双水相萃取应用作业
实验五 双水相萃取及分配系数的测定
1.200g/mL。 ⑶ 按质量百分比配制3管（各8g,要求完全溶解，混合均匀）。
添加
顺序 管
PEG
PEG
40%
质量浓度5%
质量浓度10%
丙醇 磷酸钾 硫酸铵
双水相萃取的基本特点
(1) 体 系 有 生 物 亲 和 性 。 两 相 中 的 水 分 含 量 通 常 高 达 65%～90% ，所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸盐、硫 酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害，甚 至还有稳定保护作用，而且相界面张力比水-有机或有机有机两相体系的界面张力要小1～3 个数量级。由于生物 活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有的生物活性物质 亲水性很强，不溶于有机溶剂，有机溶剂萃取等分离技术 难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。
K=C1/C2
思考题：
1、常用双水相体系有哪些？双水相体系形成 的原因是什么？
2、影响双水相成相的因素有哪些？
双水相萃取概述
现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内 产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能 对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们 在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃 取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶 束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因 此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、 经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取 技术(又称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、 极有前途的新型分离技术。
双水相萃取实验
三. 选择正确的吸出上、下相操作方法：
1. 吸管小心插入下相，吸出下相
换吸管，吸出上相。
2. 吸管小心吸出上相
插入下相，吸出下相。
3. 吸管小心吸出上相 吸出下相。
将多余上相和少量下相弃去
换吸管，
11
生化物质分离纯化基础实验
四. 可调式移液器（枪）正确的操作方法（是非题）： 1. 要吸取0.4ml液体，可用1000 ~ 5000 μl 规格的枪。 2. 向顺时针方向旋，数值减小；逆时针方向旋，数值增
数g
ml
g
纯(NH4)2SO4 累计量 g
溶液累计 总量 g
PEG
%(g/g)
(NH4)2SO4
%(g/g)
1 0.5 2 0.3 3 0.3 4 0.3 5 0.5 6 0.5 7 0.5
5
生化物质分离纯化基础实验
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同程度地分配，分配 系数 K = C上/ C下。 相比R = V上/ V下
2. 考马斯亮兰（Coomassie Brilliant Blue G-250） 比色法测定两相中 蛋白质浓度：考马斯亮兰G－250是一种染料，酸性溶液中呈棕红 色。与蛋白质通过范德华键结合成兰色复合物，595nm波长有最大 吸收值。 低浓度时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
6
生化物质分离纯化基础实验
1 0.1
g / ml
10
生化物质分离纯化基础实验
● 思考和讨论:
一. 加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全部溶解，原因 是什么？
二. 1. 2.
