内芽孢杆菌属细菌(Paenibacillus daejeonensis)SS02抗菌蛋白的分离纯化和其性质的研究
地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白的分离纯化及其理化性质研究
地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白的分离纯化及其理化性质研究纪兆林;唐丽娟;张清霞;徐敬友;陈夕军;童蕴慧【期刊名称】《植物病理学报》【年(卷),期】2007(37)3【摘要】地衣芽孢杆菌W10是一株对多种植物病原菌有拮抗作用的生防细菌,其产生的抗菌物质主要是抗菌蛋白。
细菌培养滤液用30%硫酸铵盐析,透析后再经SephadexG-75层析柱纯化得到一种具有抑菌活性的蛋白。
该抗菌蛋白的分子量为46049.2Da;等电点为6.71;含有糖基,含糖量为6.83%;含有脯氨酸或羟脯氨酸;不含脂基。
这种蛋白在pH6～12范围内均具有抑菌作用,pH6时活性最大;对热稳定,100℃以下水浴20min,抑菌活性与对照相比均在对照的80%以上,121℃蒸汽处理20min,活性虽有所下降,但仍达对照的65.7%;对胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感,酶处理后蛋白的抑菌活性分别为对照的98.7%和98.3%;对氯仿和紫外线也不敏感,处理后活性仍达对照的91.0%和98.6%。
【总页数】5页(P260-264)【关键词】地衣芽孢杆菌;抗菌蛋白;分离纯化;理化性质【作者】纪兆林;唐丽娟;张清霞;徐敬友;陈夕军;童蕴慧【作者单位】扬州大学农学院【正文语种】中文【中图分类】S432.26;S436.412.13【相关文献】1.地衣芽孢杆菌W10发酵产生抗菌蛋白的研究 [J], 纪兆林;宋浩;徐敬友;张清霞;陈夕军;童蕴慧2.地衣芽孢杆菌JF-UN122碱性蛋白酶的分离纯化与性质 [J], 袁铸;王忠彦;胡承;胡永松3.地衣芽孢杆菌2709蛋白酶分离纯化与性质 [J], 张浩;张帅;张娜;马永强4.地衣芽孢杆菌W10菌液和抗菌蛋白对桃果实贮藏保鲜效果的影响 [J], 贺惠文;孙黎平5.地衣芽孢杆菌W10抗菌蛋白对油菜菌核病菌的抑制作用及防病效果 [J], 孙启利;陈夕军;童蕴慧;纪兆林;李海东;徐敬友因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
6实验六内生菌的分离
表面消毒效果的常用检验方法：有两种。
(1) 漂洗液检验法，即把最后一次漂洗灭菌材料的漂洗液吸取0.2～0.3ml涂布 于固体平板上。每个处理重复3次，培养48h，观察有无菌落产生。 (2) 组织印迹法，即把经灭菌、无菌水漂洗过的材料置于固体平板上保留几分 钟，然后移去样品。于28℃培养48小时，检查表面消毒是否彻底。据此验证此 消毒方法是否能全部杀死供试材料。表面消毒检验方法的评价标准为表面消毒 检验培养皿中菌落数量越多菌落出现的时间越早说明该表面消毒检验方法的灵 敏度越高 c.分离培养。组织块培养法表面消毒后的植物组织根或茎在无菌条件下用手术 刀纵 向或横向切割将切口紧贴于分离培养基上。研磨液法表面消毒后的植物组织部 位无菌条件下用PBS 缓冲液研磨研磨液8 层无菌纱布过滤取200 L 直接涂布于 各分离培养基28 下培养36 天。 酵母液处理取0.5mL 研磨液和2mL 含6 酵母粉和0.05 SDS 的PBS 缓冲液混和 160rpm 40 振荡20min 同时将该液稀释10 倍和100 倍后分别取三个梯度的研 磨处理液200 L 涂布于各分离培养基28 下培养36 天。
