结核病诊断 T-SPOT 实验
T-SPOT试验操作流程-2017
T-SPOT.TB 实验操作流程样本要求：1、肝素抗凝采血管采集全血样本（无需空腹）2、血量要求：①一般患者5-8ml②免疫力低下患者8-10ml③2岁以下儿童2-3ml3、室温（18-25℃）保存与运输，不得冷冻与冷藏4、近期有输血或做过PET-CT的患者，建议两周后再送检5、运输过程中防止颠簸，避免样本溶血，溶血样本不能进行检测6、送检时间：①无延长试剂（T-Cell Xtend）：4小时内送检，8小时内完成细胞分离②有延长试剂（T-Cell Xtend）：4小时内送检，32小时内完成细胞分离准备工作1、配套试剂无菌确认：1）RPMI-1640 培养基2）AIM-V培养基3）淋巴细胞分离液正常为清澈、透明、无漏液（出现浑浊，有异物，漏液情况的，应停止使用）2、设备准备：1）使用消毒液擦拭生物安全柜并紫外灭菌30min以上2）确认培养箱运行在37℃、5%CO浓度条件，并确保水盘中有足够的水，防止培养过程中干板3）使用消毒液擦拭所需移液器，确保移液器表面及腔体无菌3、耗材准备：1）无菌15ml锥底离心管（3-4支/人份）2）无菌吸管（2-3支/人份）3）无菌加样枪头（10同、100同、1ml若干）4）无菌1.5ml离心管（1-2支/人份）5）无菌50ml离心管（1-2支）（用于实验中分装1640培养基，降低污染风险）6）实验中会用到的其他耗材及工具等4、加延长试剂（T-Cell Xtend （在实验开始前，已超过8小时的样本需加延长试剂）1）按25同/ml的量加入延长试剂（5ml样本需加入125间延长试剂）2）盖上管盖，轻轻颠倒混匀8-10次（充分混匀并避免溶血）3）室温（18-25° C）静置10-25 min后开始实验实验操作流程及注意事项第一天（要求全程在II级生物安全柜中操作）一、PBMCs （外周血单个核细胞）提取1、将全血样本转移至15ml离心管中，加1640培养基稀释至10ml（实验中1640培养基需用无菌50ml离心管分装使用，防污染）2、在另一 15ml离心管中加入3-4ml淋巴细胞分离液3、将稀释好的血液样本缓慢加入到分离液上层（缓慢加入，不要破坏分离液液面）4、使用18℃, 1000g条件离4 22min （建议使用缓慢降速档，以获取更好的分离效果）5、分离后，使用无菌吸管将分离得到的PBMCs层吸至另一无菌15ml离心管中（不能吸到底层的血细胞）二、细胞洗涤：1、将收集得到的PBMCs细胞悬液加1640培养基至10ml,颠倒混匀2、使用18℃，600g条件离4 7min3、弃上清，使用移液器将沉淀细胞吹打混匀，加1640培养基至10ml，颠倒混匀（细胞吹打需使用移液器充分吹打混匀,才能达到细胞洗涤目的）4、使用18℃，350g条件离4 7min5、弃上清（上清液需要尽量弃彻底）6、加入500同的AIM-V培养基，使用移液器充分吹打混匀（实验中AIM-V培养基需用无菌15ml离心管分装使用，防污染）三、细胞计数细胞计数仪计数：吸取小于100 ul的细胞悬液至1.5ml离心管，上机计数，记录“淋巴细胞+单核细胞和值”（如上样量需要大于100 ul,可用1640培养基稀释1倍，再上机计数，计数结果相应乘以2）显微镜计数：1、先加入40同1640培养基至1.5ml离心管底部，再加入10间细胞悬液充分混匀，进行5倍稀释2、取5倍稀释后的细胞悬液10间充池血球计数板，计数四个白细胞计数区域之一（四个区域的任一个）的白细胞数，记录计数结果计数区域示例图四、加样（取相应样本数的板条，编号并标注各抗原孔位置）板条示例图1、加抗原1）所有对应样本的空白对照孔中3）加入50同AIM-V 培养基 2）所有对应样本的抗原A 孔中加入50间抗原A 3）所有对应样本的抗原B 孔中加入50间抗原B4）所有对应样本的阳性质控对照孔中》）加入50间阳性质控品 2、加样（不同的计数方法，参照其对应的加样表） 细胞计数仪计数参照“附件一：细胞计数仪计数，加样表”，在对应编号的板孔中加入相应的细胞悬液 量及AIM-V 培养基的量（既保证每个板孔中有25万个PBMCs ,又保证150间的总体系， 防止培养干板）（加样顺序为N到P,悬空加，防止阳性质控品污染其他板孔）显微镜计数参照“附件二：显微镜计数，加样表”，在对应编号的板孔中加入相应的细胞悬液量及AIM-V培养基的量（既保证每个板孔中有25万个PBMCs,又保证150间的总体系，防止培养干板）（加样顺序为N到P,悬空加，防止阳性质控品污染其他板孔）五、过夜培养：将加样完成的培养板盖好后，放入37℃、5%CO2浓度培养箱中培养16-20h（要求培养箱中有足够的湿度，避免干板，请确保培养箱水盘中有足够的水）第二天（洗板、显色、结果判读）一、配制酶标二抗工作液（须当天新鲜配制）1、取（n+1）X200同的1XPBS至无菌离心管中（n表示样本数）（1XPBS要求：1、不能含有表面活性剂2、PH值严格要求在7.0-7.5之间），以下1XPBS要求相同）2、取（n+1）同酶标二抗原液至上一步的1XPBS中，并充分混匀二、第一次洗板（洗去细胞及非特异结合）：从培养箱取出培养板，弃细胞液，用1XPBS洗板四次每次每孔加入200同的1XPBS,放置30秒，倒弃，使用滤纸拍干三、加酶标二抗孵育：每孔加入50间新鲜配制的酶标二抗工作液，在2-8℃条件下孵育1h。
