膜片钳实验与技术(课堂PPT)

膜片钳技术讲座
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在《膜片钳技术及应用》（2003）一书的序言中写道： 通常，一篇非常专业的科技论文公开发表后，若被其他的论文 引用数次，其作者就会感到欣慰；假如被别的作者引用十次以上，就可 称得上是一篇好论文；要是有幸被引用几十上百次，甚至几百次，那它 无疑是一篇高质量杰作，通常发表在权威的专业期刊或者是著名的科学 杂志上，如“Nature” ，“ Science”， “ Cell”和“ Neuron”等。
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二、离子通道的分子结构
随着生物物理学和分子生物学的迅速发展，新的研究技术 的应用，特别是膜片钳片技术与分子克隆、基因突变和异体表达 等技术的结合，使离子通道的研究迅速进入到分子、亚分子水平， 人们已开始有能力从分子水平来确定通道的分子结构和解释离子 通道的孔道特性。
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１．电压门控离子通道的基本结构
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乙酰胆碱门控离子通道 由α1γα2βδ 五个亚基组成，呈五边形排列。每个亚基有 4αA个C1和h跨分α膜子2区亚与段基α即N亚端M基的1~结4细，合胞由后外五，部个便分亚引各基起有的通一M道个2蛋共A白同Ch的构结构成合象孔位变道点化的，和内当通壁两道。个开在 放，主要引起Na+内流增多。
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２．化学门控离子通道的基本结构
当各种化学物质与化学门控离子通道相应部位结合后，会导致 通道蛋白发生构型变化，引起通道开放，产生离子电流。体内这种离 子通道的种类很多，主要包括各种神经递质门控离子通道、ATP敏感 钾通道和钙依赖性钾通道等。
神经递质门控离子通道又称为离子通道受体，主要有乙酰胆碱门 控离子通道、GABA门控离子通道及谷氨酸门控离了通道三大类。
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离子通道具有两大共同特征，即离子选择性及门控特性。选择 性包括通道对离子大小的选择性及电荷选择性，如安静时神经细胞膜
离子通道对K+的通透性比Na+大100倍，而神经兴奋时，对Na+通透
性又比K+大10~20倍。通道闸门的开启和关闭过程称为门控 （gating）。通道可表现为三种状态，即备用、激活及失活状态。
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2、电压门控离子通道
电压门控离子通道（voltage-gated ion channels）又称电压依赖性离子通道，这 一类通道的开启或关闭受膜电位的变化决 定，具有电压依赖性和时间依赖性。电压 门控离子通道一般以最容易通过的离子命 名，如钠离子通道、钙离子通道及钾离子 通道等。
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电压门控钠离子通道
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当膜去极化时，每一个功能区的S4肽段做螺旋运动而使正电荷移 出段又产均称生 发 为微生激活弱这闸而种门短构（暂象的变act门化iv控时ati电，on流则g， 通ate导道, m致便闸通处门道于）构激在象活通变开道化放开状。放态当后四，，个因很结此快构，Ⅲ域S4肽结S4肽段构 域门的）S，6与形Ⅳ成功一能“区活的瓣S”1之，间将的通肽道链内构口成阻失塞活，闸调门控（通in道ac的tiv失at活io过n g程at。e, h闸
经纯化、克隆和测定表明，离子通道蛋白 是由多个亚基构成的复合体。电压门控离子 通道由α、β、γ、δ等亚基构成，但不同 的离子通道的组成略有差异，如钠通道由α、 βα12、、ββ、2和γβ和3 δ、亚β基4亚组基成组，成钾，通钙道通由道α由和αβ1、 亚基组成等。在各亚基中，α亚基是构成离 子通道的主要功能单位，而其它亚基则只起 调节作用。
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电压门控钾离子通道
钾离子通道（potassium channels，简称钾通道）是广泛存在、 种类最多、最为复杂的一大类离子通道，仅电压门控钾通道就已克 隆出几十种亚型，根据其电流动力学特点可分为延迟外向整流钾通 道、瞬时外向钾通道和内向整流钾通道三类。
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然而，你是否知道？有一篇论文，它的作者 当时还不太有名，刊登的杂志也不算顶级，可是论文发 表20年来，已神话般地被世界各地的科技工作者引用了 一万二千余次，遍及生物医学的众多领域，而且近年来 还在以平均每年约一千多篇的速度继续被引用，它就是 由Hamill，Marty，Neher，Sakmann和Sigworth等五人 于1981年发表在《欧洲生理学杂志》上的著名论文 <Improved Path-Clamp Technigues for HighResolution Current Recording from Cells and Cell-free Membrane Patches>。在此之前五年，身为 德国科学家的Neher和Sakmann共同发明了膜片钳技术 （1976），并于15年后共同荣获1991年诺贝尔 生理学 或医学奖。
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目
一、离子通道的概念 二、离子通道的分子结构 三、离子通道的分类 四、离子通道的研究技术 五、膜片钳实验方法 六、膜片钳改良模式及其它研究方法
录
Байду номын сангаас
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一、离子通道的概念
离子通道（ion channels）是镶嵌在细胞膜脂 质双分子层上的一种 特殊整合蛋白，在特 定情况下，形成具有 高度选择性的亲水性 孔道，允许适当大小 和电荷的离子以被动 转运的方式通过。
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三、离子通道的分类
◦非门控离子通道 ◦门控离子通道 ◦电压门控性通道 ◦化学门控性通道 ◦机械门控性通道
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1、非门控性离子通道
有些离子通道始终处于开放状态，离子可随时进出细胞， 并不受外界信号的明显影响，这些通道称为非门控离子通道。 如神经和肌肉细胞静息电位就是由于细胞膜上的离子通道允许 K+自由进出细胞，而引起的K+电化学平衡电位，此种K+通道即 属于非门控性离子通道。
钠离子通道（sodium channels，简称钠通道），是选择性 地容许Na+跨膜通过的离子通道。根据其对钠通道阻滞剂河豚毒素 （tetrodotoxin, TTX）和μ-食鱼螺毒素（μ-conotoxin,μ- CTX） 的敏感性不同分为神经类、骨骼肌类和心肌类钠通道三类。
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电压门控钙离子通道 钙离子通道（calcium channels，简称钙通道）是选择性容许 Ca2+跨膜通过的离子通道。根据肌细胞和神经元电压门控离子通道 对膜电位变化的敏感性，将神经元质膜电压门控钙离子通道分为T、 L及N三种类型，后来应用不同的毒素阻断钙电流的某种特定的成分， 在神经元又增加了P、Q和R型，共6型。