选择正确的离心操作顺序: 将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液)对称放在离心机中。 将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡 对称放在离心机中。
双水相萃取技术的研究现状与应用
基本内容
3、环保领域：双水相萃取技术在废水处理、重金属离子去除等方面具有潜在 应用价值。例如，通过双水相萃取技术成功实现了对含有重金属离子的废水的处 理，降低了废水中的重金属离子浓度。
基本内容
双水相萃取技术的研究方法双水相萃取技术的研究方法主要包括以下内容： 1、影响因素研究：双水相萃取技术的分离效果受到多种因素的影响，如双水 相体系的组成、目标物在双水相体系中的分配系数、实验温度和pH值等。通过对 这些影响因素的研究，可以优化双水相萃取工艺，提高目标物的分离效果。
基本内容
3、双水相萃取技术的设备研发和工艺优化将成为未来的研究重点，以进一步 降低操作成本，提高实际应用中的效率和稳定性。
基本内容
4、双水相萃取技术与其他新兴技术的结合，如微流控技术、纳滤技术等，将 成为未来的一个重要研究方向，以实现更高效、更便捷的分离和纯化过程。
基本内容
结论双水相萃取技术作为一种有效的分离和纯化技术，在食品、制药、环保 等领域已得到广泛应用。通过对该技术的研究和应用，不仅有利于促进相关领域 的技术进步，提高生产效率和产品质量，还有助于推动相关产业的绿色发展，为 实现可持续发展作出贡献。未来，随着科学技术的不断进步和创新，双水相萃取 技术将在更多领域展现其巨大潜力，为人类社会的进步和发展作出更大贡献。
基本内容
展望未来双水相萃取技术在多个领域显示出广泛的应用前景，但仍存在一定 的挑战和问题需要进一步探讨和研究。未来的发展趋势可能包括：
基本内容
1、双水相萃取技术的理论研究将更加深入，以进一步优化双水相体系的组成 和性质，提高目标物的分离效果。
基本内容
2、双水相萃取技术的应用领域将进一步拓展，特别是在新能源、新材料、生 物医药等领域的应用研究将更加活跃。
双水相萃取实验
一、双水相系统的相图绘制1.实验目的了解制作双水相系统的相图的方法，加深对相图的认识。
2.实验原理相图是研究两水相萃取的基础，双水相形成条件和定量关系常用相图来表示。
图1是典型的高聚物-高聚物-水双水相体系的直角坐标相图，两种聚合物A、B以适当比例溶于水就会分别形成有不同组成、度的两相，上相组成用T点表示，下相组成用B点表示，由图1可知上下相所含高聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。
曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。
结线上方是两相区，下方为单相区，若配比取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。
组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。
即T和B相质量之比等于系线上MB与MT的线段长度之比。
又由于两相密度相差很小，故上下相体积之比也近似等于系线上MB与MT线段长度之比。
图1 A-B-水双水相体系相图Figure 1 The phase diagram of the A-B-H2O aqueous two-phase system 3.实验器材和试剂（1）器材：电子台秤，漩涡混合器，大试管，滴定管，密度计，温度计。
（2）试剂：聚乙二醇，硫酸铵，硫酸镁。
4.操作方法（1）溶液的配制配制40%的盐（硫酸铵或硫酸镁）溶液配制40%的聚乙二醇溶液，液体聚乙二醇可用纯溶液。
（2）相图的制作精确称取一定质量（0.7000g左右）PEG溶液于大试管中，按表1所列第1列数据，加入0.5mL去离子水，用滴定管缓慢滴加已配好的40%的盐溶液，并不断在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内液体出现浑浊为止。
记录盐溶液的加量(g)。
然后，按表格所列第2列数据加入水，溶液澄清，继续向试管中滴加盐溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。