T-SPOT.TB检验在活动性肺结核诊断中的临床意义
T-SPOT.TB 检验在活动性肺结核诊断中的临床意义【摘要】目的：观察分析活动性肺结核行T-SPOT.TB（结核感染T细胞）检验的临床价值。
方法：选取2020年1月-2020年12月本院收治的110例疑似活动性肺结核患者作为研究对象，入院后均给予PPD结核菌素试验以及T-SPOT.TB检验。
比较不同检验方法的准确度、特异性、灵敏度。
结果：与PPD试验相比，T-SPOT.TB检验准确度、特异度、灵敏度明显更高，结果差异显著（p<0.05）。
结论：相较于PPD试验，T-SPOT.TB检验效能相对更高，能够准确诊断活动性肺结核，且操作便捷，值得推广应用。
【关键词】活动性肺结核；PPD试验；T-SPOT.TB；诊断价值肺结核传染性较强，是因感染结核分枝杆菌所致，是我国重视程度较高的一类慢性传染病，尤其是活动性肺结核，传染性强，给患者身心健康带来了严重影响。
由于活动性肺结核初期症状不典型，易被患者忽略，以致于患者错过最佳治疗时机。
另外，活动性肺结核引起的咯痰以及咳嗽等症状容易与呼吸道感染混淆，所以临床误诊率较高。
若患者咯血，则说明病情已经步入了中晚期，需要临床尽快给予诊断、干预治疗，以改善疾病预后[1]。
痰培养具有一定的诊断效果，但是标本污染问题严重。
有必要探索一种更加可靠高效的检验方法，为临床准确诊断活动性肺结核提供依据。
1.一般资料与方法1.1一般资料本研究纳入110例疑似活动性肺结核患者作为研究对象，纳入时间2020年1月-2020年12月，包括56例男性、54例女性，年龄22-75岁，均龄（48.6±13.5）岁。
均伴有咳痰、高热不退、咳嗽、气喘以及咯血等呼吸道症状；征得当事人同意前提下签署研究同意书；与医学伦理要求相符。
排除精神病史、呼吸道感染、视听障碍或认知异常而不能正常配合的患者。
1.2方法所有入组的观察对象均行PPD试验、T-SPOT.TB检验，其中（1）PPD试验：选取结核菌素稀释液0.2ml，经皮内注入进行皮肤试验；通常注入左前臂掌侧下方1/3处；结束注射操作之后，局部表层便会产生一个皮丘，2-3d之后测量皮丘范围。
T—SPOT.TB检验在活动性肺结核患者中的临床意义
T—SPOT.TB检验在活动性肺结核患者中的临床意义目的通过测定活动性肺结核患者血浆中T-SPOT.TB检验结果，探讨其临床价值。
方法对36例活动性肺结核患者同期进行T-SPOT.TB检验及PPD试验。
结果活动性肺结核患者T-SPOT.TB阳性率为94.4%，高于PPD试验；并且T-SPOT.TB检验的阳性检测率高于PPD试验。
结论T-SPOT.TB检验对活动性肺结核患者诊断具有较高的临床价值，可以达到早期检测结核感染的目的。
[Abstract] Objective To investigate the clinical value of plasma T-SPOT.TB test of patients with active pulmonary tuberculosis. Methods T-SPOT.TB test and PPD test were performed in 36 patients with active pulmonary tuberculosis in the same period. Results The positive rate of T-SPOT.TB in active pulmonary tuberculosis was 94.4%，higher than that of PPD test. The positive detection rate of T-SPOT.TB test was higher than that of PPD test. Conclusion T-SPOT.TB test has a high clinical value in the diagnosis of active pulmonary tuberculosis，and can achieve the goal of early detection tuberculosis.[Key words] Interferon gamma release assay；Test of plasma T-SPOT.TB；Active pulmonary tuberculosis；Early diagnosis结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病。
