梨S12-RNase基因启动子植物表达载体的构建及转基因研究

合集下载

基因沉默的研究及应用实例简介

RNAi研究的一般技术路线
siRNA 的设计
• siRNA（small interfering RNAs，siRNAs）即为能够以同源互补序列的mRNA为靶目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断双链 RNA分子。
一般设计原则：
（1）从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。 GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。（ 2 ）将潜在的序列和相应的基因组数据库进行比较，排除那些和其他编码序列同源的序列。（ 3 ）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计4-5个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
转染细胞
• 将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种： • 1.磷酸钙共沉淀 • 2.电穿孔法 • 3. DEAE-葡聚糖和polybrene • 4.机械法 • 5.阳离子脂质体试剂
为了达到高的转染效率，在转染实验过程中，需要注意以下几点：
• 1.纯化siRNA • 2.避免RNA酶污染 • 3.健康的细胞培养物和严格的操作确保转染的重复性 • 4.避免使用抗生素
RNAi 的原理
RNAi的基本过程
siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成siRNA，消耗能量； RISC（RNA-induced silencing complex）形成：与RNAi辅助蛋白——argonaute家族分子、 RNA依赖性聚合酶结合形成RISC，消耗ATP能量； RISC 活化：siRNA解螺旋成单链，无活性的复合体转变成活性形式；阻止翻译或诱导mRNA降解：在siRNA引导下， RISC识别并切割互补的靶RNA。

rd29A基因植物表达载体的构建及四倍体刺槐再生诱导研究

rd29A基因植物表达载体的构建及四倍体刺槐再生诱导研究不良环境如低温干旱盐渍,是影响农业生产和生态环境的一个非常重要的非生物胁迫因素。

我国是一个水资源紧缺的国家,干旱和半干旱耕地面积占全国总耕地面积的38%;其次,低温冷害是我国南北方农业生产长年发生的灾害;除此之外,我国还有大片的盐渍土壤等待进一步的开发利用。

如何利用这些大面积的土地,提高农作物抗逆性是生物科学的一个重要研究课题。

四倍体刺槐( Robinia pseudoacacia)是荒山造林的先锋树种,在改善环境、平原及山区发展圈养畜牧业以及植树造林等方面都能产生较好生态效益和经济效益。

如能提高抗逆性,对西部大开发建设中退耕还林,改善生态环境,发展圈养畜牧业具有十分重要的意义和广阔的市场前景。

故本文通过四倍体刺槐根、茎、叶建立了一套完整的再生体系,为转基因工程育种提供了可靠的依据。

rd29A基因对干旱、盐碱、寒冷都有抗御功能,因此,本项研究拟进行克隆拟南芥rd29A抗逆基因,构建植物表达载体,为植物抗逆基因转化提供可利用的基因。

转rd29A基因的抗旱,抗盐、耐低温作物新品种的育成必将对提高作物的单位面积产量和扩大种植区域产生积极的推动作用,转rd29A基因的抗非生物逆境林木和草类新品种的育成将为我国的环境保护和美化带来可观的社会和生态效益以及经济效益。

本实验的完成对于植物品种改良具有重要意义,主要从两个方面进行了研究: (1)根据GenBank 中已发表的rd29A 基因的cDNA 序列设计并合成了一对引物,PCR 引物设计时根据后续构建植物表达载体的需要,在上游引物一端加入一个BamHⅠ位点,在下游引物一端加入了Kpnl位点。

通过RT- PCR 的方法从低温处理的拟南芥总RNA中扩增出rd29A基因的全长cDNA 片段。

将其克隆到pMD18-T vector 中。

经测序证明该片段与GenBank 上报道的序列具有100%的同源性。

克隆载体用BamHI 和KpnI 双酶切,获取rd29A基因,将其连接到中间载体pRT101,再以单酶切HindIII 消化,将其目的片断(rd29A 和CaMV35S)与表达载体pCAMBIA3301 在T4 DNA 连接酶的作用下进行连接,构建了由组成型启动子CaMV35S 调控的rd29A 基因的植物表达载体pCAMIADR3301,采用直接转化法将pCAMIADR3301 导入根癌农杆菌菌株LBA4404,为利用rd29A基因改良植物抗逆性奠定了物质基础。

百合AGPase基因RNAi载体构建及遗传转化研究

百合AGPase基因RNAi载体构建及遗传转化研究张进忠;孙嘉曼;李朝生;刘挺燕;范燕萍【期刊名称】《西南农业学报》【年(卷),期】2018(031)006【摘要】[目的]AGPase基因可在百合鳞茎膨大发育过程中影响淀粉的合成代谢,从而调控鳞茎发育,构建干扰AGPase基因RNAi载体并遗传转化进行反向下调作用研究,可为该调控机制的研究提供更多信息.[方法]克隆300 bp的AGPase基因保守序列,利用Gateway技术通过BP反应将该序列插入入门载体pDONR221,进行LR反应将该序列正反向插入干扰载体pJawohl8-RNAi中,经过酶切鉴定所构建RNAi载体的正确性;并通过农杆菌介导法转入百合组培苗中,PCR检测RNAi载体转化农杆菌,荧光定量PCR检测农杆菌转化植株的AGPase相对表达量变化.[结果]成功构建pDONR221-AGPase入门克隆与pJawohl8-RNAi-AGPase表达载体,遗传转化百合愈伤诱导出AGPase表达量下调的转化植株.[结论]采用Gateway技术可方便构建RNAi表达载体,选择的AGPase保守序列能作为干扰片段对百合AGPase自身转录的mRNA进行下调.【总页数】7页(P1097-1103)【作者】张进忠;孙嘉曼;李朝生;刘挺燕;范燕萍【作者单位】华南农业大学林学与风景园林学院,广东广州510642;广西农业科学院生物技术研究所,广西南宁530007;广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室,广西南宁530007;广西农业科学院生物技术研究所,广西南宁530007;广西农业科学院生物技术研究所,广西南宁530007;华南农业大学林学与风景园林学院,广东广州510642【正文语种】中文【中图分类】Q812【相关文献】1.芥菜cry2基因RNAi载体的构建与遗传转化研究 [J], 梁婷;刘毅;蔡应繁;孙全;朱小燕;岳显可;江怀仲;何晓红2.上西早生柿ETR5基因RNAi植物表达载体构建及遗传转化研究 [J], 于丛丛;马俊莲;宋春丽;陈佳3.小麦AGPase基因LSU Ⅱ的克隆及反义表达与RNAi干扰载体的构建 [J], 刘超;康国章;郭天财;岳彩风;沈丙权4.瓜叶菊‘大花’Mlo基因RNAi载体的构建及其遗传转化研究 [J], 王丹;王金刚5.番木瓜β-Gal基因RNAi双T-DNA植物表达载体的构建及其遗传转化的初步研究 [J], 何玮毅;陈晓静;申艳红;卢秉国;潘东明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