2．分离方法: ⑴内生细菌 表面灭菌: 将块茎用自来水冲洗干净，在无菌操作台上，依次用 75%的乙醇和次氯酸钠（有效cl-10%）分别进行表面消毒五分钟， 再用无菌水漂洗块茎三次。为了检验表面灭菌的效果，用灭菌过的 镊子夹住块茎,使其表面与固体平板接触3～5 min，然后将培养皿 放在22℃～25℃的温箱中培养3～5d。若发现皿中无菌落出现，证 明该块茎表明灭菌彻底，否则，该分离结果不能使用。 ⑵取样: 用打孔器（d＝10 mm）从茎基部插入薯块，取出样品， 用灭菌的手术刀切取10 mm（包括维管束环），置于研钵中(De Boer,1974)。 ⑶样品处理: 研磨样品，加无菌水定容至10ｍl，静置30 min后，梯 度稀释到浓度为10-1～10-4，取0.2ml涂布于BPA平板上，每浓度 涂平皿一个，重复三次，置于２２℃～２５℃温箱中培养。 ⑷纯化和保存: 培养3～5d后，挑取不同形态的菌落重新于固体平 板上划线纯化，然后，真空冷冻干燥保存，备用。
芽孢杆菌知识
路平所谓耐热菌是指在实验型巴氏杀菌温度下可以存活的菌体，乳微细菌、芽孢菌通常可100 ％存活，一些微球菌的耐热性差，产碱杆菌仅有1％～10％存活，链球菌（即粪肠球菌）、乳杆菌和一些棒状杆菌是耐热菌，可在60 ℃下耐受20min ，但仅有1 ％左右的菌株可耐受到63 ℃ 30min ，常见的耐热菌如下。
3.2.1 芽孢菌属芽孢菌属是乳中污染的主要的耐热菌种，常见于乳中的芽孢杆菌有：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等，该类菌种为革兰氏阳性杆菌，需氧、内生芽孢，能运动、有周身鞭毛，可陈化牛乳，大多数菌落呈扩散性生长，菌落较大，表面呈灰白色，有的菌落成蜡样质颜色，一般不分解乳糖，不利用甘露醇，在乳品中重要的芽孢菌是蜡样芽孢杆菌。
不同菌株的最低生长温度不同，一般在5～6 ℃下仍可生长，最佳生长温度为30～37 ℃，最高生长温度为37～48 ℃。
最低生长PH为4.3～4.9 ，最高为9.3 。
尽管该菌在有氧条件下生长良好，但也可在厌氧条件下通过发酵葡萄糖和还原硝酸盐呼吸而生长，在其他适宜条件下，可在含7 % NaCI 的基质中生长，最小生长的水分活性为0.92～0.95 。
需氧条件下生长于各种培养基上的菌体在饥饿状态下均可生成芽孢。
形成芽孢是一个复杂和需时较长的过程。
一般发生在对数生长后期和稳定早期。
即使在理想状态下形成芽孢仍需6～4h ，在冷藏条件下不会形成芽抱，但当菌体生长耗尽营养时也可形成芽孢。
即在乳品设备管道上残留的稀释乳成分形成薄膜并产生芽抱。
芽孢的出芽要快于成孢，发芽率依赖于环境温度，在适宜温度下发芽不需要lh 即可完成。
在乳品加工中高温短时的巴氏消毒热处理可激活芽孢发芽。
芽孢被激活后，又因加热处理而在乳中形成刺激出芽的物质，提高芽孢出芽率。
该菌的芽孢耐热性因菌株不同而有差异，尽管芽孢不被HTST 杀死，但UHT则可杀灭。
其典型Dl00℃为0.3～10min ，而嗜热脂肪芽孢杆菌的Dl00℃为3000 min，但芽孢杆菌的滋养体或繁殖体却较易被巴氏消毒灭活。
多粘类芽孢杆菌 (1)
多粘类芽孢杆菌1.基本特性1.1中文通用名称：多粘类芽孢杆菌1.2英文通用名称（或拉丁名称）：Paenibacillus polymyxa1.3毒性：低毒1.4应用作物：棉花、玉米、水稻、花生、马铃薯、黄瓜、青椒1.5防治对象：棉花黄萎、黑根腐、炭疽病、赤霉病；玉米全蚀病；水稻白叶枯病；花生青枯病；马铃薯软腐病；黄瓜角斑；青椒疮痂1.6生防特点：多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)对植物黄萎病、鹰嘴豆枯萎病、油菜腐烂病、黑松根腐病等多种植物病害均具有一定的控制作用。
美国环境保护署(EPA)已将其列为可商业上应用的微生物种类之一。
无论是采用HY96-2（P. polymyxa）发酵液，还是由HY96-2制成的细粒剂(KDLD)，在温室内和田间都取得了稳定的防治效果，并且KDLD细粒剂在田间表现的效果更为突出。
2.定性鉴别试验2.1菌株的形态及培养特征类芽孢杆菌属。
菌株接种于 LB固体培养基上，28ºC培养 18～24 h，观察其菌落形态。
利用光学显微镜观察在LB培养基上生长菌体形状和革兰氏染色情况，利用电镜观察菌体大小、荚膜和鞭毛着生情况。
菌体大小为(0．6～ 0．8) μm ×(2．0～5．0) μm，革兰氏阳性、阴性或可变，兼性厌氧，杆状，产芽孢，芽孢椭圆形，端生，膨大，有荚膜，鞭毛侧生或周生。
