无籽西瓜离体培养中, 于培养基中添加青霉素60 mg /L和氯化胆碱, 有效减少玻璃苗的发生。昼夜变温,采用强光照, 增加光强可促进光合作用, 有利于玻璃苗的恢复。李竹梅等[ 11] 研究发现采用白炽灯光源,光照强度在2000~ 4000 Lx, 光照时间在12~ 14小时, 温度25左右, 提高培养基中糖和琼脂的浓度,55添加适当的钙离子, 6 - BA 含量小于6 mg /L, IAA0. 5mg /L, 可有效降低西瓜试

管苗玻璃化的发生频率。饶雪琴等[ 12] 发现玻璃化苗随培养代数的增加而增加, 用去离子水配制分化培养基, 并添加0. 3%的活性炭, 玻璃化率大大降低。

4褐变

4. 1褐变发生的原因

影响褐变因素有很多, 因植物品种、基因型、外植体的取材部位及生理状态、材料的年龄和大小、光照、温度等环境条件的影响, 褐变程度差异较大。单宁、色素含量高的木本植物易发生褐变, 像板栗、核桃因单宁含量高, 在初代、继代培养中极易发生褐变而死亡。像块茎鳞茎类、天南星科、松柏科、木兰科、茶科植物很易褐化。蔷薇科、金缕科, 木犀科植物等不易褐化。幼龄材料褐变率较低, 冬春季节褐变较轻, 而夏季褐变较重。温度过高或光照较强会促进酚类物质的氧化, 加速褐变。有些植物如菊的茎段虽然易褐化, 但并不影响愈伤组织或丛生芽的诱导, 可不考虑褐化因素。当褐化严重影响了愈伤组织和芽的诱导时, 就要采取措施抑制褐变。

4. 2控制褐变的对策

选用适宜的外植体、控制培养条件以及选择幼龄材料作为外植体, 褐变较轻。外植体受伤害程度直接影响褐变, 切割时尽可能减小伤口面积, 并缩短切口暴露在空气中的时间。笔者在试验中发现切口长度以8~ 14 mm 褐变较轻, 成活率达85% 。选择合适的消毒剂和消毒方法, 增加琼脂的用量使培养基的硬度增大, 降低了酚类物质的扩散速度, 褐变减少。初期培养要在黑暗和弱光下进行。降低温度,

暗处理母株, 连续转移几次, 可减少外植体发生褐变。陈菲等[ 13] 试验得出重度遮光处理褐变率为

58. 2%, 自然光照为88. 3% , 轻度遮光处理褐变率为79. 6% , 表明对母株预先遮光处理可减轻褐变。毛红俊等[ 14] 在香水白掌离体培养实验结果表明, 叶片在1 /2MS培养基中添加PVP 1 000 mg /L, 5天继代转接1次, 抗褐变效果较好; 叶柄在PVP为1 000mg /L, 琼脂浓度为7 g /L的培养基中, 5天继代转接1次, 可减少褐变的发生。周艳等[ 15 ] 试验表明马缨杜鹃暗培养的最佳时间为10天, 可使褐变发生推迟并减少。在暗培条件下, 培养基中添加1 g /L AC与连续转接措施结合, 褐变率可降到15. 03% 。适当降低培养基的无机盐浓度, 酸性环境( pH 值4. 5~ 5. 0) 不利于褐变的发生。在培养基中添加抗氧化剂和吸附剂, 赵玮[ 16] 发现控制茶树组培褐化的最佳培养基配方是0. 5 倍标准铁盐浓度的MS + N a2S2O3 0. 50 g /L+ AC 0. 50 g /L, 褐化率为40. 5%。王照红等[ 17 ] 研究发现加入赖氨酸、活性炭、抗坏血酸的培养基, 25天时有80%出现褐变并伴有死亡现象, 而加入0. 7g / L聚乙烯吡咯烷酮( PVP K - 90)的培养基褐变率为16% , 对抑制桑树组培苗的褐变有良好效果。马文卿等[ 18 ] 在大花惠兰试管苗培养中研究发现, 培养基中添加1 500 mg /L 活性碳, 抑制褐变效果好。笔者在实验中发现将苹果枝条在低温5下处理2天, 核桃外植体在5下处理1天可减轻褐变。

5黄化

5. 1培养苗出现黄化现象的原因

培养基中矿物质营养不均衡、铁含量不足、激素配比不当、糖不足、长期不转移、培养环境通气不良、pH 值大、光照不足、培养温度不适等, 是整株失绿、全部或部分叶片黄化的主要原因。

5. 2采取对策

正确添加培养基的各种成分, 降低培养温度, 增加光照, 及时转接培养物, 适当调节pH 值, 使用透气的封口膜增加透气性, 减少抗生素类物质的使用。在分化阶段进行适当壮苗。

6结束语

在组培过程中, 污染率较高, 目前采取的措施就是在培养基中加入抗生素或用抑菌剂处理。但抗生素和抑菌剂遇酸碱、加热等易分解而失去活性, 并且工作量大, 成本也高。所以加强组培过程中常见的杂菌防治技术研究很重要, 进一步研究和开发价格较低、性能稳定、杀菌效果好的抑菌剂非常必要。调节激素可使部分畸形胚转化为正常苗, 导致畸形胚产生的其他因素如培养条件的影响, 培养基中的激

素效应还有待于更深入的研究。引起外植体褐变的因素除了外植体自身的原因如基因型、生理、营养状况、取材部位等, 另一方面就是外植体的培养环境。深入了解褐变的发生机制和详细过程, 找到影响褐变的主导因子, 针对引起褐变的不同原因采取抑制褐变的对策。目前试验已证实玻璃苗现象只是一种表型特征, 给予适宜的条件, 可恢复正常生长。玻璃苗的原发机制研究还不够系统深入, 如玻璃化是否

与脱落酸有关, 培养基水势, 渗透失调的生理影响,不同原因形成的玻璃苗最后都导致细胞分化受抑制, 木质素合成受阻等还有待于进一

步探讨。应加强玻璃苗的形成机理、经济有效的防治性措施以及玻璃苗的逆转等研究, 使组培技术日益成熟和完善,

更广泛地被应用。