ssr分子标记技术及其在玉米种子鉴定上的应用
基于SSR标记的山西玉米自交系的核心种质构建
㊃问题探讨㊃收稿日期:2021-04-13基金项目:山西省重点研发计划项目 基于分子组配的玉米杂种优势利用及品种选育 (201803D221017-4)㊂作者简介:李 锐(1974 ),男(汉族),山西静乐人;本科,副研究员,主要从事作物分子育种研究(E -m a i l :131********@126.c o m )㊂通讯作者:白建荣(1961 ),女(汉族),山西五台人;博士,研究员,主要从事作物分子育种研究(E -m a i l :139********@126.c o m)㊂基于S S R 标记的山西玉米自交系的核心种质构建李 锐1, 尚 霄2, 尚春树2, 常利芳1, 闫 蕾1, 白建荣1(1.山西农业大学农学院, 太原030031; 2.山西强盛种业有限公司, 太原030031)摘 要:以224份山西玉米自交系为材料,采用多次聚类结合优先取样法构建了包含68份种质的核心种质㊂经过对以S S R 标记8次抽样比例形成的候选核心种质进行分析,30.36%为构建核心种质的最佳抽样比例㊂核心种质㊁原始种质及保留种质的4个遗传参数t 检验结果表明,该核心种质最大程度代表了原始种质的遗传多样性,同时保留种质也保留了原始种质的遗传多样性㊂构建的核心种质将有利于育种人员对育种材料的评价㊁保存㊁研究和在育种中的有效利用㊂关键词: 玉米;自交系;核心种质;山西D O I : 10.16590/j .c n k i .1001-4705.2021.09.072中图分类号: S 513 文献标志码: A 文章编号: 1001-4705(2021)09-0072-05C o r eG e r m pl a s m C o n s t r u c t i o no f S h a n x iM a i z e I n b r e d L i n eB a s e do nS S R M a r k e r sL IR u i 1,S H A N GX i a o 2,S H A N GC h u n s h u 2,C H A N GL i f a n g 1,Y A NL e i 1,B A I J i a n r o n g 1(1.C o l l e g e o fA g r i c u l t u r e ,S h a n x iA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,T a i yu a n030031,C h i n a ;2.S h a n x iQ i a n g s h e n g S e e dC o .L t d ,T a i yu a n030031,C h i n a )A b s t r a c t :U s i n g 224S h a n x im a i z e i n b r e d l i n e s a sm a t e r i a l s ,t h e c o r e g e r m p l a s mc o n t a i n i n g 68g e r m -p l a s m sw a s c o n s t r u c t e db y m u l t i p l e c l u s t e r i n g a n d p r e f e r e n t i a l s a m p l i n g me t h o d .T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t 30.36%w a s t h eb e s t s a m p l i n g r a t i of o r t h e c a n d i d a t e c o r eg e r m p l a s m sb a s e do n th ea n a l y si so f t h e c a n d i d a t e c o r e g e r m p l a s m sa c q u i r e db y 8t i m e ss a m p l i n g r a t i ob y SS R m a r k e r s .T h er e s u l t so f T -t e s t f o r f o u r g e n e t i c p a r a m e t e r so f c o r e g e r m p l a s m ,o r i g i n a l g e r m p l a s m a n dr e s e r v e d g e r m p l a s m s h o w e d t h a t t h ec o r e g e r m p l a s mr e p r e s e n t e dt h e g e n e t i cd i v e r s i t y o f t h eo r i g i n a l g e r m pl a s mt ot h e g r e a t e s t e x t e n t ,w h i l e t h e r e s e r v e d g e r m p l a s ma l s o r e t a i n e d t h e g e n e t i c d i v e r s i t y o f t h e o r i g i n a l g e r m -p l a s m.I naw o r d ,t h e c o n s t r u c t e d c o r e g e r m p l a s m w i l l b eb e n e f i c i a l t o t h e e v a l u a t i o n ,pr e s e r v a t i o n ,r e s e a r c ha n de f f e c t i v eu t i l i z a t i o no f b r e e d i n g m a t e r i a l s .K e y w o r d s : m a i z e ;i n b r e e d l i n e s ;c o r e g e r m p l a s m ;S h a n x i 玉米大约于16世纪从美洲引入我国[1],遗传基础相对狭窄一直是制约我国玉米育种的瓶颈㊂因此,种质的扩增㊁改良和创新是玉米育种的核心问题[2-3]㊂目前玉米种质资源与日俱增,其数目的庞大给种质保存㊁评价㊁研究和利用增加了工作量及难度㊂因此,为提高种质资源的管理质量和效率,构建玉米核心种质十分必要和迫切㊂澳大利亚学者F r a n k e l 在1984年第一次提出了核心种质的想法,即采取一定的取样方法,用尽可能少的种质材料最大可能代表整个资源的遗传信息和多样性[4]㊂早期对于核心种质的构建主要基于表型数据,虽易操作,但信息量少㊁易受环境影响而误差大㊂分子标记技术信息量大,不受环境影响,已经成为构建核心种质的主要方法[5]㊂目前,分子标记手段已经成功应用到玉米[6-9]㊁水稻[10]㊁籽用西瓜[11]㊁大白菜[12]㊁建兰[13]㊁野生山胡椒[14]等多种作物核心种质的构建中㊂由于复杂的地理环境与生产条件,山西省形成了5个玉米生态种植区域[15],几乎包括了全国乃至全世㊃27㊃表1 聚类优先取样下各备选核心种质遗传多样性指数T a b l e 1 G e n e t i c d i v e r s i t y i n d e xo f e a c hc a n d i d a t e c o r e g e r m p l a s mu n d e r c l u s t e r i n gp r i o r i t y s a m p l i n g抽样抽样数压缩比例/%等位变异数基因多样性多态信息量多态位点数多态位点保留比例/%抽样前224100.004.280.50020.44171100.00抽样119988.844.280.50880.45171100.00抽样217075.894.280.51750.46171100.00抽样314464.294.280.52490.47171100.00抽样411250.004.280.53560.48171100.00抽样59140.634.250.54460.4917099.42抽样66830.364.200.55600.5016898.25抽样75424.114.200.57340.5216898.25抽样84319.204.150.58400.5316697.08多年来,玉米育种团队在收集了大量国内外玉米种质的基础上,改良㊁培育了许多符合不同生态条件的优良自交系,这些自交系在很大程度上代表了山西玉米种质的特点㊂因此,构建山西玉米自交系的核心种质库具有实践指导意义,也是亟待解决的问题㊂本研究在用S S R 分子标记对这些优良自交系进行遗传多样性分析的基础上,构建其核心种质,将为这些种质的保存㊁重点研究和有效利用提供可靠的依据㊂1 材料和方法1.1 材 料1.1.1 试验材料224份玉米自交系由山西强盛种业有限公司提供,其中包括目前生产上主要推广品种先玉335㊁先玉508㊁先玉696和郑单958的亲本自交系P