在 PDA平板上，菌落较小、白色或淡黄色、圆形、菌面稍凸或不凸起，边缘整齐，表面有光泽、光滑、湿润、半透明到不透明；在肉汁琼脂培养基上生长菌落较薄，无菌膜，液体澄清；在斜面培养基上生长良好，菌苔线状、扁平，表面光滑、半透明。
最适合生长温度30-35 ºC表1 菌株在不同培养基中的培养特征（30ºC ，2天）培养特性LB琼脂营养琼脂酵母浸膏琼脂牛肉汁琼脂菌落颜色乳白色杏仁白色淡黄白色灰白色菌落形状湿润光滑粘稠状有小突起，粘性湿润光滑菌落直径mm 2.5 2.8 3 2.62.2生理生化特征由表2可知，菌株的接触酶、厌氧生长、酪朊水解、淀粉水解、V—P反应和硝酸盐还原均为阳性；氧化酶、酪氨酸水解、脲酶、卵黄卵磷脂水解、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用D葡萄糖、D一木糖、D一甘露醇、甘油，且均产酸、产气。
枯草芽孢杆菌
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枯草芽孢杆菌
芽孢杆菌属生物
01 主要特性
03 作用机制 05 水上形态
目录
02 主要作用 04 模式菌株来源 06 应用范围
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），是芽孢杆菌属的一种，CAS号-70-0。单个细胞0.7～0.8×2～3微 米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，可形成内生抗逆芽孢，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微 米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。生长、繁殖速度较快，菌落表面粗糙不透明， 污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，是一种需氧菌。
枯草芽孢杆菌可以减少对虾病害发生，可以大大提高对虾产量，从而提高经济效益，生物环保，刺激水产动 物免疫器官的发育，增强机体免疫力；减少对虾病害发生，明显提高对虾产量，从而提高经济效益，净化水质， 无污染，无残留。
枯草芽孢杆菌通过成功定殖至植物根际、体表或体内，与病原菌竞争植物周围的营养，分泌抗菌物质以抑制 病原菌生长，同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，从而达到生防的目的。枯草芽孢杆菌主要可以抑制由丝状 真菌等植物病原菌所引起的多种植物病害。现报道的从作物的根际土壤、根表、植株及叶片上分离筛选出的枯草 芽孢杆菌菌株对不同作物的众多真菌和细菌病害具有拮抗作用。如粮食作物中的水稻纹枯病、稻瘟病，小麦纹枯 病，豆类根腐病。蔬菜病害中的番茄叶病、枯萎病，黄瓜枯萎病菌、霜霉病，茄子灰霉病和白粉病，辣椒疫病等。 枯草芽孢杆菌还可以控制采后水果的多种疫病如苹果霉心病，柑橘青霉病，油桃褐腐病，草莓灰霉病和白粉病， 香蕉枯萎病、冠腐病、炭疽病，苹果梨青霉病、黑斑病、溃疡病，金花梨果腐病。此外枯草芽孢杆菌对杨树溃疡 病、腐烂病、树黑斑病及炭疽病，茶轮斑病，烟草炭疽病、黑胫病、赤星病菌、根腐病，棉花立枯病、枯萎病等 也有较好的防治作用。
产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产抗菌物质性质
※生物工程食品科学2010, Vol. 31, No. 11147产细菌素苏云金芽孢杆菌的鉴定及其所产 抗菌物质性质李 云，杨胜远 * ，林晓东，钟瑜红，苏 婷，刘湘嘉(韩山师范学院生物系食品与发酵工程研究所，广东 潮州 摘 521041)要：从腌制蔬菜表面分离到一株产细菌素的菌株 K2，其中和后的无细胞发酵液主要抑制革兰氏阳性细菌，特别是对芽孢杆菌有强烈的抑制作用。
发酵上清液经硫酸铵盐析和透析后，仍然有很强的抗菌活性，并对多种蛋白 酶敏感，表明抗菌活性物质为蛋白类物质。