RNA干扰技术

RNAi的分子作用机制
1、siRNA引起的基因沉默
miRNA诱导的基因沉默
miRNA是一种广泛存在于真核生物中内源性的、高度保守的、非编码小的RNA。 miRNA主要是通过抑制翻译来实现基因的沉默，成熟的双链miRNA会很快被整合到miRNA介导的沉默复合体（miRISC）中。成熟miRNA结合到与其序列互补的mRNA位点，通过2种依赖于序列互补机制负性调控靶基因的表达。如果miRNA与靶位点序列完全互补，miRNA的结合会引起mRNA的降解；如果miRNA与mRNA不完全互补，则能抑制mRNA的翻译过程。

ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
第三步（倍增阶段）在 RISC 复合物中，以 siRNA 的单链为引物，以 mRNA 为模板，在 RNA 指导的 RNA 聚合酶作用下，合成 mRNA 的互补链，即形成 dsRNA 。 dsRNA 再被Dicer酶裂解成新的siRNA（次级siRNA）。因此，细胞内的siRNA数量大大增加，显著增强了对基因表达的抑制作用。 siRNA 也可转运出细胞，使 RNAi 扩散到整个机体。
获得siRNA产物方法

目前主要有5种方法用于siRNA的制备
(1)化学合成法;(2)体外转录法;
(3)长链dsRNA的RNaseIll体外消化法;
(4)siRNA表达载体法；(5)siRNA表达框架法。

前3种是在体外制备然后导入到细胞中；后两种则
是基于具有合适启动子的载体或转录元件在哺乳动
物或细胞中转录生成siRNA。
RNA干扰技术
张风娇
简介
RNA干扰（RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双
链RNA（dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解，

基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)

RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白线虫：左侧为转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的被抑制，显露出红色。处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。绿色为 tubulin，缺陷型。红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体逆转录病毒载体非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物：外源基因导入生物体表达。基因打靶：外源基因替换内源基因。基因敲除。基因敲入。基因沉默：导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源基因导入细胞，随机整合到受体基因组内，并随细胞分裂而遗传给后代。细胞模型。转基因动物。转基因植物。

马铃薯块茎启动子驱动的淀粉合成酶基因RNAi载体构建及遗传转化

马铃薯块茎启动子驱动的淀粉合成酶基因RNAi载体构建及遗传转化陈国梁;张金文;徐露;严海霞;张向前【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2015(034)011【摘要】以马铃薯gbss、ssⅢ与ssⅡ基因的部分cDNA片段拼接成的融合基因gbs3s2为靶标,构建以马铃薯块茎组织特异性启动子GBSS驱动的RNAi表达载体pART-GF.采用农杆菌介导法对NHD3、NF和NC三个马铃薯品种进行了遗传转化,用PCR技术检测转基因植株,采用双波长法测定其微型薯中直链淀粉与支链淀粉的比值.经抗性筛选及PCR检测初步获得10株阳性植株,其中NC、NF和NHD3分别为2株、3株和5株,其微型薯中直链淀粉/支链淀粉比值明显下降.作者成功构建了马铃薯块茎启动子GBSS驱动的淀粉合成酶基因RNAi三价表达载体,初步获得了转基因马铃薯育种材料.【总页数】5页(P1141-1145)【作者】陈国梁;张金文;徐露;严海霞;张向前【作者单位】延安大学生命科学学院,陕西延安716000;甘肃农业大学农学院,甘肃兰州730070;延安大学生命科学学院,陕西延安716000;延安大学生命科学学院,陕西延安716000;延安大学生命科学学院,陕西延安716000【正文语种】中文【中图分类】Q933【相关文献】1.ubi启动子驱动的花生芪合酶基因表达载体的构建及玉米遗传转化初报 [J], 郭志鸿;王汉宁;陶玲;张金文;白斌;陈正华2.水稻淀粉分支酶SBE3基因RNAi载体构建及愈伤组织转化影响因素 [J], 杨忠良;徐振华;刘海英;刘会;高洪儒;赵北平;黄翠3.马铃薯块茎颗粒结合型淀粉合酶基因的克隆及其RNAi载体的构建 [J], 刘玉汇;王丽;杨宏羽;余斌;李元铭;张俊莲;王蒂4.慈竹木质素合成酶基因4CL RNAi载体构建与烟草转化 [J], 周建英;曹颖;孙霞;陈珂;卢学琴;胡尚连5.荠菜TPD1基因启动子与GUS基因表达载体的构建及拟南芥遗传转化 [J], 何金花; 杨正修; 姜路华; 方磊; 赵燕因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

核盘菌ssmcm1转录因子互作蛋白rna干扰载体的构建与鉴定[毕业作品]

中文题目核盘菌SsMCM1转录因子互作蛋白RNA干扰载体的构建与鉴定英文题目Construction and identification of RNA interference vector of SsMCM1 transcription factor interacting protein in Sclerotinia sclerotiorum目录摘要 (1)Abstract (2)第一章前言 (3)1.1 核盘菌的生物学特性 (3)1.2 核盘菌病害的防治 (3)1.3 RNA干扰技术的历史背景 (4)1.4 RNAi的作用机制 (5)1.5 RNA干扰的诱导方法及载体构建 (6)1.6 RNAi在真菌基因功能研究中的优点和不足 (7)1.7 RNAi 技术在真菌中的应用前景展望 (8)第二章实验材料 (9)2.1 主要材料 (9)2.2 主要试剂 (9)2.3 主要仪器 (9)2.4 主要培养基 (9)第三章实验方法 (10)3.1 目的基因片段的选择和获取 (10)3.2 Ssste12基因RNA干扰载体的构建 (10)3.2.1 pSD-Ssste12干扰载体的构建 (11)3.2.2 pS1-Ssste12干扰载体的构建 (12)第四章Ssste12基因的RNA干扰载体的验证 (13)4.1 pSD-Ssste12干扰载体的验证 (13)4.2 pS1-Ssste12干扰载体的验证 (13)第五章结果 (15)5.1 pSD-Ssste12干扰载体的构建 (15)5.2 pS1-Ssste12干扰载体的构建 (16)结论 (17)致谢 (18)参考文献 (19)摘要核盘菌是一种对作物和蔬菜造成危害的世界性病原真菌,它的宿主范围遍布极其得广泛，能造成包含于至少75个科、278个属内的超过400种植物发生病理反应。