H6W C(先玉335,先玉508,先玉696的母本)㊁P H 4C V(先玉335父本)㊁P H B1M (先玉696的父本)㊁P H5A D (先玉508的父本)㊁郑58(郑单958母本)和昌7-2(郑单958父本)㊂1.1.2 S S R 引物采用中华人民共和国农业行业标准(N Y /T1432-2014‘玉米品种鉴定D N A 指纹方法“)的20对核心引物和20对辅助核心引物[16]㊂1.2 实验方法1.2.1 S S R 分析及聚类分析D N A 提取㊁S S R 分析及聚类分析方法参见李锐等[17]的方法㊂1.2.2 取样方法本试验采用多次聚类结合优先取样法㊂首先根据所有种质遗传相似度,将样品进行聚类形成树状图㊂在聚类树状图中,按照一定的相似度进行分类㊂每一料,然后从类内随机抽取一个样品保留进入下一轮聚类分析,若类内只有一个样品则该样品直接保留进入下一轮聚类分析㊂将所有保留的样品再次聚类,按之前同样的方法取样;再进入下一轮聚类㊁取样,循环,直至所取样品量达到理想取样㊂1.2.3 核心种质代表性检验和评价用等位变异数㊁多态位点数㊁基因多样性㊁多态信息含量等指标评价原始种质和核心种质的遗传多样性㊂2 结果与分析2.1 核心种质库的构建及数据分析利用40个S S R 标记的171个等位变异,对224个自交系进行遗传距离聚类㊂在相似系数大约为0.71处可分为五大聚类群,依据各聚类支中含有的不同种质类群的代表性自交系,确定类群的名称(图1)㊂从图中看出,瑞德群㊁兰卡斯特群是两个最大的群,二者数量之和超过了材料的90%;有10份材料属于唐四平头群;另有10个自交系的类群归属不明确,定为其他群㊂兰卡斯特群可明显看出,有335父本群㊁696与508父本群和其他兰卡斯特群,即有亚类分化趋势㊂在此基础上,再用最小距离逐步抽样法进行构建核心种质,即遗传距离小于一定数值的种质将首先被淘汰,但每次抽样都保留标准测验种和具有特异等位变异的自交系㊂共抽样8次,每次抽样构建自交系核心种质的遗传多样性如表1㊂由表1可以看出,随着抽样种质数目的减少,P I C 和遗传多样性参数呈增加趋势;等位基因数与多态性位点减少极少㊂分析每次抽样后聚类图的类群结构发现,抽样6的聚类图仍然保持原始样本的类群划分(图2),但抽样7和抽样8的聚类图则不能保持原始样本的类群结构㊂因此,抽样6为最合适的核心种质群体㊂㊃37㊃F i g.1 C l u s t e r a n a l y s i s o f224o r i g i n a lm a i z e i n b r e d l i n e sb a s e do nS S R ㊃47㊃图2基于S S R标记的68份玉米核心自交系聚类分析F i g.2 C l u s t e r a n a l y s i s o f68m a i z e c o r e i n b r e d l i n e sb a s e do nS S R m a r k e r s表2核心种质、保留种质与原始种质遗传参数的比较T a b l e2 C o m p a r i s o no f g e n e t i c p a r a m e t e r sb e t w e e n c o r e g e r m p l a s m,r e s e r v e d g e r m p l a s ma n do r i g i n a l g e r m p l a s m种质数量抽样比例/%等位变异数基因多样性多态信息量多态位点数多态位点保留比例/%原始种质224100.004.280.50020.44171100.00核心种质6830.364.200.55600.5016898.25保留种质15669.643.950.45580.4015892.402.2核心种质的确认与评价原始种质224个自交系,依据30.36%取样比例构建的核心种质包含68个自交系,剩下的156个自交系为保留种质㊂对3组种质的等位变异数㊁基因多样性㊁多态信息量㊁多态位点数这4个遗传参数进行比较,结果如表2所示,核心种质的多态信息含量(0.50)和基因多样性(0.5560)高于原始种质(0.44;0.5002),等位变异数(4.20)和多态位点数(168)略小于原始种质(4.28;171)㊂同时,核心种质的这4个遗传参数均大于保留种质㊂3组种质的4个遗传参数t 检验结果显示,核心种质与原始种质㊁保留种质和原始种质均无明显差异(p>0.05)(表3)㊂以30.36%的取㊃57㊃样比例构建的包含68个玉米自交系的核心种质能够充分代表原始种质的遗传多样性㊂表3核心种质㊁保留种质与原始种质遗传参数的t检验T a b l e3 T-t e s t f o r g e n e t i c p a r a m e t e r s o f c o r e g e r m p l a s m, r e s e r v e d g e r m p l a s ma n do r i g i n a l g e r m p l a s m种质等位基因数等位基因频率基因多样性多态信息量核心种质/原始种质0.10530.80750.11310.0994保留种质/原始种质0.14960.29190.21940.2169 3讨论本研究根据30.36%取样比例构建了224份玉米自交系的核心种质㊂3组种质的4个遗传参数t检验结果表明,核心种质与原始种质㊁保留种质和原始种质之间均无明显差异,充分反映了该核心种质代表了原始种质的遗传多样性,保留种质也保留了原始种质的遗传多样性㊂核心种质构建是种质资源研究的热点,构建核心种质的目的是以最小的样本数最大限度地代表原始样本群体的遗传多样性,构建的核心种质要有代表性㊁异质性和多样性㊁类型齐全㊂但是核心种质遗传代表性和数量之间存在非线性关系[17],因此,取样策略和取样比例是构建核心种质的关键㊂本研究的原始样本划分为4类杂种优势群,而玉米自交系的杂种优势类群的划分是玉米种质分析的主要内容和品种亲本组配的重要依据,因而构建的核心种质也要保留原杂种优势类群的特点,核心种质构建要考虑实际育种的需求和应用,构建好的核心种质要有利于种质的分析㊁保存和利用,不能盲目照搬已有的方法㊂因此,本研究采用多次聚类结合优先取样法,即在构建玉米自交系种质的核心种质时,虽然采用最小遗传距离逐步抽样法进行,但是,首先抽选标准测验种将它们作为类群划分的标准,使每次的抽样能反映其代表性;然后在其他抽样时先入选有特异等位变异的材料,因为它们代表了原始样本的异质性和多样性㊂每次循环聚类都按照这个原则进行㊂当进行到第7次抽样聚类图显示和原始样本聚类图的类群划分不一样时,就认为第6次抽样是合适的㊂研究结果显示,原始样本瑞德群的数量最多,但是核心种质中瑞德群的数量减少了很多,说明原始瑞德群中重复㊁冗余的样本较多;核心种质中其他群的数量相比原始群中其他群的数量相差不多㊂另外,本研究没有预先划定取样比例,完全根据逐步取样后能否完全反映原始样本的遗传多样性为前提,这和李自超等[18]认为各物种适宜的核心种质规模应按照具体物种的遗传多样性来定的思路是一致的㊂综上表明,本研究采用的策略具有合理性和实用性㊂构建的核心种质将有利于育种人员对育种材料的评价㊁保存㊁研究和在育种中的有效利用㊂参考文献:[1]崔俊明.新编玉米育种学[M].北京:中国农业科学技术出版社,2007:1-2.[2]张世煌.玉米种质创新和商业育种策略[J].玉米科学,2006, 14(4):1-3,6.[3]李明顺,谢传晓,张世煌.提高玉米育种效率的技术途径与策略[J].作物杂志,2007(1):4-5.[4]F r a n k e lO 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简述分子标记技术在玉米遗传育种中的应用
简述分子标记技术在玉米遗传育种中的应用【摘要】玉米是世界三大粮食之一，也是最重要的饲料作物，在世界粮食生产中占有重要的地位，因此玉米遗传育种中生物技术的应用也受到重视。
本文简要分子标记技术在玉米遗传育种中的应用；基因工程在玉米遗传育种中存在的问题；基因工程在玉米遗传育种中的应用展望以及基因工程技术在玉米遗传育种上应用应考虑的几个方面。
【关键词】玉米；基因工程；分子标记；转基因；遗传育种玉米(Zea maysL)是世界上重要的粮食和饲料作物，种植面积仅次于小麦和水稻，单位面积产量居全球之首。
由于玉米在中国乃至世界粮食生产上的重要地位，所以玉米的育种工作非常重要。
玉米育种工作者都希望培育出性状优良的品种，而实现这一目标的关键是得到目的基因和对高产、优质、抗病虫等目标性状的选择。
过去人们多借用形态学和同工酶等遗传标记来辅助育种，并已在玉米育种中获得了成功。
但由于受环境等因素影响，这些方法要求经验丰富的育种者花费较长的时间。
近年来，基因工程在玉米遗传育种中取得了巨大进展。
基因工程弥补了玉米遗传资源的不足，并解决了过去不能解决的难题。
1.分子标记技术在玉米遗传育种中的应用玉米是利用分子标记技术最早的作物之一，并且取得了丰富成果。
从上个世纪80年代到90年代初期对玉米进行分子标记方面的研究多是基础性的课题研究，如分子标记连锁图谱的建立、遗传多样性的评价基因定位等。
90年代中期以后，重要基因定位方面的研究成为一重要方向。
