圆孢蘑菇中抑菌活性物质的提取分离与含量测定
细菌分离提纯实验报告
细菌分离提纯实验报告细菌分离提纯是一项常见的实验技术，通过这项技术可以从混合菌液中分离出单一的、纯净的细菌菌落。
这项技术在生物学、医学、环境科学等领域都有广泛的应用。
细菌分离提纯的实验步骤主要包括：取样、制备稀释液、涂布平板、培养菌落、筛选菌落、鉴定细菌。
首先，取样是细菌分离提纯的第一步。
当我们需要分离某种细菌时，我们需要从含有该种细菌的样品中取样。
比如，我们可以从水样、土壤样、食品样、人体样等中取样。
然后，制备稀释液。
我们对取样物进行稀释，使得其中的细菌数目降到一定范围内，以便于后续的细菌分离。
通常我们会选择使用生理盐水、缓冲液等来制备稀释液。
接下来，将稀释液涂布在平板上。
我们通常会使用琼脂平板来进行细菌分离提纯实验。
将稀释液均匀涂布在琼脂平板上，然后用培养皿盖好，放入恒温培养箱中进行培养，通常在适宜的温度下进行培养24-48小时。
培养过程中，我们可以观察到平板上出现的不同形态的菌落。
可以根据菌落的形态、颜色、大小等特征来进行筛选。
一般我们会选择孤立的、圆形的、透明或者白色的菌落作为目标菌落。
当我们筛选出目标菌落后，我们需要进行鉴定。
通常我们可以根据细菌的生理生化特性、抗生素敏感性、分子生物学特征等来鉴定细菌的种属。
可以使用生理生化试剂盒、PCR技术、16S rRNA测序等方法进行鉴定。
最终，根据鉴定结果，我们可以获得目标细菌的纯种菌株。
这些纯种菌株可以用于进一步的实验研究，如基因克隆、发酵生产等。
细菌分离提纯实验需要注意以下几点。
首先，取样要注意无菌操作，避免采样器具的污染。
其次，涂布平板时要注意均匀涂布，以避免菌落的融合。
另外，培养过程中要注意恒温，避免细菌在高温或低温下死亡。
总之，细菌分离提纯是一项重要的实验技术，在微生物学研究中起到了至关重要的作用。
通过细菌分离提纯技术，我们能够从混合菌液中得到纯净的细菌菌落，为后续的实验提供了可靠的菌种资源。
这项技术的应用涵盖了多个领域，对于推动生物科学的发展具有重要的意义。
画眉草弯孢霉菌除草活性化合物的分离鉴定及其生物活性测定
画眉草弯孢霉菌除草活性化合物的分离鉴定及其生物活性测定画眉草弯孢霉菌除草活性化合物的分离鉴定及其生物活性测定第 33卷第 3期 Vol. 33 No. 3植物保护学报2006年 9 月 Sep t. 2006ACTA PHYTOPHYLAC ICA SI N ICA画眉草弯孢霉菌除草活性化合物的分离鉴定及其生物活性测定1, 2 13 1姜述君强胜朱云枝1.南京农业大学杂草研究室 ,南京 210095;2.黑龙江八一农垦大学植物科技学院 ,大庆 163319摘要 : 为了分离鉴定马唐 D igitaria sanguinalis L. Scop生防菌画眉草弯孢霉 Cu rvularia eragrosti2dis菌株 QZ22000的生物活性物质以及评价该物质是否具有作为生物源除草剂的潜力 ,利用生物测定为导向的色谱分离、质谱和核磁共振波谱技术对该菌分泌的毒素进行了分离和鉴定 ,利用种子萌发、胚根和芽生长的抑制及离体叶片针刺法测定了该毒素对马唐的毒害作用 ,并测定了毒素的专化性及毒素对马唐叶绿素含量的影响。
结果表明 ,该化合物为桔黄色晶体 ,熔程为 225~227?,经质谱和 NMR数据分析确定该化合物分子式为 C H O ,并确定为长孺孢素 helm inthosporin。
该毒15 10 5素在150μg/mL浓度下 ,对马唐胚根生长抑制率达 44. 59% ;当毒素浓度达到200μg/mL时 ,叶绿μ素含量下降 18. 41% ;在 500 g/mL浓度下 ,毒素对供试的 23种杂草产生的毒害程度不同 ,其中小藜对毒素最为敏感 ,其次为马唐、 ?蓄、 ?草、藜和日本看麦娘等恶性杂草。
在供试的 5种作物中大豆、棉花和番茄对毒素不敏感 ,但玉米和小麦则较为敏感。
上述结果表明 , 长孺孢素作为大豆和棉花田苗后生物源除草剂有一定的开发潜力。
关键词 : 画眉草弯孢霉 ; 长孺孢素 ; 抗生素 ; 马唐 ; 除草活性Isola tion, pur if ica tion, iden tif ica tion, and b ioa ssay of helmin thospor inw ith herb ic ida l activ ity from C u rvu la ria eragrostidis1, 2 13 1J I ANG Shu2jun Q I ANG Sheng ZHU Yun2zhi1. W eed Research Laboratory, Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095, China; 2. HeilongjiangAugust First Land Reclamation University, Daqing 163319, Heilongjiang Province, China1 13Abstract: The bioassay2guided