RNA干扰(RNAi)作用是生物体内的一种通过双链RNA在mRNA水平上关闭特异性序列的基因表达或者使其沉默的过程，即RNA序列特异性转录后基因沉默。

番茄HP1和HP2基因RNA共干涉载体的构建及遗传转化

应用与环境生物学报 2009，15 ( 5 ): 591~595Chin J Appl Environ Biol=ISSN 1006-687X2009-10-25DOI: 10.3724/SP.J.1145.2009.00591番茄是一种重要的蔬菜作物，成熟番茄果实主要积累β-胡萝卜素和番茄红素等类胡萝卜素. 在人类所需营养中，类胡萝卜素扮演着重要的角色. β-胡萝卜素是维生素A 的前体[1]，维生素A 的缺乏会导致发生夜盲症，并使皮肤变厚、干燥. 同时，番茄红素和β-胡萝卜素都具有很强的抗氧化活性，不仅可以清除体内的自由基，延缓衰老，而且可以增强机体免疫力[2]. 流行病学、药理实验表明，类胡萝卜素不仅可降低诸多慢性疾病（如冠心病等）的风险率，还具有防癌抗癌的功能[3]. 因此，类胡萝卜素在医药工业、食品、化妆品及饲料业等都有着广泛的用途. 番茄既是人类摄取天然类胡萝卜素最重要的来源，也是类胡萝卜素天然萃取的主要原料，番茄中色素的含量水平是制约其果实营养价值和产业效益的最重要因素. 随着转基因技术的推广，研究人员对番茄类胡萝卜素合成途径中结构基因的遗传操作进行了广泛的尝试[4~6]，但其局限性在于加强或阻断某一关键基因的表达会引起许多负面效应，目标产物的积累也达不到预期的效果.番茄中存在一类单基因的高色素突变体High pigment-1（hp1）和 High pigment-2（hp2），它们分别在1917年和1975年被发现[7]. 在光下生长的hp 突变体与野生型相比，积累更多的花青素，植株矮小，由于过量的叶绿素导致绿色果实呈深绿色[7]. 随后的研究证明，番茄HP1、HP2是色素积累的负调控因子，对HP1或HP2进行RNA 干涉后，转基因番茄果实色素的含量明显升高[8, 9].目前，利用果实特异RNA 干涉技术，将HP1和HP2两个基因同时导入番茄以提高果实色素含量的研究还未见报道. 本实验首先将HP1和HP2两个基因片段连在一起，并构建了番茄HP1和HP2基因RNA 共干涉载体的构建及遗传转化*刘继恺高永峰牛向丽刘永胜**（四川大学生命科学学院生物资源与生态环境教育部重点实验室成都 610064）Construction and Transformation of Co-RNAi Vector of TomatoHP1 and HP2 Genes*LIU Jikai, GAO Yongfeng, NIU Xiangli & LIU Yongsheng **(Key Laboratory of Ministry of Education for Bio-resource and Eco-environment, College of Life Sciences, Sichuan University , Chengdu 610064, China)Abstract Tomato HP1 and HP2 genes are negative regulators of pigment accumulation, and they play an important role in photomorphogenesis and pigmentation regulation. In this study, a RNA interference (RNAi) vector composing of inversely-repeated sequence fragments derived from both tomato HP1 and HP2 was constructed. The CaMV 35S promoter in pBI121 was replaced by fruit-specific promoter TFM7. The construct was introduced into tomato Lysopersicon esculentum Mill. cv. Ailsa Craig by means of Agrobacterium -mediated transformation. The analysis of semi-quantitative RT-PCR revealed a distinct reduction of endogenous HP1 and HP2 expression levels in the RNAi transgenic lines compared to that of wild plants. The chlorophyll content in green fruit of the RNAi repression lines was signi ﬁ cantly elevated, whereas the chlorophyll in their leaves remained unaltered compared with that of wild plants. The results show a new way to modify fruit nutritional quality in tomato through gene engineering. Fig 6, Tab 2, Ref 15Keywords HP1; HP2; RNA interference; fruit-specific promoter; Agrobacterium-mediated transformation; chlorophyll;tomatoCLC Q78 : S641.203.3摘要番茄HP1和HP2是色素积累的负调控因子，在光形态建成和色素积累调控中起着重要作用. 将番茄HP1、HP2基因片段导入到植物表达载体pBI121，用番茄果实特异表达的TMF7基因的启动子替换原有的CaMV 35S 启动子，构建果实特异表达HP1、HP2双基因RNA 共干涉植物表达载体pBI121-TMF7-HP1HP2. 通过根癌农杆菌介导转入番茄子叶，经组织培养成功获得转基因植株. 半定量RT-PCR 分析显示，转基因植株果实内HP1、HP2的表达量均明显低于野生型植株果实. 转基因植株果实叶绿素含量比野生型明显升高，而叶片中的叶绿素含量无明显差异. 该研究结果为采用基因工程的方法改善番茄果实营养品质作出了新的尝试和提出了新的思路. 图6 表2 参15关键词 HP1；HP2；RNA 干涉；果实特异启动子；农杆菌介导转化；叶绿素；番茄CLC Q78 : S641.203.3收稿日期：2008-11-13 接受日期：2009-03-04*国家自然科学基金项目（N o. 90717110），国家高技术研究发展计划（“863”计划，N o. 2007A A 10Z122）和国家杰出青年基金（No. 30825030）资助 S u p p o r t e d b y t h e N a t i o n a l Nat u r al Science Foundation of China (No. 90717110), t h e National High-tech Research and Development Program of China (“863” Program No. 2007AA10Z122), a n d t h e National Science Fund of China for Dis-tinguished Young Scholars (No. 30825030)**通讯作者 Corresponding author (E-mail: liuyongsheng1122@)59215 卷应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 果实特异表达的RNA 干涉载体，以有效避免组成型RNA 干涉的负面影响，将构建好的载体导入番茄，得到了转基因植株. 半定量RT-PCR 分析显示，转基因植株果实内HP1、HP2的表达量明显低于野生型植株果实. 与野生型比较，转基因植株的未成熟果实积累的叶绿素含量明显升高，而叶子中的叶绿素含量没有变化. 