胶体金标记工艺汇总知识讲解

免疫金的特性

胶体金可以和蛋白质等各种大分子物质结合，在免疫组织化学技术中，习惯上将胶体金结合蛋白质的复合物称为金探针。用于免疫测定时胶体金多与免疫活性物质（抗原或抗体）结合，这类胶体金结合物常称为免疫金复合物，或简称免疫金（immunogold）。

胶体金与蛋白质结合的机制尚有十分清楚，一般认为是物理吸附性的。胶体金颗粒带有一层表面阴性电荷，与蛋白质表面的阳性电荷通过静电感应相附。因此环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，其他如胶体金颗粒的大小、蛋白质的分子量及蛋白质浓度等也会影响蛋白质的吸附。

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免疫金的制备

1．用0.2mol/LK2CO3或0.1mol/LHC1调节胶体金溶液的pH至选定值。原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为偏碱。但通常最适反应pH往往需经多次试验才能确定。在调节胶体金的pH值时应注意，胶体金会阻塞pH计的电极，不可直接将电极插入胶体金溶液中，宜先用终浓度为0.15的聚乙二醇（PEG，20000）稳定胶体金后，再调胶体金的pH 值。

2．将1/10体积的合适浓度的蛋白质溶液加于胶体金溶液中，放置室温反应2～5min。由于盐类成分能影响胶体金对蛋白质的吸附，并可使胶体金聚沉，因此待标记蛋白质溶液若含有较高的离子浓度，应在标记前先对低离子强度的蒸馏水透析去盐。

3．加入浓度为0.2％的PEG或BSA以饱和游离的胶体金。

4．离心分离，去除上清液中未结合的蛋白质。离心条件视胶体金颗粒的粒径而异：对5nm 金颗粒可选用40000r/min离心1h；8nm金颗粒用25000r/min离心45min；14nm金颗粒用25000r/min离心30min，40nm金颗粒用15000r/min离心30min。

5．轻吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的缓冲液悬浮，恢复原体积后再离心。如此洗涤2～4次。以彻底除去未结合的蛋白质。

6．免疫金复合物最终用稀释液配制成工作浓度保存。稀释液通常是加入稳定剂的缓冲液。

缓冲溶液常用中性的PBS或Tris缓冲液。

多种蛋白质、葡聚糖、PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂，PEG和BSA是最常用的稳定剂。稳定剂有两大作用：一为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存；二为防止或减少免疫金复合物的非特异性吸附反应。稳定剂的合理选择是十分重要的，不适当的稳定剂有时也会导致非特异性反应。

免疫胶体金制备

１、蛋白质的处理：由于盐类成分能影响金溶胶对蛋白质的吸附，并可使溶胶聚沉，故致敏前应先对低离子强度的水透析。必须注意，蛋白质溶液应绝对澄清无细小微粒，否则应先用微孔滤膜或超速离心除去。一般情况下应避免磷酸根离子和硼酸根离子的存在，因为它们都可吸附于颗粒表面而减弱胶体金对蛋白质的吸附。

２、蛋白质最适用量的选择：将待标记的蛋白质储存液作系列稀释后，分别取0.1ml(含蛋白质5～40ug)加到1ml 胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，5分钟后加入0.1 ml 10％NaCl 溶液，混匀后静置2小时，不稳定的金溶胶将发生聚沉，能使胶体金稳定的最适蛋白量再加10％即为最佳标记蛋白量。

３、标记：在接近并略为高于蛋白质等电点的条件下标记是比较合适的，在此情况下蛋白质分子在金颗粒表面的吸附量最大。

下述标记步骤最为常见：

①用0.1mol/L K2CO3 或0.1mol/L HCl 调节金溶胶至所需pH(标记SPA时调到pH6.0)。

②于100ml 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液（体积为2～3ml），搅拌2～3分钟。

③加入5ml 1％PEG20000 溶液。

④于10000～100000g 离心30～60 分钟（根据粒径大小选择不同离心条件），小心吸去上清液（切忌倾倒）。

⑤将沉淀悬浮于一定体积含0.2～0.5mg/ml PEG20000 的缓冲液中，离心沉淀后，再用同一缓冲液恢复，浓度以Ａ1cm/540nm=1.5 左右为宜，以0.5mg/ml 叠氮钠防腐，置4℃保存。

⑥包被后的金溶胶也可浓缩后于Sephadex G-200 柱进行凝胶层析分离纯化，以含0.1％B SA的缓冲溶液洗脱。通常用IgG 包被的金溶胶洗脱液pH 为8.2，以A蛋白包被的金溶胶洗脱液为pH7.0。

以上操作中应注意，一切溶液中不应含杂质微粒，可用高速离心或微孔滤膜预处理。

胶体金标记蛋白质的纯化

纯化的目的就是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金及在标记过程可能形成的各种聚合物。其纯化方法有超速离心法、色谱柱法以及以上二者相结合应用。

（一）超迷离心法

根据胶体金颗粒大小不同及蛋白质种类不同，离心的转速和时间也不同。用牛血清白蛋白稳定的胶体金标记羊抗兔IgG,可先从低速离心（20nm颗粒用250g;5nm用4800g20min），弃去聚集的金颗粒所形成的沉淀，然后将上清液5nm金标记物用60000g于4℃离心1h,20nm和40nm金标记物用14000g于4℃离心1h.小心地吸出上清，将管底沉淀再用1%牛血清白蛋白缓冲液混悬至原量，平衡过夜后，重复离心2次，最后一次洗涤离心的沉淀，再用1%牛血清白蛋白缓冲液（含0.02mol/LNaN3）稀释到l:20.40nm金颗粒在520nm检验吸光度为0.35;20nm金颗粒为0.30;5nm金颗粒为0.25,用1%牛血清白蛋白缓冲液作空白。制备的胶体金-蛋白探针可保存于4℃，如加入50%甘油可贮于0℃以下（-18℃）1年以上。

以聚乙二醇稳定的葡萄球菌A蛋白标记胶体金，按胶体金制备方法及所得颗粒大小不同，用不同离心转速分离纯化，以白磷还原法制备的5.0nm胶体金A蛋白，用125000×g离心；抗坏血酸法制备的11.3nm胶体金-A蛋白，用150000g离心45min,可见离心管底部附贴有小片紧密的沉淀，其上为较疏松的红色沉积物，再上为透明的上清液。附贴管底的沉淀无用，以后操作步骤中不要搅起来，仍保持其贴于管底。弃去上清液后，用等体积的0.0lmol/LPBS （pH7.2）溶解疏松红色沉积物，同上重复离心1次，小心移去上清液，剩余0.5ml上清液，将疏松红色沉积物溶解后，即为初步提纯的金标-A蛋白试剂。

（二）凝胶过滤法

凝胶过滤法必须以BSA为稳定剂。将前述胶体金-蛋白质复合物装入透析袋内，置硅胶中浓缩至原体积1/10左右，用蒸馏水冲洗软化透析袋后，取出浓缩液，以15000r/min离心15min （或用上述离心法纯化后的胶体金，再进一步用此方法纯化）。吸取上清液加到丙烯葡聚糖