计算每次达到浑浊时，PEG和盐在系统总量中的质量分数，将实验数据填入表中，以PEG的质量分数为纵坐标，某种盐的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线的相图。
实验二双水相萃取α淀粉酶分配平衡
实验⼆双⽔相萃取α淀粉酶分配平衡实验⼆双⽔相萃取α-淀粉酶的分配平衡实验⼀、实验⽬的与要求1）掌握双⽔相萃取技术的基本原理和主要影响因素。
2）了解⽬标产物的性质如等电点、电荷和分⼦量等。
3）掌握熟悉聚⼄⼆醇（PEG）/硫酸铵体系双⽔相萃取实验操作。
4）明确PEG分⼦量、硫酸铵浓度、pH和添加NaCl等因素对α-淀粉酶分配系数的影响。
⼆、实验器材和试剂1.实验器材:低速离⼼机；酸度计；涡流混合器；分光光度计2.实验试剂:PEG：（分⼦量分别为1000、2000、4000、6000、8000）、硫酸铵、α-淀粉酶、磷酸氢⼆钠、磷酸⼆氢钠、氯化钠、考马斯亮蓝 G-250三、实验原理双⽔相萃取技术在萃取胞内酶中应⽤⼴泛，最常采⽤的双⽔相体系是PEG/Dex或PEG/低分⼦盐系统，其中低分⼦盐最常采⽤的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。
PEG/磷酸钾双⽔相体系相图如上所⽰。
T为上相浓度，B为下相浓度, C为系统临界点，TCB为临界线或双节线，双节线以上为两相区、以下为⼀相区或均相区。
因此两相浓度要⾜够⾼才可以形成两相。
双⽔相萃取分配系数K=C t/C b，为上相和下相的浓度⽐。
双⽔相系统分配系数的影响因素包括系统本⾝的因素如系统组成、聚合物分⼦量、聚合物浓度、盐和离⼦强度、pH等，以及⽬标产物的性质如疏⽔作⽤、电荷、等电点和分⼦量等。
利⽤双⽔相技术可以获得特定蛋⽩质和⽣物⼤分⼦的最适宜分离的相系统和最优分配。
相图中TMB为系线，其长度由相组成的总浓度决定，表征两相差异程度。
在临界点附近系线长度趋近于零，表⽰上相和下相的组成相同，因此分配系数应为1。
随着PEG、硫酸铵和盐浓度增⼤，系线长度增加，上相和下相相对组成的差别就增加，酶在两相中的分配系数会受到极⼤的影响。
本实验采⽤PEG/硫酸铵双⽔相体系研究α-淀粉酶的分配，具体研究PEG分⼦量、硫酸铵浓度、pH和添加NaCl浓度对α-淀粉酶分配系数的影响。
参考：-淀粉酶是⼴泛应⽤的⽣物酶类，B.Subtilis细菌α-淀粉酶是研究和应⽤较多的α-淀粉酶，其分⼦量为48 KD，PI约为5，最适pH5.3-6.4，在pH4.8-8.5之间稳定。
双水相萃取技术的研究及应用
双水相萃取技术的研究及应用摘要：双水相萃取技术是一种高效温和的新分离技术，在生物制药、分析检测、稀有金属分析等方面均有应用，特别是在生物分离工业中，它与传统的萃取及其它分离技术相比具有操作条件温和、处理量大、易于连续操作等优点，从而使其能广泛应用于生物分离工程中。
本文简单介绍了双水相萃取技术及其原理、特点，综述了双水相体系在生物工程、药物分析和金属分离等方面的应用，展望了双水相体系的应用前景。
关键词：双水相萃取；分离提纯；生物物质；应用Research and application of aqueous two - phase system technique Abstract:Phasepartitioning technology is a kind of high efficient mild new separation technique in biological pharmacy, analysis, testing, rare metals analysis were used, especially in biological separation industry, it and the traditional extraction and other separation technology compared with mild conditions, large quantity of operation, easy for operation, which makes its advantages such as extensively applied in biological separation engineering. This article simply introduces