column chromatography and TLC onsilica gel, and MS, H2 and C2NMR spectral techniques were used to isolate and determ inate the structure of antibiotic from Curvula riaeragrostidis QZ22000, and to evaluate its herbicidal activity. The herbicidal activity of the toxin to D. san2guinalis was tested by seed germ ination, the elongation of root and shoot. The needle puncturing leaf as2say techniques were used to test the specificity and effect of toxin on photosynthetic p igment content of D.1 13sanguinalis. MS, H2and C2 NMR spectral data indicated that the toxin is helm inthosporin. The meltingpoint of the toxin is 225 - 227?, and the molecular formula is C H OThe toxin had inhibitory effect15 10 5on el ongation of D. sanguinalis root. A t 150μg/mL concentration, the inhibition of the toxin to root elon2gation reached 44. 59%. Helm inthosporin showed impact on photosynthetic p igment content of D. sangui2μnalis leaf. W hen the concentration of toxin reached 200 g/mL, the chlorophyll content of D. sanguinalisleaf decreased by 18. 41%. Twenty three troublesome weeds and five crop s were tested to study specificity基金项目 :国家高技术研究发展计划“863” 项目 2001AA246012 ,国家自然科学基金项目 30170164资助作者简介 :姜述君 ,男 , 1968年生 ,博士研究生 ,主要从事植物学和杂草生物防除研究,email:***************3 通讯作者Authorforcorrespondence,email:************.cn, Tel*************收稿日期 : 2005 - 08 - 30314 植物保护学报 33卷of helminthosporin. The result showed that 18 out of the 28 species were susceptible to the toxin. Chenopodiumserotinum is the most suscep tive, and D. sangu ina lis, Polygonum avicu lare, B eckm annia syzigachna,Chenopod ium album and A lopecurus japonicus took second p lace. Soybean, cotton, tomato, Am aranthusμretroflexus and Ech inochloa crus2galli were resistant to toxin at 500 g/mL concentration. Helm inthospor2in p roduced by C. eragrostidis QZ22000 could be developed as a biocontrol agent for weed control in soy2bean and cotton fields.Key words: Curvularia eragrostidis; D igitaria sanguinalis; helminthosporin; antibiotic; herbicidal ac2tivity虽然化学除草剂在杂草的治理中发挥了重要作洗脱。
实验三香菇多糖的分离提取
实验三香菇多糖的分离提取实验三香菇多糖的分离提取一、实验目的让学生了解香菇多糖的理化性质及提取工艺流程，掌握真空浓缩技术。
二、实验原理香菇是一种药食两用真菌，具有提高免疫力、抗癌、降糖等多种生理功能。