由于分子标记直接以DNA形式表现，具有不受环境条件和发育阶段的影响、标记的数目多、多态性高等优点，因而发展迅速，且种类不断增多，目前已开发的分子标记有主要有：限制性片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态DNA（RAPD）、扩增片段长度多态性（AFLP）、简单序列重复（SSR）、序列特异扩增区域（SCAR）、单链构象多态性（SSCP）、单核苷酸多态性（SNP）和数量可变串联重复（VNTR）等。
玉米品种真实性SSR分子检测体系优化
玉米品种真实性ＳＳＲ分子检测体系优化林显凤１，２，罗友明３，尚玥２，赵长坤２，龚辉２，杨腾３，白体坤３，毛若涵４，李仕伟１，游宇１，２∗㊀（１．南充市农业科学院，四川南充６３７０００；２．南充市种子质量监督检验站，四川南充６３７０００；３．南充市种子管理站，四川南充６３７０００；４．中国农业大学农学院，北京１００１６３）摘要㊀对南充市农业科学院提供的２份玉米品种，随机选用ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１‘主要农作物品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测玉米“中的１２个ＳＳＲ位点，利用琼脂糖凝胶电泳检测法㊁变性ＰＡＧＥ银染检测法和毛细管电泳分析法，分析了不同的扩增程序㊁仪器设备和反应体系等对ＰＣＲ产物质量的影响㊂结果表明：６０ħ退火温度和ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡ聚合酶有利于玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测；２种ＰＣＲ扩增仪对扩增结果并无较大区别㊂６０ħ－ＰＣＲ１－Ｅ１，即６０ħ退火温度，ＰＣＲ扩增仪１［ＴＰ－９６Ａ（Ｆ）］，ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡ聚合酶，毛细管电泳法相结合为最优组合，可作为四川品种真实性快速检测候选方法㊂关键词㊀ＳＳＲ标记；玉米；真实性；检测体系中图分类号㊀Ｓ５１３㊀㊀文献标识码㊀Ａ㊀㊀文章编号㊀０５１７－６６１１（２０２３）０６－００９３－０７ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．０６．０２３㊀㊀㊀㊀㊀开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆＳＳＲＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｆｏｒＭａｉｚｅＶａｒｉｅｔｙＡｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙＬＩＮＸｉａｎ⁃ｆｅｎｇ１，２，ＬＵＯＹｏｕ⁃ｍｉｎｇ３，ＳＨＡＮＧＹｕｅ２ｅｔａｌ㊀（１．ＮａｎｃｈｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｎｃｈｏｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ６３７０００；２．ＳｅｅｄＱｕａｌｉｔｙＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎａｎｄＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎＳｔａｔｉｏｎｏｆＮａｎｃｈｏｎｇ，Ｎａｎｃｈｏｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ６３７０００；３．ＳｅｅｄＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅＳｔａｔｉｏｎｏｆＮａｎｃｈｏｎｇ，Ｎａｎ⁃ｃｈｏｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ６３７０００）Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀Ｔｈｅ２ｍａｉｚｅｖａｒｉｅｔｉｅｓｐｒｏｖｉｄｅｄｂｙＮａｎｃｈｏｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ．１２ＳＳＲｌｏｃｉｗｅｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍＧＢ／Ｔ３９９１４－２０２１ＶａｒｉｅｔｙＧｅｎｕｉｎｅｎｅｓｓａｎｄＰｕｒｉｔｙＴｅｓｔｉｎｇｏｆＭａｉｎＣｒｏｐｓｗｉｔｈＳＳＲＭａｒｋｅｒｓ⁃Ｍａｉｚｅ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇＰＡＧＥａｎｄｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ｅｑｕｉｐｍｅｎｔａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ．６０ħａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｎｄＮｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｗｅｒｅｍｏｒｅｃｏｎｄｕｃｉｖｅｔｏｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＳＳＲｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｍａｉｚｅｖａｒｉｅｔｙａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ；ＴｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｔｗｏＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ．６０ħ⁃ＰＣＲ１⁃Ｅ１，ｉ．ｅ．６０ħａｎ⁃ｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｎｄＰＣＲ１ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ［（ＴＰ⁃９６Ａ（Ｆ）］ｗｅｒｅｔｈｅｂｅｓｔｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｃｏｕｌｄｂｅｕｓｅｄａｓｃａｎｄｉｄａｔｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｖａｒｉｅｔｙａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙｄｅｔｅｃｔｉｏｎｉｎＮｏｒｔｈｅａｓｔＳｉｃｈｕａｎ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀ＳＳＲｍａｒｋｅｒ；Ｍａｉｚｅ；Ａｕｔｈｅｎｔｉｃｉｔｙ；Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ基金项目㊀南充市科技计划项目（２１ＹＦＺＪ００１９）㊂作者简介㊀林显凤（１９８９ ），女，吉林前郭尔罗斯人，农艺师，硕士，从事种子质量监督与检验研究㊂∗通信作者，助理研究员，硕士，从事花生遗传育种研究㊂收稿日期㊀２０２２－０５－２０㊀㊀玉米（ＺｅａｍａｙｓＬｉｎｎ．）是全球重要的粮食和饲料作物及工业生产原材料［１］，在我国农业生产中起着巨大的影响作用［２］㊂随着我国玉米育种技术的更新换代，审定品种数量呈现 井喷式 增长，但遗传基础却越来越狭窄［３］，以及玉米种子经营渠道多㊁乱㊁杂，各地普遍存在以假充真㊁以劣充优的现象，严重限制了农业生产的发展，使许多农户和经济组织遭受极大的经济损失［４－５］㊂玉米品种真实性和纯度检测的方法可以根据原理的不同，通过形态法㊁生理生化法㊁物理化学法㊁细胞学法㊁分子生物学法进行鉴定；还可以根据检验对象的不同分为种子测定法㊁植株测定法㊁幼苗测定法；还可以根据检验场所的不同分为田间小区种植鉴定和室内检验等［６］㊂国内一般采用田间小区种植鉴定和室内检验作为后控［６］㊂传统的品种真实性鉴定有形态鉴定法和田间小区种植鉴定法，这２种方法存在费工㊁费时㊁鉴定周期长㊁费用高等缺点，且这２种方法受环境和人为影响较大，鉴定者的观察经验也制约着鉴定的准确性［７］㊂用分子标记技术鉴别植物品种真实性［８－１１］，具有检测速度快，准确性高，重复性好，操作简单，且不易受季节和环境变化影响等特点［１２］，是一种快速㊁精准鉴定品种真实性的有效方法［１３］㊂微卫星ＤＮＡ（ｓｉｍｐｌｅｓｅ⁃ｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓ，ＳＳＲ），是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列［１４］，其重复单位为１ ６个核苷酸，由１０ ２０个重复单位串联组成［１５］㊂ＳＳＲ标记呈共显性遗传，可分辨出杂交种子的纯合体和杂合体，每个位点均有许多等位形式，多态性高，结果重演性和稳定性高，是目前较受欢迎的分子标记技术［１６－１９］㊂检测ＳＳＲＰＣＲ产物扩增结果的方法大致有以下５种：①琼脂糖凝胶电泳检测［２０］；②ＱＩＡＧＥＮ琼脂糖毛细管电泳检测［２１］；③ＰＡＧＥ－放射自显影检测；④利用ＰＡＧＥ－银染法进行检测［２２］；⑤利用全自动核酸蛋白分析系统进行结果分析［２３－２４］㊂目前已有学者利用琼脂糖凝胶电泳ＳＳＲ分子检测鉴定出玉米品种真实性和纯度检测最适宜的部位［２５］㊂笔者选取①㊁④㊁⑤３个方法分析扩增程序㊁仪器设备和反应体系等因素对四川玉米品种真实性ＳＳＲ分子测定结果质量的影响，筛选出适宜的试验条件以适应四川目前真实性室内分子检测工作开展的需要㊂１㊀材料与方法１．