phasepartitioning technology and its principle, characteristics, summarized the aqueous two-phase system in biological engineering, drug analysis and metal separation of application, and looks forward to the aqueous two-phase system application prospect.Keywords:aqueous two-phase extraction; separation and purification;biological material application1 引言双水相萃取技术是一种高效温和的新分离技术。
双水相
5、萃取因素与理论收得率
6、影响K的因素
影响分配系数的因素： 系统本身的因素：系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和
离子强度、pH等。 目标产物的性质：疏水作用、电荷、分子量等。
（1）、PEG分子量 α-淀粉酶的分配系数随PEG分子量的增加而降低，
在低分子量PEG时，α-淀粉酶的分配系数高，α-淀粉酶主 要集中在上相；而随着PEG分子量的增加，分配系数K值 降低，甚至α-淀粉酶分配到下相。
（3）逐渐加入无机盐原液，混合，直至试管出现混浊。 称重，计算加入的无机盐量（g） 。
（4）逐滴再加入蒸馏水，震荡，使浑浊的两相系统“刚 刚变澄清”，称重，计算出系统总质量（W1- W0 ，g） 。
（5）计算出系统中PEG和无机盐的质量浓度（无机盐%, PEG%）。
（6）在坐标系中绘出第一个坐标（无机盐%, PEG%） （7）继续向试管中加入无机盐，使系统再次变混浊， 称重，然后逐滴加水、震荡，使系统“刚刚澄清”，称重， 计算出澄清时系统中的PEG和无机盐的质量浓度，然后， 在坐标系中绘出第二个坐标点。如此反复操作，绘出多个 坐标点。 （8）连接多个坐标点，得到相图。
液宜冰箱保存，使用15天后需要重新配制。
3、 操作步骤
3.1 待测酶液的制备 待测样品用pH6.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释，
供测定用。
3.2 测定 取2ml标准终点色溶液滴于白磁板空穴内，作为比较
颜色的标准。 取20ml 2%可溶性淀粉和5m1 pH6.0 磷酸氢二钠-柠
檬酸缓冲液，放于20×200mm大试管中，在60℃恒温水 浴中预热4-5min．然后加入预先稀释好的酶液0.5m1，立 即记录时间，充分摇匀。定时用滴管取出反应液约0.5m1， 滴于预先充满比色稀碘浓(约1.5ml)的磁扳空穴内，当穴内 颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准终点色相同时， 即为反应终点，并记录时间t (min)。
双水相萃取(化工35班)
• 3.在金属分离中的应用 • 传统的金属离子溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境、对人体 有害、运行成本高、工艺复杂等缺点。近年来，利用双水相 技术萃取分离金属离子达到了较高的水平。 • Bulgariu [11]等将Cd(I)加入到碘化物在pH 2.05-7.12的 PEG(I500)-(NH4)2SO4。双水相体系中萃取到PEG相。红外 光谱显示随着(NH4)2SO4溶液的酸度增加PEG氧化醚的质子 不增加，但是PEG相中水的含量减少。金属萃取到PEG相中 改变了水分子与聚合物链的结合；吸光度随着pH值的改变而 改变。显微镜方法表明通过具体的相互作用在PEG相中萃取 金属的固着点依赖于物质的种类。这也取决于聚合物链结构 的变化。
磷酸钾
聚合物/ 无机盐 聚乙二醇 硫酸铵
双水相系统形成原理
空间位阻
盐析效应
极性差异