水溶性多糖作为香菇主要活性成分之一，主要以β-1,3-葡聚糖的形式，分子量从几万到几十万不等。
通过有机溶剂提取，真空浓缩技术进行分离提取。
三、实验材料与试剂原料：干香菇500g试剂：氯仿、正丁醇、医用纱布、浓硫酸、苯酚、工业酒精四、实验仪器组织捣碎机、水浴锅、旋转蒸发器、1cm比色皿、751分光光度计、电子天平、台式离心机、试管、量筒、烧杯、玻璃棒五、提取工艺流程1. 1kg干香菇切成小块，以1：10（重量比）加入水，用组织捣碎机进行均质；2. 取200mL均质液放入1L烧杯中，再加入300mL蒸馏水，加热至沸后，温火煮沸1小时，（注意：煮沸过程中用玻璃棒不断搅拌，以免烧杯底部发生糊结；并间歇加入少量水，使杯内液体体积保持在500mL左右；3. 加热完毕后，将杯内液体用8层纱布过滤，除去残渣，上清液转入另一烧杯中；4. 将上清液倒入圆底烧瓶中，在旋转浓缩仪上进行浓缩，浓缩条件为-0.1MPa 、60℃，浓缩液体积至100mL左右停止；5. 将浓缩液在1×10000g离心10min，将上清液转入另一烧杯，除去残渣；6. 上清液中加入等体积的氯仿正丁醇浓液（体积比为4：1），搅拌5min，静置30分钟；7. 将混合液体在1×5000g下离心20min,分离水相；8. 在水相中加入终浓度为80%的酒精，搅拌均匀，静置20min，1×5000g下离心10min；9. 取出沉淀物，放入已称重的干燥表面皿中，在真空干燥箱中80℃下真空干燥；10. 干燥后，称重，计算多糖的产率；11. 准确称取干燥后多糖20mg于500ml容量瓶中，加水定容；12. 取定容液2ml加入6%苯酚1ml，混匀，再加入浓硫酸5ml，混匀，放置20min后，于490nm测吸光度；13. 葡萄糖标准曲线的制定：准确称取葡萄糖20mg定容于500ml 容量瓶中，分别取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6及1.8ml，补水至2ml，依12步骤反应液，并分别测吸光度，根据葡萄糖浓度和吸光度绘制标准曲线；14. 根据香菇多糖吸光度和葡萄糖标准曲线，计算多糖纯度。
五种常用菌-抑菌活性的测定
五种常用菌-抑菌活性的测定五种常用菌-抑菌活性的测定基础材料：18×180试管200 μL枪头LB固体培养基打孔器1000 μL枪头LB液体培养基1000 μL移液枪无菌牙签无菌水200 μL移液枪无菌平板0.9%生理盐水涂布棒接种环酒精灯菌种及培养基：常用五种菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、假单胞杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌LB固体培养基：10 g胰蛋白胨+5 g酵母浸粉+10 g氯化钠+15 g琼脂粉+1 L蒸馏水LB液体培养基：10 g胰蛋白胨+5 g酵母浸粉+10 g氯化钠+1 L 蒸馏水实验步骤：一、准备阶段（材料灭菌）取洁净锥形瓶，配制LB液体培养基，磁力搅拌器加速溶解，另取洁净锥形瓶，配制LB固体培养基，在LB液体培养基基础上添加琼脂粉即可，锥形瓶需要加塞（棉塞）后用牛皮纸/报纸（4层）包扎。
取数支18×180试管，将混匀的LB液体培— 1 —养基分装进试管，每管10 mL，加塞（试管塞），另取数支18×180试管，每管装入9 mL 9%的生理盐水，加塞。
准备足量两种型号的枪头，装入枪头盒中用牛皮纸/报纸包扎。
准备一瓶无菌水，同样锥形瓶加塞包扎。
最后再将足量平板装入平板桶或牛皮纸/报纸包扎。
上述物品一同121℃高压灭菌20 min，取出备用。
二、活化细菌灭菌完毕，瓶中LB固体培养基的琼脂在冷凝后分布不均匀，使用前需要用电热套或电热炉，将LB固体培养基加热至完全融化并沸腾后使用，沸腾后将锥形瓶移走并轻轻摇匀，待气泡消失，继续加热沸腾，累计三次。
超净工作台使用前需要紫外杀菌30min，材料（除菌外）也需要一同进行紫外照射，将沸腾过三次的LB固体培养基冷却至手可握住的温度，用75%酒精喷洒消毒后放入超净台中，并趁热倒入灭菌后的平板里，待平板冷凝后，将保藏的五种菌分别接种（四区划线）于LB固体培养基上，放置于37℃的培养箱中培养。
挑取长势优良的单个菌落，接种至已灭菌的LB液体培养基试管中，震荡均匀，于37℃恒温箱中培养8-12 h，采用比浊法（如大肠杆菌，根据600nm下吸光值判断近似浓度）判断浓度，如果培养过度，可用9%的生理盐水稀释菌悬液浓度至含菌体约1×106 CFU/mL，备用。
实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法
实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法work Information Technology Company.2020YEAR实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法一、实验目的学习并掌握杀菌剂的离体活性测定方法——抑菌圈法。