１㊀试验材料㊀供试玉米种子样品，由南充市农业科学院玉米研究所提供㊂共２个种子样品，分别为南Ｎ２１４２㊁南Ｗ８１６㊂植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒（Ａｉｄｌａｂ），ＴａｑＤＮＡ聚合酶：ｎｏ⁃ｖｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｅ１）㊁ＴＩＡＮＧＥＮ（Ｅ２）㊁四通道卡夹（Ｂｉｏｐｔｉｃ）㊂智能人工气候箱（ＲＴＯＰ－１０００Ｙ）；研磨仪（ＹＭＹ２００）；ＰＣＲ扩增仪１（ＴＰ－９６Ａ（Ｆ））；ＰＣＲ扩增仪２（ＢＩＯ－ＲＡＤ）；微量紫外分光光度计（ＴＰ－Ｌ－１０００）；全自动凝胶成像系统（ＢＩＯＴＯＰ）；聚丙烯酰胺凝胶电泳仪（ＢＩＯ－ＲＡＤ）；荧光毛细管电泳设备（Ｂｉｏｐ⁃安徽农业科学，Ｊ．ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．２０２３，５１（６）：９３－９９㊀㊀㊀ｔｉｃ－Ｑｓｅｐ４００）㊂１．２㊀试验方法１．２．１㊀ＤＮＡ提取㊂采取对玉米种子进行发芽试验，利用植物叶片直接提取的方法，每个试样取５ ７粒种子的叶片混株样品，使用研磨仪进行研磨，用ＤＮＡ提取试剂盒提取玉米全基因组ＤＮＡ，方法详见试剂盒说明书㊂提取的ＤＮＡ用微量紫外分光光度计检测ＤＮＡ质量和浓度，并稀释到５０ｎｇ／μＬ㊂１．２．２㊀ＰＣＲ扩增㊂反应采用２０μＬ体系，２ˑＴａｑＰＣＲＭｉｘ１０μＬ，１０μｍｏｌ／Ｌ上㊁下游引物各１μＬ，ＤＮＡ１μＬ，ｄｄＨ２Ｏ７μＬ㊂引物使用ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１‘主要农作物品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测玉米“中的１２对引物（表１）进行ＰＣＲ扩增［２６］㊂ＰＣＲ反应程序：９４ħ预变性３ｍｉｎ；９４ħ变性３０ｓ，５３／６０ħ退火３０ｓ，７２ħ延伸１ｍｉｎ，共３０个循环；７２ħ延伸７ｍｉｎ，４ħ保存㊂表１㊀１２对ＳＳＲ引物名称与序列Ｔａｂｌｅ１㊀Ｎａｍｅｓａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆ１２ｐａｉｒｓｏｆＳＳＲｐｒｉｍｅｒｓ引物编号Ｐｒｉｍｅｒｎｕｍｂｅｒ引物名称Ｐｒｉｍｅｒｎａｍｅ染色体位置Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｐｏｓｉｔｉｏｎ等位变异范围Ａｌｌｅｌｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎｒａｎｇｅ引物序列（５ᶄ ３ᶄ）ＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅＰ１９ｕｍｃ１４３２ｙ６１０．０２２２０ ２５７Ｆ：ＧＡＧＡＡＡＴＣＡＡＧＡＧＧＴＧＣＧＡＧＣＡＴＣＲ：ＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＡＡＧＣＰ２０ｕｍｃ１５０６ｋ１２１０．０５１６６ １９０Ｆ：ＧＡＧＧＡＡＴＧＡＴＧＴＣＣＧＣＧＡＡＧＡＡＧＲ：ＴＴＣＡＧＴＣＧＡＧＣＧＣＣＣＡＡＣＡＣＰ２１ｕｍｃ１１４７ｙ４１．０７１５４ １６８Ｆ：ＡＡＧＡＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＧＧＴＧＣＧＡＴＡＣＲ：ＧＴＴＴＣＣＴＡＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＣＴＣＣＣＴＣＧＣＰ２２ｂｎｌｇ１６７１ｙ１７１．１０１７５ ２３０Ｆ：ＣＣＣＧＡＣＡＣＣＴＧＡＧＴＴＧＡＣＣＴＧＲ：ＣＴＧＧＡＧＧＧＴＧＡＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＰ２３ｐｈｉ９６１００ｙ１２．００２４５ ２７７Ｆ：ＴＴＴＴＧＣＡＣＧＡＧＣＣＡＴＣＧＴＡＴＡＡＣＧＲ：ＣＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＧＡＡＴＡＣＣＣＰ２４ｕｍｃ１５３６ｋ９２．０７２１６ ２３８Ｆ：ＴＧＡＴＡＧＧＴＡＧＴＴＡＧＣＡＴＡＴＣＣＣＴＧＧＴＡＴＣＧＲ：ＧＡＧＣＡＴＡＧＡＡＡＡＡＧＴＴＧＡＧＧＴＴＡＡＴＡＴＧＧＡＧＣＰ２５ｂｎｌｇ１５２０Ｋ１２．０９１６０ １９５Ｆ：ＣＡＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＣＲ：ＧＣＴＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＰ２６ｕｍｃ１４８９ｙ３３．０７２３１ ２６５Ｆ：ＧＣＴＡＣＣＣＧＣＡＡＣＣＡＡＧＡＡＣＴＣＴＴＣＲ：ＧＣＣＴＡＣＴＣＴＴＧＣＣＧＴＴＴＴＡＣＴＣＣＴＧＴＰ２７ｂｎｌｇ４９０ｙ４４．０４２７１ ３３０Ｆ：ＧＧＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＲ：ＴＴＣＴＣＡＧＣＣＡＧＴＧＣＣＡＧＣＴＣＴＴＡＴＴＡＰ２８ｕｍｃ１９９９ｙ３４．０９１７６ ２００Ｆ：ＧＧＣＣＡＣＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＴＴＴＧＣＲ：ＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＣＧＰ２９ｕｍｃ２１１５ｋ３５．０２２７０ ２９３Ｆ：ＧＣＡＣＴＧＧＣＡＡＣＴＧＴＡＣＣＣＡＴＣＧＲ：ＧＧＧＴＴＴＣＡＣＣＡＡＣＧＧＧＧＡＴＡＧＧＰ３０ｕｍｃ１４２９ｙ７５．０３１２６ １４４Ｆ：ＣＴＴＣＴＣＣＴＣＧＧＣＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＣＲ：ＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＡＡＴＣＣＴＣＡＴＣＴＧ１．２．３㊀琼脂糖凝胶电泳检测㊂扩增产物需在ＰＣＲ仪上执行变性程序：９５ħ变性５ｍｉｎ，４ħ冷却１０ｍｉｎ以上㊂采用２．０％琼脂糖凝胶进行电泳，点样时同一引物的２个样品相邻，稳压稳流状态电泳后用全自动凝胶成像系统进行照相读带㊂１．２．４㊀变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测㊂采用ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１‘主要农作物品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测玉米“中的检测方法㊂扩增产物自带染料，无须加入ＬａｄｉｎｇＢｕｆｆｅｒ㊂扩增产物需在ＰＣＲ仪上执行变性程序：９５ħ变性５ｍｉｎ，４ħ冷却１０ｍｉｎ以上㊂采用４．５％ＰＡＧＥ进行灌胶，点样时同一引物的２个样品相邻，９０Ｗ电泳８０ｍｉｎ后用银染法显带并观察结果㊂银染法显带步骤：固定 漂洗 染色 漂洗 显影 定影 漂洗㊂固定，１０％ＨＡｃ，１次，３ｍｉｎ；漂洗，ｄｄＨ２Ｏ，１次，＜１０ｓ；染色，０．２％ＡｇＮＯ３，１次５ｍｉｎ；漂洗，双蒸水，１次，＜１０ｓ；显影，３０ｇＮａＯＨ＋５ｍＬＨＣＨＯ定容至１０００ｍＬｄｄＨ２Ｏ中，摇床上轻轻晃动至纹带出现；定影，１０％ＨＡｃ定影，５ｍｉｎ；漂洗，ｄｄＨ２Ｏ，１次，＜１０ｓ㊂１．２．５㊀毛细管电泳检测㊂将样品在ＰＣＲ仪上９５ħ变性５ｍｉｎ取出，冷却１０ｍｉｎ以上㊂用Ｑｓｅｐ４００荧光毛细管电泳设备进行电泳检测㊂电泳步骤：联机与通气检查 放入缓冲液和Ｍａｒｋｅｒ 放入样品并复位 置入卡夹 卡夹锁定与校准 程序设定，程序设定好后点击Ｒｕｎ，开始电泳分离，可点击Ｒｅａｌｔｉｍｅ实时监测电泳过程㊂结果用Ｑ－ＡｎａｌｙｚｅｒｆｏｒＱｓｅｐ４００软件进行分析㊂１．３㊀试验设计㊀采用５３㊁６０ħ２个退火温度；２种不同来源的ＴａｑＤＮＡ聚合酶；２台不同企业不同年度购买的ＰＣＲ扩增仪；３种不同的电泳方法㊂为便于图片标记和数据处理，分别对试验数据进行编号（表２），并根据表３的试验条件进行试验㊂２㊀结果与分析２．