带你了解结核感染T细胞检测
带你了解结核感染T细胞检测
该检测通过检测受结核分枝杆菌抗原刺激而活化的效应T细胞来诊断结核感染。
该检测适用于所有具有结核潜伏感染风险或怀疑是结核病的人群，无论年龄、性别、种族、治疗还是免疫状况，其诊断结核感染的敏感性为90%-95%，特异性为93%-100%。
对临床诊断或排除结核病具有重要的参考价值。
结果判定:
其中N为本底对照培养管(N)含量值，P为阳性对照培养管(P)含量值，T为测试培养管(T)含量值。
本实验通过测定N.T.P三种培养管培养后血量标本的吸光度并代入相关线性回归方程的出N.T.P的含量值。
如何来看实验结果？
1、患者要想确定自己有没有患有结核感染，要去医院检查身体的T-SPOT.TB的值，要知道结核感染不能只看T细胞来判定，患者也要全面检查，结果如果提示患者体内有结核菌感染，或者是T检查的斑点数高，那就代表患有结核病的几率很高了，当然也不排除只是结核菌潜伏感染的病症。
2、患者检查结果是阳性，要就是小心了，这代表着身体提示着，身体已经出现了结合杆菌感染了，所以才会出现这样的检查结果，不过这个只是检查结果并不全面，结果的准确性有限的。
3、患者医院如果是结核感染T细胞斑点试验，当这个结果呈现结果为阳性的，这就是提示患者可能已经感染了结核感染，但是也不排除肺外结核。
4、必要时患者要进行预防性治疗，也要结合临床症状和其它辅助检查来确定自己的病情，例如x光、结核菌素试验等检测。
发布于 2019-06-28。
结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)简介与临床应用
结核菌的特性和临床检测的现状 又是如何？
1、结核病疫情严重
全球 • 20亿人口感染结核 • 现有活动性结核病患者2000万 • 新增活动性结核病人约900万/年 • 每年200-300万患者死亡
我国
结核病高负担国家之一，患者人数仅次于印 度，居全球第二位
• 约5.5亿人口感染过结核菌 • 现有活动性肺结核患者450万 • 新发患者145万/年 • 死亡人数13万/年
- 胸部的 X-光或 CT 扫 描显示异常
- 肺外结核难以诊断 (特别是儿童)
活动性结核
• 新发TB病例来自潜伏性结核感 染人群
• 潜伏性结核感染（latent TB Infection, LTBI）人群数量巨 大——“定时炸弹”
全面性
目前检测方法是否满足临床需求？
• 细菌学 • 免疫学
灵敏度 性能不稳定
结核感染T细胞检测（T-SPOT.TB）简介 与临床应用
什么是结核病
• 结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染 病。结核菌能侵入全身各个器官，但80% 发生在肺部，常称肺结核。
• 结核病又称为“痨病”和“白色瘟疫”， 是一种古老的传染病。
• 人与人之间呼吸道传播是本病传染的主要 方式。传染源是接触排菌的肺结核患者， 而肺外结核病则不具有传染性。
暴露程度不足，结核杆菌被机体免疫力清除
- 没有症状,结核杆菌仍旧 存在而不能被侦测
- X-光/ CT 扫描显示正常
- 没有抗体应答
- 诊断困难
- 传统的结核感染检测只有 TST（PPD）
机体被感染
受机体免疫力抑制 没有临床症状
终身处于感染状态
潜伏感染
5%
5%
再次激活
有临床症状 具有传染性
结核感染T细胞斑点试验
阴性结果
空白对照
抗原A ESAT-6
抗原B CFP10
阳性对照 （PHA）
阳性结果
一个斑点=一个结核效应淋巴细胞
二 、Pa结rt 12核现 中T-感有 国SP检 结染O测 核T原T手 病理细段 疫不 情胞能 现斑满 状足点临试床需验求优 点
1、T-SPOT的高特异性
结核特异性抗原（ESAT-6、CFP-10）
涂片 镜检
• 耗时长4-8周 • 检出低50% • 肺外结核难 • 易受环境污染
细菌培养
接触史 临床症状 病原/病理
结核 诊断
X射线
抗体检测
• 特异性差 • 误诊肺炎、肺癌 • 肺外结核难
• 假阳/假阴性高； • 不能区分既往感染
和发病病人 • 卡介苗影响 • 2011WHO建议禁用
分子诊断
• 操作复杂技术要求高 • 肺外结核难取样 • 易受外源性DNA污染