二、实验原理抑菌圈法即水平扩散法基本原理是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使之接触培养基和病菌，经定温培养一定时间后，因药剂的渗透扩散作用，施药部位周围因杀死了病菌而抑制了其在培养基上的生长，从而产生了抑菌圈。
在一定范围内，抑菌圈直径的平方或面积与药剂浓度的对数呈直线函数关系，从而可比较供试样品杀菌活性大小。
其最大优点是精确度高，操作简单，能较快得出结果。
但测定结果受药剂溶解性和扩散能力影响很大，具一定局限性。
根据药剂施加在琼脂培养基表面方式不同，又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法、滴下法等，其中以管碟法和滤纸片法应用最广。
三、实验材料供试药剂：速克灵或扑海因。
供试病原菌：番茄灰霉病菌。
实验器材：无菌水、无菌接种针、灭菌三角瓶、玻璃珠、灭菌双层纱布、75%酒精棉球、消毒摄子、移液管、试剂瓶、吸耳球、超净工作台、胶头滴管、尺子。
四、实验方法采用管碟法。
将供试药剂加于放置在琼脂培养基表面的用不锈钢制成的小圆筒（又称为牛津杯，一般为外径8 mm，内径6 mm，高10 mm）内，定温培养一定时间后测量抑菌圈大小。
1．配制药液：用灭菌蒸馏水将供试药剂配成一系列梯度浓度，一般5-7个浓度。
灭菌蒸馏水为对照。
2．制备一定“浓度”的供试菌悬浮液：如真菌，则宜用孢子悬浮液。
在培养好的菌种上倒入10 mL灭菌水，用接种针轻轻刮动平面孢子悬浮，倾于灭菌三角瓶内（事先装数粒玻璃珠）摇动5 min，将孢子悬浮液用灭菌双层纱布过滤入另一灭菌三角瓶内。
用低倍（15×20倍）显微镜检查，调节孢子浓度，每视野80-100个孢子为宜；以上操作应在无菌条件下进行，动作要迅速准确。
食品中抗菌活性物质的分离与鉴定研究
食品中抗菌活性物质的分离与鉴定研究随着人们对食品安全的关注不断提高，食品中抗菌活性物质的研究也日益重要起来。
这些抗菌活性物质可以有效地抑制或杀死食品中的有害菌群，从而保证食品的质量和安全。
一、食品中抗菌活性物质的分类与来源食品中的抗菌活性物质主要分为天然抗菌物质和合成抗菌物质两种。
天然抗菌物质包括植物提取物、动物源抗菌物质以及微生物发酵产物等。
植物提取物中常见的抗菌活性物质有黄酮类化合物、甲醛、茶多酚等；动物源抗菌物质则包括酶、胆固醇等成分；微生物发酵产物中的抗菌物质主要是利用微生物代谢产生的酸、醇等物质。
二、食品中抗菌活性物质的分离方法分离和提取食品中的抗菌活性物质是开展抗菌活性物质研究的重要环节。
常用的分离方法包括溶剂萃取、柱层析、高效液相色谱和气相色谱等技术。
溶剂萃取是最常见的提取方法，通过选择合适的溶剂将食品中的抗菌物质溶解并提取出来。
柱层析则可以进一步纯化抗菌物质，通过不同化学性质的柱填料来实现分离。
高效液相色谱和气相色谱则可以对分离后的物质进行进一步的定性和定量分析，从而确定抗菌物质的结构和含量。
三、食品中抗菌活性物质的鉴定方法确定食品中抗菌活性物质的结构和性质是研究的关键之一。
常用的鉴定方法包括质谱、核磁共振、红外光谱等。
质谱技术可以通过对化合物的质荷比进行分析，确定其分子量和分子结构。
核磁共振技术则可以对化合物的核自旋进行分析，确定其结构和功能基团。
红外光谱则可以通过测定化合物的特征吸收峰，判断其化学键和官能团的存在。
四、食品中抗菌活性物质的应用前景食品中的抗菌活性物质不仅可以用于食品保鲜和防腐，还可以应用于食品加工和生产中。
例如，将抗菌活性物质添加到面包、牛肉干等食品中，可以有效地抑制食品中的细菌滋生，延长食品的保质期。
此外，食品中抗菌活性物质还可以用于制备食品包装材料，通过包装材料本身的抗菌特性来保护食品的安全。
总之，食品中抗菌活性物质的研究对保障食品安全和提高食品质量具有重要意义。
香菇 香菇多糖 提取 纯化 检测 含量测定及表征
5
三．地理分布
生态环境：冬春季生于阔叶树倒木上,群生,散生或单
生。 分布地区：山东、河南、浙江、福建、台湾、广东、 广西、安徽、湖南、湖北、江西、四川、贵州、云南、 陕西、甘肃。
6
四．市场分布
随着人们生活水平的不断提高、交流不断广泛，香菇
的营养价值逐步全球人们所熟知并喜爱，近几年来全 国范围内广大农户开始大规模种植，很多地区充分利 用自身的有力天然自然条件广泛的种植香菇，逐步形 成规划化生产，通过农户合作，公司集中收购，统一 销售的方式经行对外推广，全国最大香菇生产种植基 地是河南的西峡和卢氏，西峡是最大的香菇种植基地， 卢氏是全国香菇品质最好的种植地，卢氏拥有得天独 厚的自然条件它不仅孕育了卢氏黑木耳，而且香菇鲜 美品质也逐步得到市场的广泛认可并出口海外，卢氏 县成规模的香菇生产公司如卢氏绿之源特产有限公司， 其充分利用卢氏天然的自然条件和政府支持，发展规 划越来越大，其产品已经出口韩国、日本等国家。
22
金属络合物法: 常用的络合剂有费林溶液、氯化铜、氢氧化钡和醋 酸铅等; 层析法: 有纤维素柱层析、纤维素阴离子交换树脂柱层析、 凝胶柱层析，高压液相柱层析； 超滤法； 制备性区域电泳法[13].