本研究为采用基因工程的方法改善番茄果实营养品质奠定了基础.1 材料与方法1.1 材料与试剂1.1.1 番茄材料野生番茄（Lysopersicon esculentum Mill. cv. Ailsa Craig ），来自美国康乃尔大学THOMPSON 植物研究所.1.1.2 菌株、质粒和试剂大肠杆菌（Escheriachia coli ）DH5α、根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）EHA105、果实特异植物表达载体pBI121-TFM7、pSK vector 均由本实验室保存. 限制性内切酶、Taq 酶、反转录酶、T4DNA 连接酶、pMD18-T vector 购自TaKaRa 公司，TRIZOL 购自Invitrogen 公司，反转录试剂盒购自TOYOBO 公司. 琼脂糖凝胶回收试剂盒及小批量质粒提取试剂盒购自Omega 公司. 引物由上海英骏生物技术有限公司合成. 测序由北京华大基因科技股份有限公司完成.1.2 方法1.2.1 HP1、HP2片段扩增及HP1HP2RNAi 载体构建按照番茄H P1基因（G e n B a n k 登录号：AY531660）序列设计引物HP1F ：5’ TCACATTCGTTCAATACCCCT 3’，H P1R ：5’ GTGTCCACAT TCTGTCTG CA A 3’，按照番茄H P2基因（G e n B a n k 登录号：A J 222798）序列设计含有P s t I 和H i n d Ⅲ酶切位点的特异引物，H P 2F ：5’ CTGCAGAATGTTACCGCCAGGCTTTTT 3’，HP2R ：5’AAGCTTCAAGAAAGCACCAATGCTATG 3’. 提取野生番茄叶片总RNA ，通过RT-PCR 分别扩增HP1，HP2基因片段. PCR 反应条件：94 ℃ 5 min ，94 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s ，72 ℃ 40 s ， 30个循环，72 ℃ 10 min. PCR 产物连接于pMD18-T ，对重组克隆进行快提和PCR 鉴定.用Pst I 和Hin d Ⅲ 双酶切连接有HP2片段的重组质粒，将酶切片段插入连有HP1片段的重组pMD18-T 载体上，对重组克隆进行鉴定后测序. 测序结果用DNAMAN （版本5.2.2）软件进行分析，形成HP1HP2融合序列（1 052 bp ，其中HP1，486 bp ；HP2，566 bp ）.根据形成的HP1HP2融合序列，设计带酶切位点的特异引物（表1），以测序后的HP1HP2重组质粒为模板，PCR 扩增得到用于构建RNAi 载体的正、反向片段. PCR 片段经过胶回收分别正、反向插入双元载体pSK ，然后将HP1HP2正反向片段整体酶切，插入果实特异植物表达载体pBI121-TFM7的T-DNA 序列中（图1）.1.2.2 番茄的遗传转化构建好的植物表达载体pBI121-TFM7-HP1HP2转入农杆菌中备用.用10%次氯酸钠浸泡番茄种子10 min ，再用无菌水清洗4~5次，用无菌滤纸吸干种子表面水分后于1/2MS 培养基上培养，25 ℃，暗培养4 d 左右，露白后转置于光照下（光照1 500 lx ，16 h/d ）培养. 在其第一片真叶长出前取下子叶，置于预培养基上培养2 d. 转化法采用叶盘法. 将带有目的基因的农杆菌置于28 ℃的震荡培养箱中过夜培养，取5 mL 菌液置于离心管中，5 000 r/min 室温下离心5 min ，然后去除上清液. 用诱导培养基稀释离心后的农杆菌至D =0.1，将预培养2 d 的子叶浸入稀释后的农杆菌10~15 min ，倒掉菌液，将子叶置于无菌滤纸上，吸干多余菌液后，转到共培养基上培养3 d. 然后转入再生培养基上继代筛选培养，每3周换一次培养基，待不定芽长到3 cm 左右时，切下转移至生根培养基上生根. 等根发表1 用于扩增HP1HP2正、反向片段的寡核苷酸引物Table 1 Sequence of oligonucleotide primers used for ampli ﬁ cation of HP1HP2 fragments引物名称Primer name 引物序列Primer sequence酶切位点Restriction site 扩增片段及在HP1HP2序列的跨度Ampli ﬁ cation fragmentsHP1ZX-F GTCCTCGAGTCTAGAAAGAGCAGACCCGGA Xho I, Xba I 正向片段Forward fragment 900 bp (50~950) HP2ZX-R GAAAAGCTTTTTTTCAACTGAAGGGACTCC Hin d III HP1FX-F TCAGAGCTCAAGAGCAGACCCGGACAT Sac I 反向片段Reverse fragment 900 bp (50~950)HP2FX-RGAAGAATTCTTTTTCAACTGAAGGGACTCCEco R I下划线部分为酶切位点 The underlined indicate the sites of restriction enzymes图1 植物表达载体pBI121-TFM7-HP1HP2构建图Fig. 1 Schematic construction of vector of pBI121-TFM7-HP1HP25935 期刘继恺等：番茄HP1和HP2基因RNA 共干涉载体的构建及遗传转化育好后，移出，温室盆栽.（1）预培养基：MS + 1 mg/L 6BA + 0.04 mg/L IAA. （2）诱导培养基（100 mL ）：5 mL AB 盐 + 2 mL MES 缓冲剂 + 2 mL 磷酸钠盐缓冲剂 + 91 mL 1%葡萄糖. （3）共培养基：MS + 0.2 mg/L KH 2PO 4 + 0.1 mg/L Kinetin + 0.2 mg/L 2，4-D + 15 mg/L 乙酰丁香酮. （4）再生培养基：MS + 500 mg/L 羧卞青霉素钠 + 50 mg/L 硫酸卡那霉素 + 2 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L IAA. （5）生根培养基：MS + 500 mg/L 羧卞青霉素钠 + 2 mg/L IAA. 以上各培养基的pH 值均为6.0.1.2.3 阳性植株鉴定用C TA B 法[10]从转基因植株中提取基因组D N A. 以提取的基因组D N A 为模板，根据p B I121载体筛选标记基因新霉素磷酸转移酶Ⅱ（N P T Ⅱ，Gen Ba n k 登录号：A F485783）序列，设计引物N PT Ⅱ-F: 5’ TCTCATGCTGGAGTTCTTCGC 3’, NPT Ⅱ-R: 5’ GTCACCGACTTGAGCCATTTG 3’，对NPT Ⅱ基因片段进行扩增. 反应条件为94 ℃ 5 min ，94 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s ，72℃ 40 s ，30个循环，72 ℃ 5 min.参照王芋华等鉴定转基因植株的方法[11]，根据形成的HP1HP2序列，用扩增HP1HP2正向片段的引物HP1ZX-F 和HP2ZX-R 对HP1HP2正向片段进行扩增. 反应条件为94 ℃ 5 min ，94 ℃ 30 s ，58 ℃ 30 s ，72℃ 1 min ，30个循环，72 ℃ 5 min.1.2.4 半定量RT-PCR 分析提取野生型和转基因植株绿色果实的总RNA ，反转录合成第一条cDNA. 以番茄UBI3（Gen Ba n k 登录号：X58253）为内参基因，其PCR 扩增引物为UBI3-F ：5’ AGAAGAAGACCTACACCAAGCC 3’, UBI3-R ：5’ TCCCAAGGGTTGTCACATACATC 3’；HP1基因引物HP1F ：5’ TCACATTCGTTCAATACCCCT 3’， HP1R ：5’ GTGTCCACATTCTGTCTGCAA 3’；按照番茄HP2基因（GenBank 登录号：AJ222798）序列设计引物HP2BDL-F ：5’ AGTTTTTGGACCGACATCACCT 3’， HP2BDL-R ：5’ CTTCTTAGTTCGCCCATCTGTG 3’. PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，从而分析HP1、HP2在野生型和转基因植株果实中的表达情况.1.2.5 叶绿素含量的测定取田间栽培野生型和转基因番茄植株绿色果实的果皮和植株叶片0.2~0.5 g ，加入液氮后充分研磨，用1 mL 80%的丙酮充分萃取，萃取液离心后用分光光度计检测，读取645 nm 和663 nm 下的光吸收值A 645 nm 和A 663 nm . 