１㊀ＤＮＡ模板质量检测㊀用植物基因组ＤＮＡ提取试剂盒（Ａｉｄｌａｂ）提取的ＤＮＡ模板，采用微量紫外分光光度计（ＴＰ－Ｌ－１０００）进行检测㊂检测结果显示（表４），所提取的ＤＮＡ模板质量较高，能够满足试验处理的质量要求㊂每个样品稀释至５０ｎｇ／μＬ备用㊂４９㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年表２㊀试验条件及编号Ｔａｂｌｅ２㊀Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｎｕｍｂｅｒｓ序号Ｎｏ．项目Ｉｔｅｍ试验条件Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎ编号Ｎｏ．１扩增程序：退火温度５３ħＩ２６０ħＩＩ３反应体系：ＴａｑＤＮＡ聚合酶ＴａｑＤＮＡ聚合酶－Ｅ１（ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ）ａ４ＴａｑＤＮＡ聚合酶－Ｅ２（ＴＩＡＮＧＥＮ）ｂ５仪器设备：ＰＣＲ扩增仪ＰＣＲ扩增仪１［ＴＰ－９６Ａ（Ｆ）２０２１年购买］Ａ６ＰＣＲ扩增仪２（ＢＩＯ－ＲＡＤ２００６年购买）Ｂ７检测方法：电泳琼脂糖凝胶电泳甲８ＰＡＧＥ凝胶成像电泳乙９Ｑｓｅｐ荧光毛细管电泳丙２．２㊀琼脂糖凝胶电泳下不同处理对ＰＣＲ产物质量的影响㊀采用琼脂糖凝胶电泳的方法分析了扩增程序中不同退火温度㊁不同ＰＣＲ扩增仪和不同ＴａｑＤＮＡ聚合酶对玉米品种真实性ＳＳＲ标记扩增产物质量的影响㊂对比ＰＣＲ产物电泳谱带的清晰度和干净度可知，５３ħ退火温度条件下，电泳谱带拖带明显，特异性较低，非特异性产物较多，杂质多；６０ħ退火温度条件下，条带特异性高，杂质少，条带和背景较５３ħ退火温度图谱清晰㊁干净㊂利用ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ（Ｅ１）和天根（Ｅ２）ＴａｑＤＮＡ聚合酶得到的ＰＣＲ产物电泳条带特异性均较高，目标条带比较清晰㊁杂质少㊁背景较干净㊂但天根ＴａｑＤＮＡ聚合酶未能扩增出ＩｂＡ甲㊁ＩＩｂＡ甲㊁ＩｂＢ甲㊁ＩＩｂＢ甲中Ｐ２５目的条带㊂使用ＴＰ－９６Ａ（Ｆ）和ＢＩＯ－ＲＡＤＰＣＲ仪进行扩增，对比条带特性㊁背景清晰度可知，不同品牌仪器对结果的影响并不明显（图１）㊂因此，采用琼脂糖凝胶电泳方法，得到结果为６０ħ退火温度和ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡ聚合酶较有利于开展玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测㊂表３㊀试验条件组合及代号Ｔａｂｌｅ３㊀Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｎｄｃｏｄｅ组合编号ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＮｏ．试验条件ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎＩＩＩａｂＡＢ甲乙丙组合代号Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｃｏｄｅ１＋＋＋＋ＩａＡ甲２＋＋＋＋ＩａＢ甲３＋＋＋＋ＩｂＡ甲４＋＋＋＋ＩｂＢ甲５＋＋＋＋ＩＩａＡ甲６＋＋＋＋ＩＩａＢ甲７＋＋＋＋ＩＩｂＡ甲８＋＋＋＋ＩＩｂＢ甲９＋＋＋＋ＩａＡ乙１０＋＋＋＋ＩａＢ乙１１＋＋＋＋ＩｂＡ乙１２＋＋＋＋ＩｂＢ乙１３＋＋＋＋ＩＩａＡ乙１４＋＋＋＋ＩＩｂＢ乙１５＋＋＋＋ＩＩｂＡ乙１６＋＋＋＋ＩＩｂＢ乙１７＋＋＋＋ＩａＡ丙１８＋＋＋＋ＩａＢ丙１９＋＋＋＋ＩｂＡ丙２０＋＋＋＋ＩｂＢ丙２１＋＋＋＋ＩＩａＡ丙２２＋＋＋＋ＩＩａＢ丙２３＋＋＋＋ＩＩｂＡ丙２４＋＋＋＋ＩＩｂＢ丙㊀注：＋代表组合采用该处理方法㊂㊀Ｎｏｔｅ：＋ｍｅａｎｓｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｄｏｐｔｓｔｈｉｓｔｒｅａｔｍｅｎｔｍｅｔｈｏｄ．表４㊀提取的ＤＮＡ检测结果Ｔａｂｌｅ４㊀ＴｅｓｔｒｅｓｕｌｔｓｏｆｅｘｔｒａｃｔｅｄＤＮＡ品种编号ＩｔｅｍＮｏ品种名称ＶａｒｉｅｔｙｎａｍｅＤＮＡ浓度ＤＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｎｇ／ｍＬＤ２６０ｎｍＤ２８０ｎｍＤ２６０ｎｍ／Ｄ２８０ｎｍ１南Ｎ２１４２８３．３０１．４０３０．６８４２．０５１２南Ｗ８１６７０．１５１．６６８０．７７０２．１６６２．３㊀聚丙烯酰胺凝胶电泳下不同处理对ＰＣＲ产物质量的影响㊀利用８个试验处理分析了变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下不同退火温度㊁不同ＴａｑＤＮＡ聚合酶和不同品牌的ＰＣＲ扩增仪对玉米品种真实性ＳＳＲ标记扩增产物质量的影响（图２）㊂处理ＩａＡ乙与ＩＩａＡ乙㊁ＩａＢ乙与ＩＩａＢ乙比较，２个不同的退火温度对目的条带的特异性并无较大区别，杂质少，条带和背景均较干净；处理ＩｂＡ乙与ＩＩｂＡ乙㊁ＩｂＢ乙与ＩＩｂＢ乙相５９５１卷６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀林显凤等㊀玉米品种真实性ＳＳＲ分子检测体系优化注：２５个泳道依次为Ｍａｋｅｒ和１２对ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１玉米品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测对南Ｎ２１４２和南Ｗ８１６的扩增产物㊂Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ２５Ｌａｎｅｓｗｅｒｅｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｍａｋｅｒａｎｄ１２ｐａｉｒｓｏｆＧＢ／Ｔ３９９１４－２０２１ＶａｒｉｅｔｙｇｅｎｕｉｎｅｎｅｓｓａｎｄｐｕｒｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇｏｆｍａｉｎｃｒｏｐｓｗｉｔｈＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ⁃Ｍａｉｚｅ，ＳｏｕｔｈＮ２１４２ａｎｄＳｏｕｔｈＷ８１６ｂｙＳＳＲｍａｒｋｅｒｍｅｔｈｏｄ．图１㊀琼脂糖凝胶电泳分析扩增程序㊁仪器设备和反应体系对ＰＣＲ产物质量的影响Ｆｉｇ．１㊀Ａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓ注：２５个泳道依次为Ｍａｋｅｒ和１２对ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１玉米品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测对南Ｎ２１４２和南Ｗ８１６的扩增产物㊂Ｎｏｔｅ：Ｔｈｅ２５Ｌａｎｅｓｗｅｒｅｔｈｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆｍａｋｅｒａｎｄ１２ｐａｉｒｓｏｆＧＢ／Ｔ３９９１４－２０２１ＶａｒｉｅｔｙｇｅｎｕｉｎｅｎｅｓｓａｎｄｐｕｒｉｔｙｔｅｓｔｉｎｇｏｆｍａｉｎｃｒｏｐｓｗｉｔｈＳＳＲｍａｒｋｅｒｓ⁃Ｍａｉｚｅ，ＳｏｕｔｈＮ２１４２ａｎｄＳｏｕｔｈＷ８１６ｂｙＳＳＲｍａｒｋｅｒｍｅｔｈｏｄ．图２㊀变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析扩增程序㊁仪器设备和反应体系对ＰＣＲ产物质量的影响Ｆｉｇ．２㊀Ｅｆｆｅｃｔｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅ，ａｐｐａｒａｔｕｓａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙｄｅｎａｔｕｒｉｎｇｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃ⁃ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ６９㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年比较，６０ħ图谱杂质少，背景干净，条带清晰易读取㊂ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｅ１和Ｅ２以及不同品牌的ＰＣＲ扩增仪对目的片段的扩增结果并无较大区别，但Ｅ２未能扩增出ＩｂＡ乙㊁ＩＩｂＡ乙㊁ＩｂＢ乙㊁ＩＩｂＢ乙中Ｐ２５目的条带，这与琼脂糖凝胶电泳结果相一致㊂因此，在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳下６０ħ退火温度和ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｅ１较有利于玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测㊂２．