平菇菌丝体中SOD提取方法初探
－ ２７－
ＣＨＩＮＥＳＥ ＨＯＲＴｌＣＵＬＴＵＲＥ ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ
处 测定 吸光度 值 ，每 隔 ３０ Ｓ测 定 １次 ，测定 ４ ｍｉｎ
（２）样品中蛋白质含量测定 ：取待测样品溶液 １ ｒｎｌ，
内每 分钟光吸收值 的变化 ，要求 自氧化 速率控制在每 加 入 ５ ｍｌ考马斯亮蓝溶液 ，震荡混匀 ，２ ｍｉｎ后于
为 ＳＯＤ粗提液 ，测定 ＳＯＤ活性及蛋 白含量。
平菇 ，市购 。
（３）乙醇 一氯仿法 ：称取 １ ｇ平菇菌丝体 ，分别
１．２ 主 要 试 剂
加入 ８ ＩＩ１ｌ ０．２ ｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＨＣＯ３溶液和 ６ ｍｌ乙醇一氯
１．２．１ ５０ ｎｌｎｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液 （ｐＨ值 ８．０）（１ ０００ ｍ１） （１）取 １７．９０７０ ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４·１２Ｈ２０定容至 ｌ ０００ ｍｌ； （２）取 １．９５０１ ｇ Ｎａｉｌ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ定容至 ２５０ ｍｌ。用 （２）滴定 （１）ｐＨ至 ８．０即为 ５０ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液 。
１ 材料与方法
置摇床 ２００ ｒ／ｍｉｎ、８℃培养 ７ ｄ直至菌液清亮透 明； 收集 菌丝体 ，经去离子水洗涤后 以 １ ０ ０００ ｒ／ｍｉｎ的 速度 离心 ２０ ｍｉｎ，去 除上清液 ，晾干称重。 １．３．２ 提 取 方 法 （１）直 接法 ：收 集晾 干 的平菇 菌丝体 ，加 入 ３倍 体积 的磷酸 缓冲液 （２０ ｍｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ值 ７．８，含 ０．１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ），置于液 氮中研 磨 ，使 ＳＯＤ 充分溶解 到缓冲液 中 ，然后用 离心机在 １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ下 ４￣Ｃ离心 １５ ｍｉｎ，弃沉淀 ，取上清 液即为粗酶液 ，测定 ＳＯＤ活性及 蛋白含量。
双孢蘑菇菇柄中多糖、核酸等成分的提取利用
双孢蘑菇菇柄中多糖、核酸等成分的提取利用摘要:废弃的双孢蘑菇菇柄富含多糖、核酸等活性物质,应获得更好的开发利用。
本文就改进食用菌多糖的提取纯化工艺和简化核酸类物质的提取纯化工艺,采用膜分离技术,获得较高纯度的多糖产品、核酸产品进行了探索。
关键词:双孢蘑菇菇柄多糖核酸成分提取双孢蘑菇在食品加工生产上一般都去除菇柄,据测算,菇柄约占全菇干重的10%～20%,再加上残次菇及采收时废弃的菇柄,全国每年约有五万吨菇柄被废弃。
事实上,菇柄的组分与菌盖相似,其中含有丰富的多糖、核酸和膳食纤维素等活性物质,这是极其巨大的资源浪费。
为更好地开发利用双孢蘑菇菇柄的功能性成分,深入发掘其药用保健价值,开发相应的下游产品,本文就如何对双孢蘑菇菇柄中的多糖、核酸类物质等功能性成分进行提取分离,获得较高纯度的多糖产品、核酸产品作一些探讨。
1 双孢蘑菇多糖、核酸等功能性成分的提取提取方法比选我们分别采用传统水提法,冻融法,超声波法和综合法(即将冻融法与超声波法结合)对双孢蘑菇子实体进行可溶性多糖的提取,测定提取液中可溶性固形物、多糖、核酸等的含量。
综合比较4种方法的多糖提取率,确定最佳生产工艺。
根据试验对比分析,几种方法的提取液中可溶性固形物、多糖、核酸量的含量如下表所示。
综合法多糖等物质得率最高、纯度也高,但工艺复杂,工业化成本太高。
水提法操作简单,但是多糖的提取率不是很高,原料利用率较低。
且该法在较高温度下进行,易使多糖变性。
冻融法和超声波法都可在较低温度下进行,多糖的生理活性受到较好的保护。
比较而言,此二法提取个多糖也明显高于水提法,这是因为此二法都能有效促进细胞壁的破裂,加速多糖及其他营养物质的溶出。
从生产方面考虑,超声波法方便清洁,能大大缩短生产时间和提高产品得率,优于冻融法。
所以生产上首先选择超声波法。