高聚物 /高聚物之间的双水相体系的形成主 要是由于高聚物之间的不相溶性。即在高 聚物分子的空间阻碍作用下, 两种物质无法 相互渗透, 不能形成均一相, 从而具有分离 倾向, 继而在一定条件下分为两相。该说法 认为, 如两种聚合物憎水程度有所差异, 从 两种不互溶的水溶性物质在水中会产生争 而导致分离, 憎水程度相差越大, 相分离倾 夺水分子的现象。无机盐等物质的争夺水 向也就越大。然而该说法不能有效解释低 双水相成相能力大致与水溶性有机溶剂的 分子的现象导致有机分子被富集, 从而产生 分子有机物 /无机盐的成相机理。因为在该 极性相反, 有机溶剂极性越大, 分相能力越 相分离的现象。然而, 在有机分子 /无机盐 / 类体系中, 由于有机物表现为与水无限互溶, 差。该说法不能完全解释有机溶质在双水 水的三相体系中, 如果有机分子过量的情况 相体系中分布规律时一些大极性分子的分 下, 盐会以固体形式析出。 布规律。
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双水相技术在青霉素的领域的应用
（12级生物工程 杨申雨 豆志伟 苗春雷 高佳林 刘泽培）
一、药品青霉素的特性 青霉素是人类最早掌握的抗生素，也是目前生
产量最大应用最广泛的抗生素之一。青霉素是一大类抗生素的总称，是
指从青霉菌培养液中提取的能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期
起杀菌作用的一类抗生素。然而，青霉素不耐酸碱，过酸过碱都可使其
结构发生变化而失去抗菌性。此外，青霉素为窄谱抗生素，其抗菌作用
很强，低浓度时起抑菌作用，高浓度时具有强大的杀菌作用。但只对革
兰氏阳性菌及少数革兰氏阴性菌效果好，对大多数阴性菌则无效。青霉
素的抗菌机制主要抑制细菌细胞壁的合成，从而破坏其对菌体的保护作
用。细菌细胞壁的主要成分由粘肽组成，青霉素能制止粘肽的合成，而
对已形成的细胞壁无破坏作用。因此其对生长旺盛(即细胞壁生物合成
时期)的敏感菌特别有效，而对代谢受到抑制的静止期细菌则效果较
差。
二、双水相的特点 双水相系统萃取成为新兴生物技术产业研究的热
点，主要是该技术对于生物物质的分离和纯化表现出特有的优点和独特
的技术优势 ：(1)分相时间短. (2)含水量高，在接近生理环境的体系
中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(3)界面张力小 (4)
不存在有机溶剂的残留问题，且高聚物对人体无害；(5)大量杂质能与
所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工艺放大和连续
操作 ，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；(7)操作条
件温和，整个操作过程在常温常压下进行。(8)多种因素都可以对被萃
取物质在两相的分配产生影响，故而可以利用多种手段来提高选择性和
回收率。
三、华药青霉素的生产状况 华北制药厂是国内生产青霉素的主要企业
之一，它采用了以醋酸丁酯为萃取剂的溶媒萃取工艺，它属于酸式萃
取，其酸性可以破坏青霉素活性。溶媒萃取对青霉素的分离提纯的关键
设备是离心萃取机，90年代前华药采用的罐式萃取，其萃取时间长，故
而酸性溶液对青霉素活度的破坏作用大。自1989年华药采取Decanter离
心机萃取工艺取代传统的罐式萃取工艺进行研究，青霉素混合液在数秒
即将达到充分混合后高速离心分离，使青霉素快速转移到醋酸丁酯相
中，大大缩短了青霉素在酸性条件下的混合、分离时间，减少了青霉素
的酸性降解，分离效率较之罐式萃取工艺也大大提高。
四、国外研究生产状况 尽管华北制药采用的溶媒萃取工艺应用了
Decanter离心机，使得青霉素的提取工艺得以改善，分离效率也得以大
大提高。但其低收率高能耗，迫使人们寻找更好的提取工艺，双水相就
是其中之一。自20世纪80年代中期以来，各国学者开展了进一步的研究
工作，各类用于计算生物物质在双水相系统分配系数的模型也时有报
道,诸如Baskir晶体吸附模型[1]、Hayne模型、Pitzer模型[2]、
Grossman自由体积模型等,但结果均难以令人满意。上世纪80年代末，
外国已经开始研究双水相在青霉素萃取中的应用，并且其已经在研究中
取得进展，如Yang等用聚乙二醇(PEG)3350/K2HPO4处理青霉素发酵液
时, 青霉素G的分配系数可达13~14.5, 收率可达93%一97%, 纯物质的分
配系数则更大。[3]同时发酵液中苯乙酸的分配系数为0.25,细胞碎片和
