内酰胺酶抑制剂研究进展

浅谈β-内酰胺酶及其抑制剂 摘要：随着抗生素药物使用的大量普及，抗生素耐药形势也日趋严峻。抗生素耐药的主要机制为产生β-内酰胺酶。β-内酰胺酶依据分子结构中氨基酸序列差异可主要分为两类，分别是以丝氨酸为活性位点的A、C、D类，还有以金属离子为活性位点的金属酶类。随着β-内酰胺酶的泛滥，一些β-内酰胺酶抑制剂应运而生。在治疗微生物感染时，常将抗生素与β-内酰胺酶抑制剂联用，治疗效果显著。本文将对β-内酰胺酶及其抑制剂进行简要的介绍。 关键词：β-内酰胺酶 β-内酰胺酶抑制剂 细菌耐药

On the β-lactamase and its inhibitors Abstract ：With the increasing popularity of the use of antibiotic, the situation of antibiotic resistance becomes worsening. The main mechanism of antibiotic resistance is due to the producing of β-lactamase.β-lactamase can be divided into two categories based on its amino acid sequence in molecular structure. The class of A, C, and D is of Ser active site while the class of B has metal ions in its active site. Some β-lactamase inhibitor come into being because of the spreading of β-lactamase. In the treatment of microbial infection, a number of commonly used antibiotics and β-lactamase inhibitor were combined with favored results. In this article, I will have a briefintroduction ofβ-lactamase and its inhibitor. Keywords :β-lactamase β-lactamase inhibitor antibiotic resistance

1 抗生素耐药性及其耐药机制 抗生素（antibiotic）是生物在其生命活动过程中产生的（以及用化学、生物、生物化学方法衍生的），能在低微浓度下有选择性抑制或影响它种生物功能的有机化合物。细菌耐药性（antibiotic resistance）是指细菌对抗生素不敏感的现象，又可分为固有耐药（intrinsic resistance）和获得性耐药（acquired resistance）。固有耐药是由细菌染色体基因决定、代代相传，不会改变的。如链球菌对氨基糖苷类抗生素天然耐药。获得性耐药是由于细菌与抗生素接触后，通过改变自身的代谢途径，使其不被抗生素杀灭。如本文将重点讨论的细菌对β-内酰胺酶的耐药性。 抗生素的作用机制如下表所示： 表一 抗生素的作用机制 作用机制 代表抗生素 干扰细菌细胞壁的合成，使其不能生长繁殖 β-内酰胺类、万古霉素、环丝霉素 损伤细菌细胞膜，破坏其屏障作用 多粘菌素B、两性霉素B、制霉菌素等 影响细菌蛋白质合成， 四环素、氯霉素、大环内酯类等 抑制核酸合成或作用，影响核酸代谢， 利福霉素类、喹诺酮类、甲硝唑等 抑制细菌代谢 磺胺药、甲氧苄氨嘧啶 抑制结核环脂酸的合成 异烟肼 图1 抗生素的作用机制 相对于抗生素的作用机制，微生物的耐药机制主要包括四部分： （1）β-内酰胺酶的产生，也是主要的作用机制。 （2）外膜通透性下降。 （3）主动外排作用增强。 （4）药物作用靶点的改变。

图二 微生物耐药机制 2 β-内酰胺酶的分类及代表物 通过上部分的介绍，我们知道微生物产生耐药性的主要机制为产生β-内酰胺酶，该酶通过水解β类抗生素的内酰胺环从而使抗生素失效。 β-内酰胺酶的分类标准主要有两类：Ambler分类法和BJM分类法。前者主要依据β-内酰胺酶分子结构中氨基酸序列差异，后者则主要依据β-内酰胺酶的功能。 2.1 Ambler分类法 图三 Ambler分类法 2.2 BJM分类法（Bush-Jacoby-Medeiros） 表二 BJM分类法

类别 分子类型 被抑制

水解底物 代表酶 CA EDTA

1 C类 - - 头孢菌素 G-菌的AmpC 2a A + - 青霉素 G+菌的青霉素酶 2b A + - 青霉素、头孢菌素 TEM-1、TEM-2、SHV-1

2be A + - 青霉素、窄谱与超广谱头孢菌素类、单环类 TEM-3至TEM-26，SHV-2至SHV-6 2br A ± - 青霉素 TEM-30至TEM-36 2c A + - 青霉素、羧苄西林 PSE-1 、PSE-3、 PSE-4 2d D ± - 青霉素、氯唑西林 OXA-1 2e A + - 头孢菌素 普通变形杆菌的头孢菌素酶

2f A + - 青霉素、头孢菌素、碳青霉烯 阴沟肠杆菌的NMC-A 3a B - + 青霉素、头孢菌素类 嗜麦芽黄单胞菌的L1 3b - + 碳青霉烯类 产气单胞菌 3c - + 氨苄西林、头孢立啶 戈氏荧光杆菌 4 未知 - 未知 青霉素 洋葱假单胞菌的青霉素酶

3 β-内酰胺酶与β-内酰胺类抗生素的作用机制 β-内酰胺酶的作用机制由于其活性中心的不同主要分为两类，一类是以丝氨酸为活性中心的酶，涉及Ambler分类法中的A、C、D类。另一类则是以金属为活性中心的酶，主要是B类。下面将分别加以介绍。 3.1 丝氨酸活性酶 β-内酰胺酶与青霉素结合蛋白（PBPs）之间具有高度保守的氨基酸序列，它们与D-丙酰氨-D-丙氨酸转肽酶一起属于“青霉素识别酶”家族。A、C、D类β-内酰胺酶在活性位点上都有丝氨酸，故又称活性位点丝氨酸酶。它们的氨基