４㊀毛细管电泳下不同处理对ＰＣＲ产物质量的影响㊀不同退火温度㊁ＴａｑＤＮＡ聚合酶和ＰＣＲ扩增仪下毛细管电泳图谱与琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱相一致㊂通过胶图（图３）和信号图（图４）可知，２台ＰＣＲ扩增仪对玉米品种真实性ＳＳＲ标记扩增产物质量的影响无明显区别㊂不同退火温度处理下，５３ħ退火温度的４个组合中，ＩａＢ丙㊁ＩｂＢ丙非特异性条带浓度比目的条带高，ＩｂＡ丙的非特异性条带的信号明显强于目的条带；６０ħ退火温度的胶图背景干净，杂质少，特异性较高，信号图中的主峰明显，仅ＩＩｂＡ丙和ＩＩｂＢ丙中存在较多小于１００ｂｐ的非特异性条带㊂ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｅ１扩增结果中，ＩａＡ丙㊁ＩＩａＡ丙㊁ＩａＢ丙㊁ＩＩａＢ丙非特异性条带较少，背景较干净；Ｅ２扩增结果中，ＩｂＡ丙㊁ＩＩ⁃ｂＡ丙㊁ＩｂＢ丙㊁ＩＩｂＢ丙小于１００ｂｐ和大于４００ｂｐ的非特异性条带较多（图５），部分条带浓度高于目的条带浓度，这可能与试验条件组合不同有关㊂因此，在毛细管电泳下６０ħ退火温度和ＴａｑＤＮＡ聚合酶Ｅ１较有利于玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测，这与琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果相一致㊂图３㊀毛细管电泳分析扩增程序㊁仪器设备和反应体系对ＰＣＲ产物质量影响的胶图Ｆｉｇ．３㊀Ｇｅｌｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓａｎｄｅｑｕｉｐｍｅｎｔａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｂｙｃａｐｉｌｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓ３㊀结论与讨论ＰＣＲ扩增是品种真实性分子标记鉴定过程中的重要环节㊂影响ＰＣＲ反应结果的重要因素包括反应体系㊁扩增程序和仪器设备等㊂该研究主要针对这３个方面进行组合比较，得出最优组合，以满足分子检测工作的开展需要，能够快速为种子管理部门㊁执法机关提供技术支撑㊂结果表明，６０ħ退火温度有利于玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测；ｎｏ⁃ｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑ聚合酶较适合玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测；２种不同公司㊁不同年度采购的ＰＣＲ扩增仪对玉米品种真实性ＳＳＲ标记的检测并无明显区别㊂最终得出ＩＩａＡ丙组合为最佳㊂琼脂糖凝胶电泳和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果中，Ｅ２未能扩增出Ｐ２５目的条带；毛细管电泳检测时，Ｅ２和ＰＣＲ１组合，无论退火温度是５３ħ还是６０ħ，均有目的条带的主峰图存在；Ｅ２和ＰＣＲ２进行组合时，均无目的条带，这有可能由于某些引物与使用不同的ＰＣＲ扩增仪有关，也有可能与人为操作有关㊂鉴于只使用ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１‘主要农作物品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测玉米“中的１２对引物，对其他引物扩增效果尚不清楚，建议优先使用Ｅ１，即ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎＴａｑＤＮＡ聚合酶㊂７９５１卷６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀林显凤等㊀玉米品种真实性ＳＳＲ分子检测体系优化图４㊀毛细管电泳分析扩增程序㊁仪器设备和反应体系对ＰＣＲ产物质量影响的信号图Ｆｉｇ．４㊀Ｓｉｇｎａｌｄｉａｇｒａｍｏｆｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓａｎｄｅｑｕｉｐｍｅｎｔａｎｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｎＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｑｕａｌｉｔｙｂｙｃａｐｉｌ⁃ｌａｒｙｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓ８９㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀安徽农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０２３年图５㊀针对Ｐ２５引物，采用Ｅ２Ｔａｑ聚合酶，不同退火温度㊁不同ＰＣＲ扩增仪对ＰＣＲ产物质量影响的信号图Ｆｉｇ．５㊀ＳｉｇｎａｌｄｉａｇｒａｍｏｆｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔａｎｎｅａｌｉｎｇｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓａｎｄＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓｏｎｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｏｆＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓｕ⁃ｓｉｎｇＥ２ＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｆｏｒＰ２５ｐｒｉｍｅｒｓ３种方法检测的片段大小基本一致，琼脂糖凝胶电泳方法可扩增出目的条带的大概位置，分离效率较低，适宜鉴定２个品种是否为同一品种的检测；变性ＰＡＧＥ银染检测法的仪器设备及试剂成本低廉，适合于少量材料的检验分析，特别是ＳＳＲ标记的筛选，其过程复杂，因素较多，且工作效率较低㊂毛细管电泳荧光检测法具备高通量㊁上样灵活㊁高灵敏度（１ｐｇ／μＬ）和高分辨率（最佳可达１ ４ｂｐ）等优势，操作过程无须人工制胶㊁染色㊁加样㊁拍照，操作简便，可自动计算片段大小，结果美观易判断，可替代ＰＡＧＥ凝胶电泳，作为四川大批量材料的检测分析，也为四川ＳＳＲ指纹库的构建［２７－２９］打下坚实基础㊂参考文献［１］沈仁飞．ＳＳＲ分子标记及其在玉米真实性鉴定上的应用［Ｊ］．云南农业科技，２０１８（５）：３６－３８．［２］孙琦，张世煌，李新海，等．中国不同年代主推玉米品种品质性状的变化趋势［Ｊ］．中国农业科学，２０１４，４７（１４）：２７２３－２７３０．［３］李巧英，郑戈文，任路路，等．ＳＳＲ分子标记两种电泳方法快速区分玉米种子杂交种［Ｊ］．农业科技通讯，２０２１（５）：４６－４９．［４］孙卫永，尹航，郝德荣．玉米杂交种生产中存在的主要问题及关键措施［Ｊ］．中国种业，２０１５（５）：１７－２０．［５］郑成超，温孚江．ＤＮＡ分子标记技术与作物品种纯度鉴定［Ｊ］．山东农业大学学报，１９９７，２８（４）：４９９－５０５．［６］农业部全国农作物种子质量监督检验测试中心．农作物种子检验员考核学习读本［Ｍ］．北京：中国工商出版社，２００６：２３９－２４５．［７］刘峰，冯雪梅，钟文，等．适合棉花品种鉴定的ＳＳＲ核心引物的筛选［Ｊ］．分子植物育种，２００９，７（６）：１１６０－１１６８．［８］周会，苏秀，毛双林，等．杂交水稻品种真实性和纯度的ＳＳＲ分子标记鉴定［Ｊ］．种子世界，２０１４（３）：３４－３５．［９］张冰清，陆徐忠，吴新杰，等．利用ＳＳＲ标记进行杂交油菜品种鉴定［Ｊ］．中国油料作物学报，２０１４，３６（６）：７２８－７３４．［１０］王飞．ＳＳＲ分子标记在棉种真实性和纯度中的应用研究［Ｄ］．北京：中国农业科学院，２０１３．［１１］许鲲，李锋，吴金锋，等．ＳＳＲ荧光标记毛细管电泳法与国家冬油菜区试指纹鉴定平台的构建［Ｊ］．中国油料作物学报，２０１４，３６（２）：１５０－１５９．［１２］纪玉忠，肖振军，罗丽萍．两种农作物品种真实性鉴定方法的比较分析［Ｊ］．农业与技术，２０１５，３５（１８）：９２．［１３］郭奕生，陆俊，郭奕南．利用ＳＳＲ分子标记鉴定水稻品种真实性［Ｊ］．种子，２０１４，３３（６）：１１５－１１８．［１４］ＤＩＮＧＳＭ，ＷＡＮＧＳＰ，ＨＥＫ，ｅｔａｌ．Ｌａｒｇｅ⁃ｓｃａｌｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｏｍｅｆｅａｔｕｒｅｓｏｆｓｉｍｐｌｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｅａｔｓａｒｅｇｅｎｅｒａｌｌｙｃｏｎｓｅｒｖｅｄａｔｔｈｅｆａｍｉｌｙｌｅｖｅｌｉｎｉｎｓｅｃｔｓ［Ｊ］．