通过形态培养特征、生理生化特征、16S rDNA 序列比对及系统发育 分析，鉴定菌株 K2 是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
菌株 K2 产生的抗菌物质在 pH6～9 条件下 80℃处理 30min 仍保持稳定的抗菌活性，其对敏感菌的作用主要是杀菌，而且对芽孢萌发有很好的抑制作用。
该抗菌物质 在菌体生长对数中期产生，在稳定期中期抗菌活性达到最大。
关键词：苏 云 金 芽 孢 杆 菌；细菌素；鉴定；抗 菌 物 质Identification of Bacteriocin-producing Bacillus thuringiensis and Properties of Its Antibacterial SubstancesLI Yun，YANG Sheng-yuan*，LIN Xiao-dong，ZHONG Yu-hong，SU Ting，LIU Xiang-jia (Food and Fermentation Engineering Institute, Department of Biology, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)Abstract： Strain K2 having the ability to produce bacteriocin was isolated from the surface of picked vegetables. The neutralized cell-free fermentation supernatant exhibited an inhibition effect against Gram-positive bacteria, especially strong inhibition effect against Bacillus strains. The inhibition activity of the fermentation supernatant still kept high after ammonium sulphate precipitation and dialysis, and the activity of the dialysis retentate was sensitive to a variety of proteases. These results indicated the protein nature of antibacterial substances contained in the dialysis retentate. Base on morphological, physiological and biochemical characteristics, 16S rDNA sequence and phylogenic analysis, the strain K2 was classified as Bacillus thuringiensis. The antibacterial substance from strain K2 remained strong antibacterial activity after heating treatment at 80 ℃ and pH 6 － 9 for 30 min, suggesting its excellent thermostable property and pH resistance. The antibacterial activity was generated from midlogarithmic growth phase and reached the maximum activity at mid-stationary phase. Key words：Bacillus thuringiensis；bacteriocin；identification；antibacterial substance 中图分类号：Q939.9 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)11-0147-06细菌素是某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机 制产生的一类具有生物活性的蛋白质或多肽，主要抑制 其他相近种类的细菌，一般产生菌自身对其细菌素具有 免疫性[ 1 ] 。