β-内酰胺酶 丝氨酸-酶 金属-酶

B类 染色体编码 A类 C类

质粒编码 染色体编码 质粒编码

D类 酸序列同源性不强，但酶分子的三级结构非常相似。下图就是A类β-内酰胺酶的三级结构图以及头孢菌素分子与它的作用机制图。

A B 图4 (A)图为A类β-内酰胺酶活性部位结构图。其中，W1为水分子。 (B)图为头孢菌素分子与β-内酰胺酶作用机制。 如图4所示，由4个氨基酸残基组成的四联体SXXK位于70-73位点，其中X代表任意一种氨基酸，活性位点丝氨酸（Class A为Ser-70，Class C为Ser-64）位于A-螺旋的N-端。由三个氨基酸残基组成的三联体KTG位于β-折叠上（Class A为Lys-234，Class C为Lys-315），另一个三联体SDN定位于130-132；KTG和SDN之间通过氢键连接起稳定的作用。166-170位点上数个氨基酸残基组成Ω环，环上氨基酸序列在Class A中高度保守，Ω环可将亲核水解反应所需的水分子准确定位。SXXK、KTG、SDN和Ω环这几个结构域单元（motifs）之间的空间相对位置所形成的腔即为β-内酰胺底物与酶作用的“键合腔” （binding cavity），A-螺旋结构正好使丝氨酸活性位点Ser-70定位于键合腔的中央。Ser-70的OH、-NH和Ala-237的-NH共同形成Oxyanion盒(酰化反应点)，β-内酰胺环上的羰基在此与-OH、-NH形成酰化酶复合物。 Class A β-内酰胺酶在244位上有一个Arg，具有定位另一个水分子的作用，此结构可水解含非典型B-内酰胺环的底物如克拉维酸、舒巴坦；由于Class C β-内酰胺酶缺乏此结构，对克拉维酸无效。 整体上，Class Aβ-内酰胺酶严整的“键合腔”结构和对水分子的精确定位能力使它能高效地水解底物.而Class C β-内酰胺酶的活性位点为Ser 64 ,并且“键合腔”结构较为松散，更适于具有较大空间位阻的底物进入。Class Dβ-内酰胺酶的一级结构与Class A相似，其三级结构也具有类似于Class A的结构域单元（如KTG三联体等），虽然这些单元在其氨基酸组成和空间的相对位置上与Class A有一定差别，但一般认为其执行的功能是相同的。 3.2 金属活性酶 Class Bβ-内酰胺酶的结构与其它类型相比最大的不同在于金属离子可与氨基酸残基之间形成配位化合物而干预活性位点上的反应，更为特殊的是不同的金属酶其所含的金属离子数目并不固定，从而造成本类酶与底物结合方式上的多样性。 4 β-内酰胺酶抑制剂的作用机制 目前关于β-内酰胺酶抑制剂的作用机理尚不完全清晰。证明了A类、C类β-内酰胺酶（丝氨酸蛋白酶）都是由羧肽酶经由不同途径反应生成，从而证实了β-内酰胺酶和羧肽酶与β-内酰胺类化合物具有相似的作用机制。大量的实验研究表明，A类β-内酰胺酶中得Ser 70去亲核进攻β-内酰胺环上的羰基。但是目前对于活性点部位各残基参与酰化及去酰反应的角色尚有分歧。因此，对于β-内酰胺酶抑制剂的作用机制不能进行详细的介绍。 5 β-内酰胺酶抑制剂的发展 目前应用较多的β—内酰胺酶抑制剂主要是针对A类酶的，如克拉维酸 (Clavulanic acid)，舒巴坦(Sulbactam)和泰唑巴坦(tazobactam)，这是三种临床上最常用的抑制剂。它们均为β-内酰胺衍生物，即它们与β-内酰胺抗生素一样，在结构中都存在一个β-内酰胺环。下面将进行详细的介绍。 5.1 克拉维酸(Clavulanic acid) 克拉维酸（结构式见图5）的抗菌谱广，但活性很弱,其特点是能抑制革兰氏阴性菌和葡萄球菌产生的许多β-内酰胺酶，是第一个应用于临床的β-内酰胺酶抑制剂。目前临床上使用的Augmentin和Timentin就是它分别与羟氨苄青霉素和替卡西林的复配制剂。

图5 克拉维酸结构式 5.2舒巴坦(Sulbactam) 舒巴坦（结构式见图6）属于青霉烷砜类的β-内酰胺酶抑制剂,也是第一个人工合成的此类抑制剂。

图6 舒巴坦结构式 5.3泰唑巴坦(tazobactam) 他唑巴坦(结构如图7)是从舒巴坦的衍生物中筛选出来的一种高效β-内酰胺酶抑制剂。它最早由Hall等人从6-APA出发制得，它的结构是在舒巴坦的基础上增加一个三氮唑环，以提高抑酶效果。它是目前临床效果最佳的β-内酰胺酶抑制剂。他唑巴坦与数种β-内酰胺类抗生素产生极其有效的协同作用，增加了β-内酰胺类抗生素的抗菌活性并扩大了其抗菌谱。它与哌拉西林的复方制剂是1990年至今唯一投放市场的青霉素类抗生素品种。