ＢＭＣＧｅｎｏｍ，２０１７，１８（１）：１－１０．［１５］罗兵，孙海燕，徐港明，等．ＳＳＲ分子标记研究进展［Ｊ］．安徽农业科学，２０１３，４１（１２）：５２１０－５２１２，５２４６．［１６］ＷＵＫＳ，ＴＡＮＫＳＬＥＹＳＤ．Ａｂｕｎｄａｎｃｅ，ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍａｎｄｇｅｎｅｔｉｃｍａｐｐｉｎｇｏｆｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓｉｎｒｉｃｅ［Ｊ］．ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ，１９９３，２４１（１）：２２５－２３５．［１７］罗玉娣，李建国．ＳＳＲ标记及其在蔬菜育种中的应用［Ｊ］．热带农业科学，２００５，２５（６）：６８－７１．［１８］ＡＫＡＧＩＨ，ＹＯＫＯＺＥＫＩＹ，ＩＮＡＧＡＫＩＡ，ｅｔ．ａｌ．ＭｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅＤＮＡｍａｒｋｅｒｓｆｏｒｒｉｃｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ［Ｊ］．ＴｈｅｏｒＡｐｐｌＧｅｎｅｔ，１９９６，９３（７）：１０７１－１０７７．［１９］ＭＣＣＯＵＣＨＳＲ，ＣＨＥＮＸ，ＰＡＮＡＵＤＯ，ｅｔａｌ．Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｍａｒｋｅｒｄｅｖｅｌ⁃ｏｐｍｅｎｔｍａｐｐｉｎｇａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｒｉｃｅｇｅｎｅｔｉｃｓａｎｄｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．ＰｌａｎｔＭｏｌＢｉｏｌ，１９９７，３５（１／２）：８９－９９．［２０］穆建新，李殿荣，郭蔼光，等．用ＳＳＲ分子标记检测杂交油菜秦优７号的种子纯度［Ｊ］．西北农业学报，２０１０，１９（１１）：６４－６８．［２１］杨华．农作物种子质量检测能力验证中的品种真实性室内分子检测研究［Ｊ］．种子科技，２０１９，３７（６）：１２７－１２９，１３１．［２２］王凤格，赵久然，郭景伦，等．一种改进的玉米ＳＳＲ标记的ＰＡＧＥ／快速银染检测新方法［Ｊ］．农业生物技术学报，２００４，１２（５）：６０６－６０７．［２３］夏春兰，方清建，付存念，等．玉米简易多重ＳＳＲ－ＰＣＲ和荧光标记检测技术［Ｊ］．分子植物育种，２０１５，１３（９）：２０９５－２０９９．［２４］易红梅，王凤格，赵久然，等．玉米品种ＳＳＲ标记毛细管电泳荧光检测法与变性ＰＡＧＥ银染检测法的比较研究［Ｊ］．华北农学报，２００６，２１（５）：６４－６７．［２５］殷长生，许昌慧．玉米的不同取材对品种真实性和纯度鉴定结果的影响［Ｊ］．种子，２０１３，３２（１１）：１１８－１２０．［２６］国家市场监督管理总局，国家标准化管理委员会．主要农作物品种真实性和纯度ＳＳＲ分子标记检测玉米：ＧＢ／Ｔ３９９１４ ２０２１［Ｓ］．北京：中国标准出版社，２０２１．［２７］王凤格，赵久然，戴景瑞，等．玉米品种ＤＮＡ指纹数据库构建的标准化规范［Ｊ］．分子植物育种，２００７，５（１）：１２８－１３２．［２８］王凤格，李欣，杨扬，等．植物品种ＳＳＲ指纹分析专用软件ＳＳＲＡｎａｌｙｓｅｒ的研发［Ｊ］．中国农业科学，２０１８，５１（１２）：２２４８－２２６２．［２９］王凤格，杨扬，易红梅，等．中国玉米审定品种标准ＳＳＲ指纹库的构建［Ｊ］．中国农业科学，２０１７，５０（１）：１－１４．９９５１卷６期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀林显凤等㊀玉米品种真实性ＳＳＲ分子检测体系优化。
SSR分子标记
Taq 酶
模板DNA 72 ℃ 模板DNA dNTP 引物 dNTP
引物
Buffer
Buffer
PCR反应体系
Primer1 Primer2 10×buffer DNTP Taq酶 DDH2O 模板DNA 0.15μl 0.15μl 1μl 0.8μl 0.15μl 5.75μl 2μl
实验仪器
微量移液器
八孔道取液器
离心机
PCR仪
1、DNA的提取（CATB法）
植株材料 裂解液 异丙醇沉淀
研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
2.PCR
2.1 SSR引物设计 根据CMD已公布的序列来设计相对SSR引 物。
2.2 PCR
TaqDNA聚合酶
Taq 酶 模板DNA 94oC 模板DNA dNTP 5min dNTP 引物 Buffer 引物 Buffer 循环30次
使用成本 耗费时间
2~30μg
高 慢
1~100ng
低 快
50-100ng ☆
低☆ 快☆
2~50ng
低 快
100ng
中 中等
可靠性
高
中等
高☆
高
高
三、原理与方法
根据两端序列的保守性，设计引物；进行PCR， 电泳分离，染色显带以检测、分析微卫星序列多 态性；并确定基因排布序列及表型，最终达到成 功鉴定的目的。 简而言之，就是通过对样本DNA多态性的分析， 从而来得到样本DNA序列以及在遗传性状上的调 控和差异。
中文名称 限制性片段长度多 态性 序列标签位点 随机扩增多态性 DNA 扩增片断长度多态 性 简单序列重复 单核苷酸多态性
SSR分子标记
细胞通讯和信息传导
杨一 细胞通讯是指在生物体内细胞与细胞之间的联络、 识别以及相互作用称细胞通讯。 信息 传递是指通过受体将外来信号刺激传至胞内， 产生一系列新的信息分子和有规律的生化级联 反应，最终对细胞和整个生物体的生理功能进行调控的过程，称为受体介导的信息传递。 1. 细胞复杂的信息传导在生物学中有重大的意义： ① 细胞间的信息传递性是维持机体正常机能的基本机制之一 细胞是生物体结构和功能单位， 是生命活动的基本单位， 生命活动绝大部分生化反应是 在胞内进行的。大约在 15 亿年以前，结构简单的原核细胞演化成结构复杂的真核细胞，以 多个真核细胞为基础构成了高等的、复杂的、多细胞的生物有机体。多细胞生物学特点是细 胞产生了特化，同时又能协作，使众多细胞联合成一个协调的整体。多细胞机体内细胞间的 信息传递是维持机体正常机能的基本生物学机制之一。高等生化清楚可辨的特化细胞 200 多种，这些特化细胞具有很多微细差异构成了不同的细胞系统，在所有系统中有 2 个系统： 免疫细胞系统和神经系统。 ② 特化了的细胞的协作和协调 1）免疫细胞系统具有化学识别能力，能够识别“异己” ，消灭其致病作用，当病毒 细胞侵入体内，辅佐细胞提呈 TDAg、TiAg 激活 TC 介导细胞免疫应答(CML)、BC 介导细胞体 液免疫应答(Ig)消灭致病作用。ICC(免疫活性细胞)吞噬病毒、细菌，首先涉及到识别异己的 能力，如何识别并把信息传递给其它 ICC，这就涉及细胞通讯和信息传递问题。 2）神经系统功能是传递兴奋，它迅速将感受器⇌CNS，使多细胞高等生物适应周围 环境，且使 C 各部分协调一致。这种 IS 识别“异己”到消灭“异己” ，神经细胞传递“兴奋” 都属细胞通讯和信息传递范畴。 ③ 人体通讯的三大干线和两类信息物质及三种传递方式 假若大脑是人的通讯总站，人的细胞通讯和信息传递至少有 3 大干线： “硬线”NS； “软线” IS；经络系统。 目前， 了解比较深入的细胞外信息物质有两大类， 一类是甾体激素， 它们可以通过膜脂双层， 自由进入细胞与胞浆或核内相应受体反应，从而影响基因活动。另一类包括蛋白质、多肽、 生物胺等其它小分子，它们共同特点是不能通过脂双层，其信息传递方式有如下几种： 1）简单直接摄入，如 Na+、K+、ATP 酶转运细胞内 Na+、K+可视为特殊信息物 质、 影响细胞内代谢过程。 2）与载体蛋白结合后进入细胞、如 VitB12 和胆固醇。 3）通过受体跨膜信息传递。 2. 信息传递 ①信息传递——通过受体将外来信号刺激传至胞内， 产生一系列信息分子和有规律的生 化级联反应，最终对细胞和整个生物体的生理功能进行调控的过程，称（受体介导的） 信息传递。 ②信息分子——传递信息的媒介称为信息分子。 ③信息传递的方式，可分为： 1） 直接传递——如局部化学介质，在邻近小群 C 之间传递信息； 2） 间接传递——如激素细胞因子（第一信使）→膜 R 结合，活化，→偶联蛋白（G 蛋白）效应酶活化→级联反应→细胞功能性应答。
SSR分子标记在玉米育种中的研究进展
SSR分子标记在玉米育种中的研究进展摘要简要介绍了SSR分子标记的原理及特点，综述了近年来SSR分子标记在玉米遗传多样性分析、杂种优势群的划分、品种纯度及真伪鉴定、遗传连锁图谱的构建及基因定位、单倍体育种、分子标记辅助选择育种中的研究进展及应用前景，以期为SSR分子标记技术在作物育种中的应用提供参考。