类芽孢杆菌BD3526抑菌活性物质的初步分离及性质测定
类芽孢杆菌BD3526抑菌活性物质的初步分离及性质测定刘玉娟;韩瑨;吴江;刘振民;郭本恒;吴正钧【摘要】本实验以一株类芽孢杆菌BD3526为研究对象,采用丙酮浸提菌体得到抑菌活性粗品,通过Sephadex LH-20对样品进行初步纯化,结果表明粗品对藤黄微球菌CGMCC1.1848的最低抑菌浓度(MIC)为12.5 mg/mL,对金黄色葡萄球菌CGMCC1.879和单增李斯特菌CGMCC1.9136的MIC为25 mg/mL;Sephadex LH-20纯化样品对藤黄微球CGMCC1.1848的MIC为1mg/mL,对金黄色葡萄球菌CGMCC1.879和单增李斯特菌CGMCC1.9136的MIC为2 mg/mL.样品经链霉蛋白酶处理后,活性基本消失.经加热、酸碱、胰蛋白酶、胃蛋白酶、脂肪酶、蛋白酶K处理后,活性没有明显变化.因此,类芽孢杆菌BD3526产生的是一种细菌素类的抑菌物质,该抑菌物质在食品和医疗行业有广阔的应用前景.【期刊名称】《天然产物研究与开发》【年(卷),期】2015(027)007【总页数】6页(P1176-1180,1209)【关键词】类芽孢杆菌;抑菌活性;分离纯化;最低抑菌浓度【作者】刘玉娟;韩瑨;吴江;刘振民;郭本恒;吴正钧【作者单位】乳业生物技术国家重点实验室光明乳业股份有限公司,上海200436;上海海洋大学食品学院,上海201306;乳业生物技术国家重点实验室光明乳业股份有限公司,上海200436;乳业生物技术国家重点实验室光明乳业股份有限公司,上海200436;乳业生物技术国家重点实验室光明乳业股份有限公司,上海200436;乳业生物技术国家重点实验室光明乳业股份有限公司,上海200436;乳业生物技术国家重点实验室光明乳业股份有限公司,上海200436【正文语种】中文【中图分类】Q939.92类芽孢杆菌属(Paenibacillus sp.)细菌是广泛存在于自然界，好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，其生理特性丰富多样，是土壤和植物微生态优势种群之一。
腊样芽孢杆菌PPT课件
这些代谢产物的产生会影响培养基的pH值和成分，进而影响腊样芽孢杆菌的生长和 繁殖。
03 腊样芽孢杆菌的应用
在食品工业中的应用
食品发酵
腊样芽孢杆菌在食品发酵过程中 作为发酵剂，能够产生丰富的代 谢产物，如乳酸、醇、酯等，赋
予食品独特的风味和质地。
蛋白质相互作用பைடு நூலகம்究
利用酵母双杂交、免疫共沉淀等技术，研究腊样芽孢杆菌中蛋白质 之间的相互作用，揭示菌株的分子调控机制。
蛋白质修饰研究
对腊样芽孢杆菌中的蛋白质进行磷酸化、乙酰化等修饰研究，了解这 些修饰对蛋白质活性和功能的影响。
功能基因与蛋白质的研究
1 2 3
致病基因与毒力因子
研究腊样芽孢杆菌中的致病相关基因和毒力因子， 了解其在感染过程中的作用和机制。
安全使用与管理
加强食品安全监管
相关部门应加强对食品中腊样芽孢杆菌的监测和检测，确保食品的安全性。
提高公众意识
向公众普及腊样芽孢杆菌的相关知识，提高公众对食品安全的认识和自我保护 意识。
06 腊样芽孢杆菌研究展望
新技术的应用
01
基因编辑技术
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，对腊样芽孢杆菌进行定向改造，提
02 腊样芽孢杆菌的生理生化 特性
营养需求
腊样芽孢杆菌是一种需氧型细 菌，需要充足的氧气供应以维 持其正常的生长和代谢。
该菌对营养的需求较为复杂， 需要多种氨基酸、维生素和微 量元素等，其中以碳源、氮源 和磷源为主要需求。