按照MacKinney 常数计算出叶绿素a 和b 的含量：Chlorophyll a = 12.7A 663 nm －2.69A 645 nm 和chlorophyll b =22.9A 645 nm －4.48A 663 nm ，采用数据学软件SPSS12进行统计学分析.2 结果与分析2.1 pBI121-TFM7-HP1HP2RNAi 重组质粒的鉴定由图1所示进行酶切鉴定，用Xho I 和Pst I 双酶切pMD18-T-HP1HP2（图2 泳道2），能够得到HP1的436 bp 的片段. 用Xho I 和Hin d III 双酶切鉴定pMD18-T-HP1HP2（图2泳道4），能够得到HP1+HP2的900 bp 的片段. 用Xba I 和Sac I 双酶切连有正反向片段的pSK-HP1HP2 RNAi （图2泳道8），将酶切下的需要克隆的正反向片段（2 000 bp 左右）插入表达载体pBI121-TFM7，通过Xba I 和Sac I 双酶切鉴定pBI121-TFM7-HP1HP2RNAi ，能够得到2 000左右的片段，证明正反向片段已经连入表达载体（图2 泳道10）.2.2 转基因植株鉴定组织培养后，获得转基因植株. 提取获得的抗性植株的总DNA ，利用植物表达质粒pBI121携带的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPTII ）基因引物验证阳性植株，预期扩增长度应为857 bp. 结果表明，对照植株未能扩增出857 bp 的条带，而抗性植株扩增出857 bp 的条带，说明NPTII 基因已整合于受体植株核染色体组中（图3）.再以引物HP1ZX-F 和HP2ZX-R 扩增，预期扩增长度应为图2 pBI121-TFM7-HP1HP2RNAi 载体酶切鉴定图Fig. 2 Restriction analysis of pBI121-TFM7-HP1HP2RNAiM ：DL2000；1：未酶切pMD18-T-HP1HP2；2：X ho I + Pst I 双酶切pMD18-T- HP1HP2；3：Pst I + Hin d III 双酶切pMD18-T- HP1HP2；4：Xho I + Hin d III 双酶切pMD18-T- HP1HP2；5：未酶切pSK- HP1HP2 RNAi ；6：Xho I + Hin d III 双酶切pSK- HP1HP2 RNAi ；7：Eco R I + Sac I 双酶切pSK- HP1HP2 RNAi ；8：Xba I + Sac I 双酶切pSK- HP1HP2 RNAi ；9：未酶切pBI121-TFM7- HP1HP2RNAi ；10：Xba I + Sac I 双酶切pBI121-TFM7- HP1HP2RNAiM: DL2000; 1: Non-digestive pMD18-T-HP1HP2; 2: pMD18-T-HP1HP2 digested by Xho I + Pst I; 3: pMD18-T- HP1HP2 digested by Pst I + Hin d III; 4: pMD18-T-HP1HP2 digested by Xho I + Hin d III; 5: Non-digestive pSK- HP1HP2 RNAi; 6: pSK-HP1HP2RNAi digested by Xho I + Hin d III; 7: pSK- HP1HP2 RNAi digested by EcoR I + Sac I; 8: pSK-HP1HP2 RNAi digested by Xba I + Sac I; 9: Non-digestive pBI121-TFM7- HP1HP2RNAi; 10: pBI121-TFM7-HP1HP2RNAi digested by Xba I + Sac I图3 NPTII 基因PCR 检测Fig. 3 PCR analysis for NPTII geneM ：DL2000；P ：pBI121质粒作为阳性对照；C ：未转化植株作为阴性对照；1~3：转基因植株. 下同M: DL2000; P: pBI121 as positive control; C: Non-transgenic plant as negative control; 1~3: Transgenic plants. The same below59415 卷应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 900 bp ，如图4所示，对照植株未能扩增出900 bp 的条带，而抗性植株扩增出900 bp 的条带，说明HP1HP2基因的RNA 干涉片段已整合于受体植株核染色体组中，可以初步确定这些抗性植株为转基因植株.2.3 半定量RT-PCR 分析HP1、HP2的表达情况利用半定量RT-PCR 的方法，分析转基因植株果实中被干涉基因的表达水平. 提取野生型和3株独立的转基因番茄的绿色果实中的RNA ，以此为模板进行半定量RT-PCR 分析. 结果如图5所示，转基因植株果实中HP1、HP2基因的表达水平均显著下降. 说明转入pBI121-TMF7-HP1HP2共干涉植物表达载体后，番茄果实中HP1、HP2基因起到了共干涉的效果.2.4 叶绿素含量的测定孟凡娟等对番茄果实色素含量和表面颜色相关性进行了研究，结果显示，番茄果实内总叶绿素、叶绿素a 、叶绿素b 、类胡萝卜素与果实表面颜色呈正相关[12]. 采用分光光度计法测定叶绿素含量，测定方法简单易行，所以本实验对野生型和转基因植株的绿色果实进行了叶绿素测定.由图6可见，HP1HP2RNAi 转基因植株果实的颜色比野生型植株果实的要深. 利用1.2.5介绍的方法，分析了野生型和转基因植株的绿色果实的叶绿素含量，每个植株取样数N =10. 从表2可见，HP1HP2基因共干涉可以提高果实的叶绿素的含量近一倍. 对野生型和转基因植株的叶片进行叶绿素含量的测定，每个植株取样数N =10. 从表2可见，与野生型植株叶片相比，果实特异表达转基因植株叶片中叶绿素含量并无明显改变.3 结论与讨论RNA 干涉是一种双链RNA 诱导的转录后基因沉默现象，存在于多种生物体内. 由于RNAi 的高度特异性和高效性，RNA 干涉作为基因功能研究的新方法被广泛应用于动植物研究的各个领域[13]. 通常，单个基因的RNA 干涉载体是由一个植物启动子和终止子以及两者之间插入的目的基因的正反向重复序列组成的. 本研究将HP1+HP2两个基因的片段（900 bp ，其中HP1 436 bp HP2 464 bp ）分别正向、反向插入一个包含内含子的克隆载体pSK [14]，并进一步构建植物表达载体（图1），由此表达出的RNA 分子会形成具有双链RNA 的发卡结构，双链RNA 被DICER 酶识别切割成siRNA ，作为RNA 干涉的启动信号. 本研究分别对转基因植株中的新霉素磷酸转移酶Ⅱ（NPTII ）基因以及HP1HP2基因的RNA 干涉片段进行PCR 扩增，都能够扩增出预期大小的条带，初步确定这些抗性植株为转基因植株. 通过半定量RT-PCR 分析HP1和HP2基因的表达水平，结果显示，与野生型相比，转基因植株果实中HP1、HP2基因的表达水平均显著下降，达到了RNA 共干涉的效果.由于HP1和HP2在植株生长发育过程中起着很重要的作用，所以组成型干涉番茄HP1或HP2基因时，植株发育将会受到影响[8, 9]. 利用果实特异型启动子结合RNA 干涉的方法，能避免由于目标基因表达量降低而对植株正常生长发育所造成的不良影响，从而能特异地对果实进行基因工程操作. 本实验将植物表达载体pBI121原有的CaMV 35S 启动子替换为番茄果实特异表达TMF7启动子[15]，构建HP1HP2双基因RNA 干涉植物表达载体（pBI121-TMF7-HP1HP2）. 在果实特异启动子TMF7的驱动下，转基因番茄植株与野生型相比，植株发育良好，其绿色果实的叶绿素含量明显升高，而叶片中的叶绿素含量无明显差异. 