双孢蘑菇菇柄功能性成分不同提取方法的对比2 超滤膜分离纯化多糖与核酸及对多糖相对分子质量的分布测定经超声波法提取的水提液先用木瓜蛋白酶把其中的部分高分子蛋白质水解成为较低分子量的蛋白质、多肽、低肽及氨基酸,离心得酶解液。
食用菌组织分离法实验报告
食用菌母种的制作——组织分离法实验报告实验目的：学习和掌握食用菌的组织分离法；一、实验原理：食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。
利用食用菌子实体内部组织进行分离，是获得母种最简便的方法。
二、实验器材：1. 食用菌：香菇、平菇。
2. 培养基：PDA培养基斜面。
3. 仪器或其他用具：75%酒精棉球、接种针记号笔等。
三、实验方法：1. 选择种菇：选择肥壮菇体作种菇；2. 种菇消毒：取1张菇片，用70%的酒精轻擦表面进行消毒；3. 菇肉接种：将菇片纵向撕开，在每个裂面靠近菇柄与菌盖的交界处取一米粒大小的菇肉组织接于PDA试管斜面上；4. 培养：将试管斜面置于15～30℃下培养；五、注意事项1. 在整个操作过程中都要注意无菌操作，一切用具都要消毒。
2. 要等刀片冷却后再切取组织块。
六、实验结果与记录第一次实验：10月16日上午进行接种，两试管都以肥壮的双孢菇为种菇，10月13日观察培养基杂菌没有菌落产生结果分析：本次实验全班只有一人成功，大部分都被杂菌污染，最有可能的原因就是制作的PDA培养基本身受到污染，但是又有培养基根本没有菌落产生，那么一方面可以看做是空白对照，得到培养基本身没有问题而是我们操作都有问题，没有做到避免污染，规范的无菌操作，另一方面也有可能是在接种过程，接种针，试验刀酒精灯上灼烧后未冷却直接接触种菇，使待接种的菌块高温致死。
第二次实验：10月30日上午进行接种，记号笔标记的两支试管为双孢菇，标签纸标记的两只试管为香菇进行实验，10月9日观察实验基本成功，试管下端有少部分红棕色杂菌实验成功，无杂菌，斜面上均为雪白的菌丝无杂菌，也无目的菌落结果分析：培养基本身无污染，接种香菇菌块的过程中可能由于接种针和实验刀未完全冷却导致目的菌块高温致死，培养基上无菌落产生。
接种双孢菇菌块过程中基本做到了无菌操作，实验较为成功。
实验感想：本实验原理目的简单，操作过程方法在微生物学中也有接触，但是容易杂菌污染，第一次实验结果几乎全军覆没，几乎所有培养基都受到了污染，第二次实验在总结前一次的基础上，大部分做到了无菌操作，看到了培养基中雪白的菌落。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
2019年5月
第42卷第3期
湖南师范大学自然科学学报JournalofNaturalScienceofHunanNormalUniversityVol．42No．3May，2019
DOI：10．7612/j．issn．2096－5281．2019．03．010
圆孢蘑菇中抑菌活性物质的提取分离与含量测定
王怡1，2，廖志明1，姚政1，林鹏程
1，2，3*
（1．青海民族大药学院，中国西宁810007；2．青藏高原植物资源化学研究重点实验室，中国西宁810007；
3．青海省药物分析重点实验室，中国西宁810007）
摘要为研究圆孢蘑菇中具有抑菌活性的小分子化合物，建立圆孢蘑菇中其含量的测定方法。采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20和高效液相色谱等分离纯化技术，结合波谱数据分离出圆孢蘑菇中具有抑菌活性的小分子化合物没食子酸，同时利用HPLC法测定其在圆孢蘑菇中的含量为0．5664mg·g－1
。此方法简便、准确，可用于圆孢
蘑菇的质量控制。关键词圆孢蘑菇；没食子酸；抑菌活性；高效液相色谱法；含量测定中图分类号S646．11文献标识码A文章编号2096-5281（2019）03-0070-05
IsolationandContentDeterminationofAntimicrobialConstituentofinAgaricusgennadii
WANGYi1，2，LIAOZhi-ming1，YAOZheng1，LINPeng-cheng1，2，3*（1．DepartmentofPharmacy，QinghaiUniversityforNationalities，Xining810007，China；2．KeyLaboratoryofPlantＲesourcesofQinghai－TibetPlateauinChemicalＲesearch，Xining810007，China；3．KeyLaboratoryofPharmaceuticalAnalysisinQinghaiProvince，Xining810007，China）