腊样芽孢杆菌在生长过程中需 要适宜的pH值，通常在6.57.5之间。
生长繁殖
培养基优化
通过优化培养基成分和条件，提高腊样芽孢杆菌的生长速率和产 物产量，降低生产成本。
枯草芽孢杆菌
培养特性
在营养琼脂培养基上，37℃培养24h ，可形成圆形、隆起、表面光滑、湿 润、边缘整齐的菌落，菌落呈灰白色 或略带黄色。
生态环境与分布
生态环境
枯草芽孢杆菌广泛存在于土壤、空气 、尘埃以及人和动物的肠道中。
分布
作为一种常见的环境微生物，枯草芽 孢杆菌在全球范围内的各种生态环境 中都有分布，包括土壤、水体、空气 以及动植物体表和体内。
枯草芽孢杆菌
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目录
• 枯草芽孢杆菌基本概念 • 枯草芽孢杆菌生理功能 • 枯草芽孢杆菌应用领域 • 枯草芽孢杆菌培养技术 • 枯草芽孢杆菌安全性评价 • 枯草芽孢杆菌市场前景展望
01
枯草芽孢杆菌基本概念
定义与分类
定义
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）是一种革兰氏阳性、好氧或兼 性厌氧的杆状细菌，属于芽孢杆 菌属。
终止发酵。
05
枯草芽孢杆菌安全性评价
毒性试验
1 2
急性毒性试验
通过对实验动物进行单次或短时间内的高剂量暴 露，观察枯草芽孢杆菌对实验动物的急性毒性作 用。
亚急性毒性试验
在实验动物上进行较长时间的连续或反复暴露， 以评估枯草芽孢杆菌对机体的亚急性毒性作用。
3
慢性毒性试验
通过长期低剂量暴露，观察枯草芽孢杆菌对实验 动物的慢性毒性作用，包括致癌性、生殖毒性等 。
医药领域应用拓展
枯草芽孢杆菌在医药领域具有潜在应用价值，如生产抗生 素、酶制剂等，随着医药技术的不断发展，其市场需求将 进一步扩大。
工业领域应用前景广阔
枯草芽孢杆菌在工业领域可用于生产多种酶类、有机酸等 化工产品，随着工业生物技术的不断发展，其市场需求将 进一步增加。
地衣芽孢杆菌的分离和鉴定
地衣芽孢杆菌的分离和鉴定作者：布帕提买木·麦麦提潘姣姣阿迪莱·卡哈曼伍麦尔·麦海提陈荟旭张秋林李莲瑞来源：《农业与技术》2020年第17期摘要：为了從土壤中分离得到地衣芽孢杆菌，开展后续研究，试验采集塔里木盆地的土壤进行细菌培养，采用台盼蓝平板方法，对分离培养得到的单菌落进行生物学特性研究、生理生化试验和16S rDNA鉴定。
根据《伯杰细菌鉴定手册》，初步鉴定为芽孢杆菌，提取DNA 进行PCR扩增并送测序。
结果表明，从塔里木盆地土壤中分离得到的细菌为地衣芽孢杆菌，说明该土壤中存在地衣芽孢杆菌，并为后续进一步研究及应用奠定基础。
关键词：土壤;分离和鉴定;16S rDNA;地衣芽孢杆菌中图分类号：S-3文献标识码：ADOI：10.19754/j.nyyjs.20200915005收稿日期：2020-08-17基金项目：大学生创新项目（项目编号：201810757029）作者简介：布帕提买木·麦麦提（1996-），女，硕士在读。
研究方向：动物性食品卫生与安全;通信作者李莲瑞（1968-），女，博士，教授。
研究方向：动物性食品卫生与安全。
地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）为革兰氏阳性菌，广泛分布于微生物混合培养物中[1]。
呈杆状，芽孢为椭圆形，孢囊稍膨大，为非致病性菌，细菌最适生长温度约为50℃，酶的最适生长温度为37℃。
地衣芽胞杆菌耐热、含酶量多、产酶量高的优良特性被广泛应用于工业生产中，主要用来生产淀粉酶[2]及蛋白酶[3]。
芽孢杆菌具有耐酸、耐盐、耐高温等特点，这使得其可以在条件不利的情况下形成芽孢，自我保护，并在环境适宜的条件下复活。
地衣芽孢杆菌在代谢过程中能产生多种酶和活性物质，具有益生保健[4]，降解农药[5]和净化水体[6]的作用。
为了解塔里木盆地土壤中是否存在地衣芽孢杆菌，本试验从塔里木盆地的1份土壤中筛选出1株镜检有芽孢的单菌落，对该菌株进行分离纯化，经过生理生化实验鉴定、16S rDNA基因测序，最终鉴定为地衣芽孢杆菌，且为后续开展地衣芽孢杆菌的应用研究奠定基础。