因此，本实验番茄HP1和HP2 基因果实特异RNA 共干涉载体的构建以及转基因番茄的获得，为改善番茄果实营养品质作出了新的尝试和提出了新的思路.References1Liu YS, Roof S, Ye ZB, Barry C, Tuinen AV, Vrebalov J, Bowler C, Giovannoni J. Manipulation of light signal transduction as a means of modifying fruit nutritional quality in tomato. Proc Natl Acad Sci USA ,2004, 101: 9897~99022Hwang ES, Bowen PE. Can the consumption of tomatoes or lycopene图4 HP1HP2 基因RNA 干涉片段PCR 检测Fig. 4 PCR analysis for the RNAi fragment of HP1HP2 gene图5 HP1和HP2表达水平的半定量分析Fig. 5 Semi-quantitative RT-PCR analysis of the expression levels of HP1and HP2图6 果实特异型RNAi 干涉HP1+HP2基因的植株的果实表型Fig. 6 Fruit phenotypes of fruit-speci ﬁ c HP1+HP2 RNAi transgenictomatoes表2 转基因和野生番茄果实、叶片中叶绿素含量Table 2 Chlorophyll contents in matured green fruits and leavesof transgenic and wild plants株系Plant 果实叶绿素含量Chlorophyll content in fruit 叶片叶绿素含量Chlorophyll content in leafWild 43.679±5.5011512.559±112.233HP1HP2-178.263±9.511*1579.397±64.376HP1HP2-270.996±7.649*1534.007±77.882HP1HP2-363.361±7.978*1566.585±75.101*与野生型相比有显著差异（P ＜0.01） *Represents signi ﬁ cant difference compared with wild plant (P ＜0.01)595 5 期刘继恺等：番茄HP1和HP2基因RNA共干涉载体的构建及遗传转化reduce cancer risk? Integr Cancer Ther, 2002, 1: 121~1323 Giovannucci E, Ascherio A, Rimm EB, Stampfer MJ, Colditz GA,Willett WC. Intake of carotenoids and retino in relation to risk of prostate cancer. J Natl Cancer Inst, 1995, 87: 1767~17764 Ronen G, Carmel-Goren L, Zamir D, Hirschberg J. An alternativepathway to β-carotene formation in plant chromoplasts discovered by map-based cloning of Beta and old-gold color mutations in tomato. Proc Natl Acad Sci USA, 2000, 97: 11102~111075 Romer S, Fraser PD, Kiano JW, Shipton CA, Misawa N, Schuch W,Bramley PM. Elevation of the provitamin A content of transgenic tomato plants. Nat Biotechnol, 2000, 18: 666~6696 Rosati C, Aquilani R, Dharmapuri S, Pallara P, Marusic C, TavazzaR, Bouvier F, Camara B, Giuliano G. Metabolic engineering of beta-carotene and lycopene content in tomato fruit. Plant J, 2000, 24: 413~419 7 Mustilli AC, Fenzi F, Ciliento R, Alfano F, Bowler C. Phenotype of thetomato high pigment-2 mutant is caused by a mutation in the tomato homolog of DEETIOLATED1. Plant Cell, 1999, 11: 145~1578 Davuluri GR, Tuinen AV, Fraser PD, Manfredonia A, Newman R,Buigess D, Brummell DA, King SR, Palys J, Uhlig J, Bramley PM, Pennings HMJ, Bowler C. Fruit-specific RNAi-mediated suppression of DET1 enhances carotenoid and flavonoid content in tomatoes. Nat Biotechnol, 2005, 23: 890~8959 Wang SH, Liu JK, Feng YY, Niu XL, Giovannoni J, Liu YS. Alteredplastid levels and potential for improved fruit nutrient content by downregulation of the tomato DDB1-interacting protein CUL4. Plant J, 2008, 55: 89~10310 Porebski S, Bailey LG, Bemard R. Modification of CTAB DNAextraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphend components. Plant Mol Rep, 1997, 15: 8~1511 Wang YH (王芋华), Mao SL (毛双林), Li HJ (李浩杰), Wang SQ(王世全), Luo K (罗科), Li P (李平). Introduction of bacterial blight resisteance gene Xa21 and molecular detection in transgenic rice. Chin J Appl Environ Biol (应用与环境生物学报), 2001, 7: 228~23112 Meng FJ (孟凡娟), Xu XY (许向阳), Li JF (李景富). Study oncorrelation of the tomato fruit’s pigment content and surface colour. J Dongbei Agric Univ (东北农业大学学报), 2006, 37: 459~46213 Kusaba M. RNA interference in crop plants. Curr Opin Biotech, 2004,15: 139~14314 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG, WaterhousePM. Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature, 2000, 407: 319~32015 Santino CG, Stanford GL, Conner TW. Developmental and transgenicanalysis of two tomato fruit enhanced genes. Plant Mol Biol, 1997, 33: 405~416。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