AbstractTostudytheantibacterialactivityofsmallmolecularcompoundsintheAgaricusgennadii，amethodforthedeterminationofitscontenthasbeenestablishedinthiswork．Separationandpurificationtechniquessuchassilicagelcolumnchromatography，SephadexLH-20andhighperformanceliquidchromatographywereem-ployedtoisolategallicacidandothersmallmolecularcompounds．Enperimanfalresultsshowthatthecontentofgal-licacidwithantibacterialactivitywas0．5664mg·g－1
intheAgaricusgennadi．Thismethodissimpleandaccurate
andthusitcanbeusedforthepurposeofqualitycontrolforAgaricusgennadi．KeywordsAgaricusgennadii；gallicacid；antibacterialactivity；HPLC；contentdetermination
圆孢蘑菇Agaricusgennadii属伞菌目蘑菇科蘑菇属（Agaricus），别名“圆孢托柄蘑菇”［1］，多生长在新疆西部及西南部地区［2］。国内外学者已经发现同属中姬松茸具有抗炎和抗菌［3，4］、抗氧化［5］、抗肿瘤［6］、抗辐
射及美白［7］等活性。但同属中的圆孢蘑菇Agaricusgennadii的化学成分研究尚处在空白中，故笔者试图对
圆孢蘑菇的小分子化学成分进行研究，以确定抑菌活性的成分，为下一步研究其抗肿瘤活性奠定基础。
*收稿日期
：2019-03-13
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81760783）；青海省自然科学基金资助项目（2018-ZJ-919）；青海省创新平台建
设专项（2017-ZJ-Y19）*通信作者，E-mail：qhlpc@126．com王怡等：圆孢蘑菇中抑菌活性物质的提取分离与含量测定
本文采用硅胶柱色谱、SephadexLH-20和高效液相色谱等分离纯化技术，确定具有有效抑菌活性的小分子化学物为没食子酸。没食子酸又名棓酸、五倍子酸，是重要的多酚类化合物［8-11］，其酯类化合物作为抗氧
化剂被广泛应用于食品、制药及轻工等行业［12］。本实验采用高效液相色谱法测定圆孢蘑菇中没食子酸的含
量为0．5664mg·g－1
。抑菌活性试验结果表明，没食子酸对细菌有较强的抑制活性，对白色念珠菌也有一定
的抑制活性。
1材料与方法
1．1材料
圆孢蘑菇于2017年10月采自青海省诺木洪乡（北纬97．44°，东经36．01°，海拔2680m）。由青海民族大学林鹏程教授鉴定为圆孢蘑菇Agaricusgennadii，样品编号（20171022），标本现存于青海民族大学药学院
实验室。1．2仪器与试剂
旋转蒸发仪BúchiＲotavaporＲ-215；SephadexLH-20（瑞典AmershamPharmacia公司）；CombiFlashＲT200UV/VIS中压快速制备色谱仪（美国TELEDYNE公司）；AgilentHP1200型高效液相色谱仪。
95%乙醇；柱层析硅胶（青岛海洋化工厂）；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇均为分析纯。供试菌株见表1。
表1供试菌种汇总Tab．1Summaryoftestedstrains序号名称学名批号1肺炎克雷伯氏菌KlebsiellaPneumoniaeCMCC（B）461172乙型溶血性链球菌Streptococcushemdytis-βCMCC（B）322103金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCMCC（B）260034枯草芽孢杆菌
BacillussubtilisCMCC（B）63501