关键词SSR；分子标记；玉米；遗传育种中图分类号S513 文献标识码 A 文章编号1007-5739（2016）07-0015-02Abstract The principle and characteristics of SSR molecular marker were simply introduced，the research advances and application prospect of SSR molecular marker in maize breeding were summarized in past years，such as the analysis of genetic diversity，division of heterosis groups，the detection of the hybred purity and its authenticity，construction of genetic spectrum and gene locating，haploid breeding and selection breeding assisted by molecular markers，in order to provide reference for the application of SSR molecular markers in crop breeding.Key words SSR；molecular markers；maize；geneticbreeding在传统的培育玉米的过程中，选择的依据常为表型的性状，由于受环境等多方面的影响，该依据效率不高，有很多缺点。
利用分子标记辅助育种
利用分子标记辅助育种一、分子标记辅助育种概述分子标记辅助育种是现代生物技术与传统育种方法相结合的一种高效育种技术。
它利用分子标记与目标基因紧密连锁的特性，在作物育种过程中对目标基因进行追踪和选择，从而显著提高育种效率和准确性。
随着分子生物学技术的不断发展，分子标记辅助育种已成为作物遗传改良的重要手段，在农业生产中发挥着越来越重要的作用。
二、分子标记辅助育种的关键技术1. 分子标记类型- SSR标记（简单重复序列标记）：SSR标记具有多态性高、共显性遗传、重复性好等优点。
其核心是由1 - 6个核苷酸组成的简单重复序列，广泛分布于基因组中。
通过设计特异性引物对SSR区域进行扩增，根据扩增产物的长度多态性来检测个体间的差异。
例如，在水稻育种中，利用SSR 标记可以有效区分不同品种的水稻，为品种鉴定和纯度检测提供了可靠的方法。
- SNP标记（单核苷酸多态性标记）：SNP标记是基因组中单个核苷酸的变异，是最常见的遗传变异类型。
它具有数量多、分布广泛、检测通量高的特点。
SNP标记的检测方法包括基于PCR的方法、芯片技术和新一代测序技术等。
在玉米育种中，SNP标记已被广泛应用于全基因组关联分析（GWAS），用于挖掘与重要农艺性状相关的基因位点，为分子标记辅助选择提供了丰富的标记资源。
- AFLP标记（扩增片段长度多态性标记）：AFLP标记结合了RFLP（限制性片段长度多态性）和PCR技术的优点，具有较高的多态性检测效率。
其原理是通过对基因组DNA进行限制性内切酶酶切，然后连接特定的接头，再进行选择性扩增。
扩增产物通过电泳分离，根据片段长度多态性来分析遗传差异。
在小麦育种中，AFLP标记可用于构建遗传连锁图谱，定位控制小麦抗病性、品质等性状的基因。
2. 目标基因定位与克隆- 连锁分析：连锁分析是通过研究标记与目标基因在染色体上的连锁关系来定位目标基因的方法。
当标记与目标基因紧密连锁时，它们在遗传过程中倾向于一起传递。
SSR分子标记剖析
三、实验用品
1. 仪器设备与耗材：PCR扩增仪、电泳仪和电泳槽、 微型移液器、恒温水浴锅、凝胶成像系统等，离心 管、PCR管、移液器枪头等 2. 试剂 ① 提取缓冲液：100mmol/L Tris· Cl，20mmol/L EDTA ，500mmol/L NaCl，1.5% SDS。 ② 氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）。
引物 设计
二
使用,筛选SSR位点
5'锚定PCR 分离SSR标记
K可以跟任何核苷酸配对，V不 能与A配对，R不能与G配对， 其他核苷酸均可与它们配对。 这样，VRVRV五个碱基一起 构成了一个封闭碱基群。在 PCR过程中，由于VRVRV不 能与GA配对，该引物与模板 DNA结合的时候，就不会在 (GA)n重复区滑动，只会结合 在如图1所示的位置上，以保 证SSR位点的长度多态性不会 丢失。
SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等。
2. SSR分子标记的步骤
第一步：基因组DNA 提取 第二步：PCR 第三步：扩增产物电泳检测 第四步：结果分析
微卫星分子标记对18份基因型的扩增结果
3. SSR分子标记引物设计
一
从有关数据库（GenBank, EMBL DDBJ等）或文章中查 询
之用。
2. DNA提取
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ 将玉米幼叶在研钵中加液氮磨成粉状后，取约0.1g放入1.5ml离心管中，立 即加入0.5ml提取缓冲液（60℃水浴预热），摇动混匀。 60℃水浴保温30~60min（时间长，DNA产量高），不时摇动。 加入0.5ml氯仿：异戊醇：乙醇（80：4：16）溶液，颠倒混匀，室温下静 置5~10 min，使水相和有机相分层。 室温下12000rpm离心5 min。 小心移取上清液至另一1.5ml离心管，加入等体积异丙醇，混匀，室温下放 置片刻即出现絮状DNA沉淀。 室温下12000rpm离心5 min，去除上清液，再加入100μl TE溶解沉淀。 加入1/10体积（约10μl）的3mol/L NaAc及二倍体积（约300μl）预冷的无 水乙醇，混匀，-20℃放置20 min左右。 室温下12000rpm离心5 min。 去上清，用1ml 70%乙醇漂洗沉淀二次，待沉淀干燥后，重新加入100μl TE溶解，-20℃贮存,备用。
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ssr分子标记技术及其在玉米种子鉴定上的应用
随着现代农业的发展，种子质量的鉴定变得越来越重要。
其中，分子标记技术成为了种子鉴定的重要手段之一。
SSR分子标记技术是一种基于DNA序列多态性的分子标记技术，具有高度的稳定性、可重复性和高度的信息含量。
本文将介绍SSR分子标记技术及其在玉米种子鉴定上的应用。
一、SSR分子标记技术的基本原理
SSR分子标记技术是基于DNA序列上短重复序列的多态性而开发的一种分子标记技术。
这些短重复序列通常为2-6个碱基的重复序列，如ATATAT、AGAGAG等。
在不同个体中，这些短重复序列的重复次数
和排列方式不同，因此可以用作分子标记。
SSR分子标记技术的基本原理是：首先从待分析的DNA样品中提取出DNA，并使用PCR技术扩增出含有SSR位点的DNA片段。
然后，利用电泳技术将扩增出的DNA片段分离出来，并通过染色体特异性的显色剂进行染色。
最后，通过比较不同个体的DNA条带图谱，确定不同个体之间的遗传差异。
二、SSR分子标记技术在玉米种子鉴定中的应用
SSR分子标记技术在玉米种子鉴定中的应用主要体现在以下几个方面：
1.玉米品种的鉴定
SSR分子标记技术可以通过比较不同玉米品种的DNA条带图谱，确定不同品种之间的遗传差异。
这种方法比传统的形态学鉴定方法更
为准确和可靠。
2.杂交种子的鉴定
杂交种子是由不同品种的玉米杂交而成的，因此杂交种子的遗传背景比较复杂。
使用SSR分子标记技术可以快速准确地鉴定杂交种子的亲本品种，有助于杂交育种的进展。
3.种子纯度的鉴定
种子纯度是指种子中所含的杂质和其他品种的比例。
使用SSR分子标记技术可以准确地鉴定种子的纯度，有助于保证种子的品质和纯度。
4.种子存储的鉴定
种子存储过程中，可能会发生一些突变和遗传变异，从而影响种子的品质和纯度。
使用SSR分子标记技术可以快速准确地鉴定种子存储过程中的遗传变异，有助于提高种子的品质和纯度。
三、SSR分子标记技术在玉米种子鉴定中的应用案例
1.玉米品种的鉴定
一项研究使用SSR分子标记技术对中国南方地区的20个玉米品种进行了鉴定。
结果表明，这20个品种之间的遗传差异较大，可以通过SSR分子标记技术进行准确鉴定。
2.杂交种子的鉴定
一项研究使用SSR分子标记技术对中国南方地区的20个玉米品种进行了杂交育种。
结果表明，SSR分子标记技术可以快速准确地鉴定杂交种子的亲本品种，为杂交育种提供了有力的支持。
3.种子纯度的鉴定
一项研究使用SSR分子标记技术对中国南方地区的20个玉米品种进行了种子纯度鉴定。
结果表明，SSR分子标记技术可以快速准确地鉴定种子的纯度，为种子生产提供了有力的支持。
四、总结
SSR分子标记技术是一种基于DNA序列多态性的分子标记技术，具有高度的稳定性、可重复性和高度的信息含量。
在玉米种子鉴定中，SSR分子标记技术可以用于玉米品种的鉴定、杂交种子的鉴定、种子纯度的鉴定和种子存储的鉴定。
通过SSR分子标记技术的应用，可以提高种子的品质和纯度，为现代农业的发展提供有力的支持。