第３Ｏ卷第８期　２０１０年８月　中南林业科技大学学报　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｖ０１．３Ｏ　

Ａｕｇ．　Ｎｏ．８　

２０ｌ０　

梨Ｓ　２一ＲＮａ　ｓｅ基因启动子植物表达载体的　构建及转基因研究　

刘学英　，乌云塔娜　（中南林业科技大学ａ．经济林育种与栽培国家林业局重点实验室；ｂ．林学院，湖南长沙４１００Ｏ４）　

摘要：　为了检测ｓ　２－ＲＮａｓｅ启动子的表达特性，以ｐＢＩ１０１．２为基础，构建了砂梨Ｓ　ｚ—ＲＮａｓｅ基因启动子５’端　系列缺失植物表达载体ＰＳ１２一（Ｏ～５）一ＧＵＳ－ｐＢｌｌ０１．２，并通过农杆菌介导的Ｆｌｏｒａｌ　Ｄｉｐ法转化哥伦比亚野生型拟　南芥。卡那霉素和ＰＣＲ鉴定表明：ＧＵＳ基因已整合到转基因植株的基因组中，为下一步进行启动子功能的鉴定　奠定了基础。　关键词：生物科学与技术；梨属；中国梨；梨Ｓ　。－ＲＮａｓｅ基因；启动子；植物表达载体；转基因研究　中图分类号：　Ｑ７８６；￥６６１．１　文献标志码：　Ａ　文章编号：　１６７３—９２３Ｘ（２０１０）０８－－００１１－－０７　

Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ￥１　２－ＲＮａｓｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｐｅａｒ　（Ｐｙｒｕｓ　ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）ａｎｄ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　

ＬＩＵ　Ｘｕｅ－ｙｉｎｇ￣，ＷＵＹＵＮ　Ｔａ—ｎａａ＇　（ａ．Ｋｅｙ　Ｌａｂ　ｏｆ　Ｎｏｎ－ｗｏｏｄ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｍｉｎｉｓｔｒｙ；　ｂ．Ｓｃｈｏｏｌ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００４，Ｈｕｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）　

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｔｙｌｅ　ｏｆ　Ｓ１２　ＲＮａｓｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ，ｆｕｌｌ　ｌｅｎｇｔｈ　ａｎｄ　ａ　ｓｅｒｉｅｓ　ｏｆ　５’一ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ—ＧＵＳ　ｆｕｓｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ　ａｎｄ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ｓｔｒａｉｎ　ＧＶ３１０１　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｗｅｒｅ　ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ　ｉｎｔｏ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　ｐｌａｎｔｓ（ｅｃｏｔｙｐｅ　Ｃｏｌｕｍｂｉａ　Ｏ）ｂｙ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｆｌｏｒａｌ　Ｄｉｐ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ．Ａ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ　ｗａｓ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　０．５×ＭＳ　ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　５０　ｐｔｇ／ｍＬ　Ｋａｎａｍｙｃｉｎ　ａｎｄ　ＰＣＲ．ａｎｄ　ｉｔ　ｉｓ　ｆｏｕｎｄｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＧＵＳ　ｇｅｎｅ　ｈａｄ　ｂｅｅｎ　ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ，ａｎｄ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｈａｓ　ｌａｉｄ　ａ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｐｙｒｕｓ；Ｐｙｒｕｓ　ｐｙｒｉｆｏｌｉａ；Ｓ１２－ＲＮａｓｅ；ｐｒｏｍｏｔｅｒ；ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ；ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｓｔｕｄｙ　

我国是梨属植物种质资源起源中心之一，境内　蕴藏有丰富的梨属植物资源Ⅲ。梨Ｓ－ＲＮａｓｅ基因　包含Ｓ－ＲＮａｓｅ基因和Ｆ－ｂｏｘ基因，其中Ｓ－ＲＮａｓｅ　基因在雌蕊中特异表达，控制雌蕊自交不亲和性状，　

由此推测梨＆ＲＮａｓｅ启动子是雌蕊特异表达启动　子；因此克隆和研究梨Ｓ－ＲＮａｓｅ基因雌蕊特异表达　启动子并构建植物表达载体，进行转基因研究具有　非常重大的意义。雌蕊特异表达启动子启动某些外　

收稿日期：２０１０　０５—０８　基金项目：湖南省科技计划项目及湖南省教育厅科学研究项目　作者简介：刘学英（１９８１一），女，硕士研究生，主要从事果树分子遗传育种研究；Ｅ—ｍａｉｌ：ｄｕｏｄｕｏ１９７９－－１９８１＠１６３．ｃｏｍ　通讯作者：乌云塔娜（１９７５－－），女，副教授，博士，硕士研究生导师，主要从事经济林育种与栽培的研究；Ｅ　ｍａｉｌ：ｔａｎａｔａｎａ＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ　１２　刘学英，等：梨￥１２一ＲＮａｓｅ基因启动子植物表达载体的构建及转基因研究　第８期　源毒素基因在雌蕊中特异高效表达，可以创造雌性　不育的园林绿化新品种，为园林绿化树木育种提供　新途径。　

１材料和方法　１．１实验材料　研究用大肠杆菌ＤＨ５ａ为本室保存；２×Ｔａｑ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ、普通琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒均　购自北京天根生物有限公司，ｐＭＤ１８一Ｔ试剂盒购　自ＴａＫａＲａ（３ｖ连）生物技术公司；各种限制性内切　酶：Ｔ４　ＤＮＡ连接酶购自ｆｅｒｍｅｎｔｓ公司，ＬＢ培养　基、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物和卡那霉素均购　自ＢＢＩ公司；０．５×ＭＳ培养基，乙醇，ＫＯＨ，Ｂｌｅａｃｈ　消毒液，蔗糖，Ｇａｍｂｏｒｇ　Ｓ　Ｖｉｔａｍｉｎｓ，表面活性剂　Ｓｉｌｗｅｔ　Ｌ厂７７，６－ＢＡＰ，卡那霉素，庆大霉素；其它生化　试剂和常规试剂均为超纯或分析纯。　植物材料为哥伦比亚野生型拟南芥。选取野　生型拟南芥种子，消毒春化后种植于花盆内，置于　２２℃～２５℃光照下使其萌发生长，待植株生长到初　果期（即花絮基部的角果刚形成时），选取健壮植株　作为转基因材料。　１．２实验方法　１．２．１梨５１　－／￣ａｓｅ基因启动子的ＴＡＩＩ　一ＰＣＲ克隆　梨Ｓ　－ＲＮａｓｅ基因启动子的ＴＡＩＬ－ＰＣＲ克隆　参见中国梨Ｓ－ＲＮａｓｅ基因启动子的ＴＡＩＬ－ＰＣＲ克　隆及功能预测＿２］。　１．２．２砂梨Ｓ　一ＲＮａｓｅ基因启动子５’端系列缺失　植物表达载体的构建　１．２．２．１系列缺失引物的设计　根据砂梨Ｓ　一ＲＮａｓｅ基因５’端启动子序列的　测序及元件预测结果，利用Ｐｒｉｍｅｒ　５．０软件设计　ＰＣＲ引物，各引物序列见表１。引物上酶切位点的　设计原则是：砂梨Ｓ　。－ＲＮａｓｅ基因启动子序列中没　有的酶切位点并便于与植物表达载体ｐＢＩ１０１．２的　连接。在正向引物的５’端设计了Ｓａｌ　Ｉ酶切位点，　反向引物的５’端设计了Ｘｂａ　Ｉ酶切位点。引物设　计片段特征见图１。　