一 、Pa现rt 1有现 中检有 国检 结测测 核手手 病段 疫段不 情不能 现满 状能足满临床足需临求 床 需 求
假阴性
免疫力低下或HIV人群，新生儿、老弱人群、药物影响
假阳性
BCG接种人群，其他环境分支杆菌感染，交叉污染
难诊断
肺外结核感染、儿童结核感染、潜伏性结核感染等
医疗事故
无法排筛结核感染，造成生物制剂或移植手术治疗后病患免疫 力下降，引起结核，形成医疗事故
步骤3
结核特异抗原（ESAT-6/CFP 10）刺激结核特异的效 应T淋巴细胞使其分泌γ-干扰素，孵育。
步骤4
效应T淋巴细胞分泌的γ-干扰素与膜板预包 被的抗γ-干扰素抗体结合并固定在细胞周围
洗板，加入酶标二抗，孵育1h
洗板，加入显色液，观察结果
T-SPOT.TB在结核病诊断中的临床意义 (2)
T-SPOT.TB在结核病诊断中的临床意义目的：探讨基于γ-干扰素释放的T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）在结核病诊断中的意义。
方法：首先对2013年1月-12月间在我院住院的肺结核病人30例，结核性胸膜炎30例，结核性脑膜炎9例进行T-SPOT.TB检测，并分别对他们的血清、胸腔积液和脑脊液进行腺苷脱氨酶（ADA）检测，在某医院职工进行年底查体时，采用T-SPOT.TB对他们进行检测，对他们的血清进行ADA检测，在保密个人信息的前提下，调查所有进行T-SPOT试验的职工的健康状况。
结果：肺结核病人30例，T-SPOT.TB阳性30例,ADA阳性25例，结核性胸膜炎30例，T-SPOT.TB阳性30例，ADA阳性27例，结核性脑膜炎9例，T-SPOT.TB阳性9例，ADA阳性5例。
某医院共有420名工作人员查体，做T-SPOT试验的共291人，阳性54人，阳性率为18.6%，阴性237人，经调查及询问本人发现，54人中有3人曾先后患肺结核并治疗，现已治愈停药。
其他51人皆无症状（如：午后低热，盗汗等）、无体征（如：胸部X光片无病变，包括钙化灶、无胸腔积液）、内科、外科检查无淋巴结肿大，无关节肿大、疼痛等，基本排除活动性结核病。
结论：T-SPOT.TB作为结核菌感染检测的最为准确的方法之一，敏感性极高，各种结核病病人都表现阳性，而感染过结核菌未发病的人一般也都表现为实验阳性，由此可见：T-SPOT.TB阳性对结核病的诊断具有强大的支持作用，但存在一定的假阳性，而通过ADA阳性诊断结核病存在一定的假阴性，两者联合，能明显提高阳性率和特异性；但T-SPOT.TB检测阴性，基本可排除结核病（HIV 病人除外）［1］，对结核病的排除具有十分重要的意义。
标签：T-SPOT.TB，结核病，阴性排除TO investigate the Clinical significance of T-SPOT.TB assay in thediagnosis of TuberculosisObjective: To investigate the significance thatT-SPOT.TB assay based on the release of interferongamma in the diagnosis of tuberculosis.Methods :First, Random select 30 Pulmonary tuberculosis cases,30 Tuberculous pleurisy cases and 9Tuberculous meningitis cases inpatient during 2013 Jan. to 2013 Dec. using T-SPOT.TB and ADA to detect them . When one hospital staffs check their bodies, in the case of informed consent, using T-SPOT.TB to detect them .Then survey their health status and pledge myself to a top secret. At the same time using T-SPOT.TB to detect 30 patients that been diagnosed and are receiving treatment for tuberculosis.Results: T-SPOT.TB Positive numbers are:30 cases, 30 cases, 9 cases. ADA Positive numbers are 25 cases, 27 cases, 5 cases, There