固体残渣沉积在相界面和下相底部。可见,只采用一步ATPP就可以将青
霉素与杂质得到充分的分离,且此条件下不存在青霉素的降解和乳化现
象。这就为其实现工业化提供了可能性。 现在，国外对双水相萃取青
霉素技术的研究主要集中在：新型、高效、廉价的双水相体系的开发。
如利用低分子有机物与无机盐形成双水相体系、离子型双水相体系、双
水相体系与其他技术相结合等来分离提纯青霉素及其他药物。又如，
Madhusudhan等已经研究出了采用双水相萃取和沉淀结合的方法从酿酒
酵母中分离纯化乙醇脱氢酶[4]；Porto等采用PEG/柠檬酸盐双水相体系
从产气荚膜梭状芽胞杆菌发酵液中提取分离蛋白酶[5]。这些双水相体系
的引入，必将可以大大降低成本，简化操作流程，提高产品收率，进一
步实现工业化的大规模生产。
五、国内目前的状况 我国对双水相的研究起步比欧美国家晚，但是目
前我国也已经着手于研究利用双水相技术萃取青霉素并且也取得了瞩目
的成就。刘庆芬等建立了由亲水性离子液体1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼
和磷酸二氢钠形成的双水相体系萃取青霉素G的新方法。[6]结果表明，
离子液体双水相可以有效萃取青霉素，轻相中青霉素萃取率可达
93.7%。离子液体双水相体系的pH值在4～5内，在该条件下萃取过程不
发生乳化现象。而朱自强等用8％的PEG2000与20％的(NH4)2SO4组成的
双水相系统直接处理青霉素G发酵液，分配系数高达58.39，浓缩倍数为
3.53，回收率为93.67％，青霉素G对糖的分离因子和对杂蛋白的分离因
子分别为13.36和21.9，比传统的溶媒萃取法大18.86％，而且此工艺中
仅用了一次双水相和一次醋酸丁酯萃取。[7]陈玉瑾研究利用双水相萃取
法在不复杂的设备, 并在温和条件下进行简单的操作就可获得较高收率
和有效成分的新型分离技术，双水相萃取法分离黄酮类化合物的分离分
析中取得了较好的效果,有望成为一种新型的黄酮类化合物的分离纯化
方法。[8]目前，我国双水相萃取青霉素的研究方向主要集中于寻找廉价
的高分子聚合物以及高分子聚合物的回收利用以及双水相体系的理论等
方面。
六、调研的目的和意义 传统的提取青霉素的方法与双水相技萃取技术
相比有很多的缺陷与不足，为了提高药物的质量以及活度，降低青霉素
的药用副作用，提高青霉素的药用性能，为了有更好的经济效益，降低
生产成本，减少环境污染，故而作此调研以便了解双水相萃取技术目前
的研究状况，以及将其投入青霉素工业生产的可行性进行分析，使青霉
素可以更好的造福于人类，减少青霉素对人体的过敏反应。
七、老工艺的不足和缺陷（新旧对比） 传统发酵法生产青霉素主要采
用乙酸丁酯萃取技术对发酵液中的青霉素进行分离纯化。通常，溶剂萃
取技术需要被分离物质以分子态的形式存在，然而分子态的青霉素在室
温下却很不稳定。因此，需要控制萃取的操作环境，这大大增加了生产
成本。在实际生产过程中，醋酸丁酯会破坏青霉素活度，并且有一部分
残留在药品中，从而影响人体健康。此外，醋酸丁酯萃取技术在实现分
离青霉素的同时，还会引起醋酸丁酯残留在水相当中导致较为严重的环
境污染。可见，青霉素的分离、富集和纯化过程是控制生产成本、减少
环境污染的重要环节。而采用双水相萃取分离技术来提取青霉素，可以
避免类似问题，而且其分离时间短，分离环境含水量高，不会破坏青霉
素活性，故而利用双水相萃取法提取青霉素会大大提高青霉素生产中的
效益。
八、展望 对于应用溶媒萃取体系提纯青霉素的过程, 工艺上已经相当
成熟, 但该方法存在低收率高能耗而且其发展前景几乎已经无路可寻的
缺点。因此为了提高青霉素收率, 降低能耗, 以便获得更高的效益，必
须对其生产工艺进行改变。双水相萃取技术便是最好的选择之一。然而
尽管双水相技术有着许多诱人的优点,但是其所需的高聚物价格昂贵且
难以回收重复利用，以及人们对双水相的研究尚不完善等缺点使得它仍
然难以应用于工业化的大规模生产。所以，选择价格低廉、容易回收的
高聚物将有利于其实现工业化大生产。另外，体系的易乳化问题，导致
萃取过程极不稳定，操作十分不方便，条件难以控制。这需要人们进一
步研究双水相技术，添加防乳剂、控制萃取条件等来避免乳化的产生。
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