表１砂梨Ｓ　ｚ－ＲＮａｓｅ基因启动子缺失ＰＣＲ引物　Ｔａｂｌｅ　１　ＰＣＲ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｏｆ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ　ｐｅａｒ￥１　ｚ－ＲＮａｓｅ　ｇｅｎｅ　

１．２．２．２植物表达载体￥１２一ｐｒｏ－（０～５）－ＧＵＳ－　ｐＢｌｌ０１．２的构建　砂梨Ｓ　－ＲＮａｓｅ基因启动子缺失片段经ＰＣＲ　扩增，ＰＣＲ产物的回收、连接克隆、鉴定后，进行重　组质粒的提取；重组质粒和植物表达载体ｐＢｌｌ０１．２　经ＳａｌＩ／ＸｂａＩ双酶切，分别回收Ｓ１２－ＲＮａｓｅ基因启　动子缺失片段与植物表达载体ｐＢｌｌ０１．２大片段，经　Ｔ４　ＤＮＡ连接酶连接后转化ＤＨ５ａ并阳性克隆鉴　定后，送到金思特科技南京有限公司测序。　１．２．３农杆菌介导的转基因研究　１．２．３．１拟南芥植株的转化　利用电击法将植物表达载体￥１２一ｐｒｏ＇（０～５）一　ＧＵＳ－ｐＢｌｌ０１．２转入到ＧＶ３１０１农杆菌中，参照　Ｃｌｏｕｇｈ的Ｆｌｏｒａｌ　Ｄｉｐ法ｌ３］将带有重组质粒￥１２－　ｐｒｏ（０－－５）一ＧＵＳ－ｐＢｌｌ０１．２的农杆菌转化哥伦比亚　野生型拟南芥。　１．２．３．２拟南芥转基因植株的筛选　卡那霉素筛选参考拟南芥实验手册［＝４　；并提取　Ｔ１代卡那霉素抗性植物ＤＮＡ，按文献［５］的方法，　用位于ｐＢＩ１０１．２载体多克隆位点两侧的ＣＦ１（５一　ＧＣＧＧＡＴＡＡＣＡＡＴＴＴＣＡＣＡＣＡＧＧ一３）和ＣＲｌ（５一　ＧＧＡＣＧＴＡＡＣＡＴＡＡＧＧＧＡＣＴＧＡ（、＿３）为引物　ＰＣＲ方法检测阳性转基因拟南芥植株。　第３Ｏ卷　中南林业科技大学学报　１３　而　缸。　ｌ　ＰｐＳ１＿＋２Ｆｒｏ－￣　一　印豇　５　印ｓ｜，枷６－．ＲＹ　Ｏ　ｊ　Ｇ．ｍ。　Ｉ皂Ｊ姬答元件糨关顺式作用元件　Ｂ。ｘ４．光反应相关元件　ｓｐｌ・光应答作用　◇Ｇ土相　ｆ，光应答元件的一部分　巨羽０２－ｓｉｔｅ．玉米蛋白新陈代谢调节顺式作用元件▲１．ｂ　．光应答元件的一部分●Ｇ＾ｅ－ｍ０ｆｉｆ￣光应答元件＿戚　Ｉ了ｃ＾　蜘锄　，水杨酸应笞相关作用元件Ｉ］　ｉｅＩ＾应昝竞件　●Ｐ　．赤霉索应蓍元件■ｍ　Ｈ．１ｉｋＥ序列　＿∞　，光应答相关Ｊ瞬式作用元件　＿Ｂ　ｗ１．寞茁诱导作用晃件口Ｃ￣Ｎ４－Ｘ【ｏ　，　■Ｔｎ＾　■转景起始位．占“Ｔ　雌麓特异衷达元件一起蛄窨碣子ｍ　

．￣，．￣１２ｐｒｏ－Ｓ　ｐｐｓｌ　－４４　Ｐｐｓｌ却¨３　ｓｉ３Ｐ　ｏ　ｌ￣Ｓｌ２ｐ．ｒｏ－１　Ｐｐ￥］２ｐｅｏ－Ｏ　图１砂梨Ｓ　ｚ－ＲＮａｓｅ基因启动子顺式调控元件以及５’端缺失片段设计　Ｆｉｇ．１　Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ　ｉｎ￥１２－ＲＮａｓｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ａｎｄ　ｉｔｓ　５’一ｆｌａｎｋｉｎｇ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　图１中的数字标明了各顺式调控元件在砂梨ｓｌ２－ＲＮａｓｅ基因启动子序列中的具体位置；正向箭头、反向箭头代表缺失引　物的位置及方向，并在其下表明引物名称。　

２结果与分析　２．１砂梨Ｓ　－ＲＮａｓｅ基因启动子５’系列缺失片段　表达载体的构建　

植物表达载体均为ｐＢＩ１０１．２是植物基因工程　中常用的载体（见图２一Ａ），带有在细菌及植物中均　可表达的卡那霉素抗性基因以及ＧＵＳ报告基因，　且在多克隆位点前不含启动子序列，可以作为载体　用于分析启动子。￥１２一ｐｒｏ缺失片段阳性重组质粒　Ｓ１２一ｐｒｏ－Ｏ～Ｓ１２一ｐｒｏ－５与ｐＢＩ　１０１．２经过Ｓａｌ　Ｉ和　Ｘｂａ　Ｉ双酶切（见图３）后，在Ｔ４　ＤＮＡ连接酶作用　下进行连接，对转化子进行ＰＣＲ检测，电泳结果见　图４。其中３，６号菌液扩增出与目的片段大小相一　致的特异条带，证明Ｓ１２一ｐｒｏ已经成功连接到　ｐＢＩ１０１．２中，构建成新植物表达载体Ｓ１２一ｐｒｏ一（０～　５）一ＧＵＳ＿ｐＢｌｌ０１．２，见图２一Ｂ。这些片段均与预期　的条带大小相同，并对测序的Ｓ１２一ｐｒｏ－０—１０、Ｓ１２一　ｐｒｏ一１—４、Ｓ１２一ｐｒｏ一２—２、Ｓ１２一ｐｒｏ一３—１、Ｓ１２一ｐｒｏ一４—１及　Ｓ１２一ｐｒｏ－５—３测序结果比对，结果证明了Ｓ１２～ｐｒｏ一　