are 420 hospital staffs that check their bodies this time, andin the experiment of a total of 291 people, There are 54 people was positive, the positive rate was 18.6%, There are 237 people was negative. In fact, there are 3 people in 54 people had been suffered from tuberculosisand have now been cured. The other 51 people had no symptoms (such as: afternoon fever, night sweats), no signs (such as: no lesions after X ray chest, including calcification，no pleural effusion) , surgical, medical examination no lymph node swelling, no joint swelling or pain, Say in another way, the 51 people are ruled out active tuberculosis. At the same time using T-SPOT.TB to detect 30 patients that were suffered from tuberculosis and are receiving treatment, all the 30 cases were positive.Conclusion: T-SPOT.TB is one of the most accurate methods for detecting latent TB infection, it is high sensitivity. People infected with TB are usually manifested positive, Whether or not he has TB disease at that time. T-SPOT.TB test is negative have very important meanings for eliminating TB: T-SPOT.TB test was negative can exclude tuberculosisKey words:T-SPOT.TB，tuberculosis，negative test can exclude the disease在全球公共衛生问题中，慢性传染性疾病结核病的形势是异常严峻和迫切的，我国的结核病疫情更显严重，属全球22个结核病高负担国家之一，结核病的患病人数在全球仅次于印度居第二位。
T-SPOT.TB在结核病诊断中的应用评价的开题报告
T-SPOT.TB在结核病诊断中的应用评价的开题报告
一、研究背景和意义
结核病是一种由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，全球感染者数量
高达20亿人，每年造成约1000万人患病和140万人死亡。
因此，结核
病的早期诊断和治疗对于控制该疾病具有重要意义。
目前，结核病的常
规检测方法为结核菌素皮试（TST），但该方法存在着一定的局限性，如易受其他疫苗干扰、存在交叉反应等。
T-SPOT.TB作为一种基于细胞因
子释放的免疫测定技术，在结核病的诊断中已经得到了广泛应用，但其
在临床上的应用价值尚需进一步评估和探讨。
二、研究目的
本研究的主要目的是评价T-SPOT.TB在结核病的诊断中的应用价值，对其进行性能比较，并探讨其临床应用前景及存在的问题。
三、研究内容和方法
1、研究对象：对近期在我院就诊的疑似结核病患者进行招募，并进行T-SPOT.TB和TST的检测。
2、研究方法：使用T-SPOT.TB和TST的检测结果进行比较和分析，对T-SPOT.TB在结核病诊断中的灵敏度、特异度、准确度、阳性预测值
等指标进行评价，并进行相关性分析。
3、数据处理：使用SPSS或其他统计分析软件对数据进行统计分析。
四、预期结果和意义
通过本次研究的开展和分析，可以更加科学地评价T-SPOT.TB在结
核病诊断中的应用价值，并为探索结核病的更加准确、高效的诊断方法
提供参考和帮助。
同时，该研究结果还可为临床工作提供有力的依据，
改善结核病患者的诊疗质量和治疗效果，提高诊断水平。