5藤黄微球菌MicrococcusluteusCMCC（B）280016乙型副伤寒沙门菌SalmonellaparatyphyBCMCC（B）500947铜绿假单胞菌PseudomonasaeruginosaCMCC（B）101048大肠埃希菌EscherichiacoliCMCC（B）441029蜡状芽孢杆菌BacilluscereusCMCC（B）6330110白色念珠菌CandidaalbicansCMCC（F）9800111黑曲霉AspergillusnigerCMCC（F）98003注：以上菌株均购买于中国医学微生物菌种保藏管理中心2实验方法与结果
2．1分离纯化
取新鲜圆孢蘑菇1kg粉碎后得到粉末，用3×10L乙醇（95%）加热回流3h，浓缩得乙醇粗浸膏84．6g；再将乙醇粗浸膏分散于800mL水中，依次用石油醚（2L）、乙酸乙酯（2L）和正丁醇（2L）萃取，得到石油醚提取浸膏11g、乙酸乙酯提取浸膏7g、正丁醇提取浸膏60g。经抑菌活性筛选后，用AgilentZorbaxSB-CN半制备柱分离纯化从正丁醇浸膏中分离得到抑菌活性小分子化合物0．25g。2．2结构鉴定
白色针晶；EI-MSm/z（%）：171［M+H］+；1H-NMＲ（500MHz，CDCl3）：7．15（2H，s，H-2，6），7．60（2H，s，3，5-OH），7．28（1H，s，4-OH），12．10（1H，s，1-COOH）；13C-NMＲ（100MHz，CDCl
3）：123．1（s，C-1），114．3（d，C-2，
6），146．0（s，C-3，5），139．4（s，C-4），170．6（s，COOH），数据与文献［13］报道一致，鉴定为没食子酸。
2．3含量测定
2．3．1色谱条件色谱柱：AgilentZorbaxSB-CN柱（250mm×4．6mm，5μm）为色谱柱，流动相为甲醇-水系
统，选择流速1．0mL/min，检测波长为254nm，柱温35℃，进样量10μL［14］。在上述条件下，达到较好的分
17第3期离，Ｒ＞1．5。色谱图见图1。
图1没食子酸标准品的HPLC图和圆孢蘑菇样品的HPLC图Fig．1HPLCchromatogramofgallicacidstandardandAgaricusgennadiisample2．3．2溶液制备对照品溶液制备：用十万分之一电子天平精密称取没食子酸2．68mg，用蒸馏水定容至10
mL容量瓶中作为标准储备液。供试品溶液制备：精密称取0．2g干燥圆孢蘑菇子实体样品粉末（已过0．38mm筛），精密加入10mL
60%的乙醇溶液，于65℃热水中超声提取1h，摇晃均匀，过滤，所得液体为供试品溶液。2．3．3标准曲线的制备精密移取“2．3．1”项储备液6mL于50mL容量瓶中，得对照品母液。分别取10，5，2．5，1．0，0．5和0．25mL上述母液，分别定容于10mL容量瓶中，得到一系列不同浓度的混合对照品溶液。将上述不同浓度的混合对照品溶液以“2．3．1”色谱条件各进样10μL，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。计算得出回归方程为：Y=38805X+2．9386（Ｒ=0．9998）。2．3．4精密度实验精密吸取10μL“2．3．2”项下的对照品溶液，按“2．3．1”项下色谱条件，重复进样6次并
测定色谱峰的峰面积，计算相对标准偏差ＲSD%。结果表明没食子酸峰面积ＲSD为0．17%。2．3．5稳定性实验精密吸取10μL“2．3．2”项下的供试品溶液，并按“2．3．1”项下色谱条件，分别在0，2，4，6，8，10，12h时进样，测定各色谱峰面积，根据峰面积的变化，确定供试品溶液在12h内的稳定性，以峰面积
积分值为指标计算ＲSD值，结果没食子酸的色谱峰峰面积ＲSD为2．55%，表明供试品在12h内稳定。2．3．6重复性实验称取6份圆孢蘑菇子实体干燥粉末，每份大约0．2g，依据“2．3．2”项下的方法制得供试
品溶液，按“2．3．1”项下色谱条件，计算得出没食子酸的峰面积ＲSD为0．41%。2．3．7加标回收率实验精密称取已知对照品含量的圆孢蘑菇子实体粉末0．1g，分别添加圆孢蘑菇子实体
中对照品含量的80%，100%和120%的对照品［15］。该试验分为3组，每组3份。以“2．3．1”色谱条件操作，每
次进样10μL，最终得到对照品的回收率。结果见表2，表明分析误差和操作过程中的损失少，该实验方法可靠。表2被测组分在样品中的加标回收率实验（n=9）Tab．2Thestandardadditionrecoveryexperimentsofcomponents（n=9）对照品编号样品含量/mg加入量/mg测定量/mg回收率/%平均值/%ＲSD/%