抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法-(2154)
抗氧化酶测定实验方法
抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类酶系统，它能够抵御氧自由基的伤害，维持细胞内环境的稳定。
常见的抗氧化酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(Cat)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等。
测定抗氧化酶活性能够评估抗氧化能力，进而为疾病的诊断和治疗提供参考。
以下是抗氧化酶测定的实验方法。
实验材料：1.磷酸盐缓冲液：Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH7-8)。
2.高速冰箱和离心机。
3. 0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液：将L-酪氨酸溶解于0.1 mol/L的盐酸溶液中，并加入0.5% (w/v) 卵白饼干碎片。
4.超氧化物解毒酶(SOD)标准品：如肝脏SOD标准品。
5.乙醇、乙醚、碘仿、硝酸等有机试剂。
6.2-(4-碘苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-（二苯嘧啶)-2H-四唑(INT)。
实验步骤：1.组织预处理：取所需组织样品，酶解和离心得到提取液(组织块破碎并添加合适的缓冲液)，离心清除杂质得到上清液。
2. 蛋白质含量检测：根据Bradford法或Lowry法，测定上清液中蛋白质的含量。
3. 测定SOD活性：将上清液加入0.1 mol/L L-酪氨酸盐酸缓冲液，再加入0.5%的乙醇溶液，保护酪氨酸被SOD氧化，使其在酶作用下发生自动降解。
离心，取上清液。
在为反应液中加入INT（2.5 mmol/L），使之在SOD作用下发生氧化还原，反应生成紫色的一价酮衍生物。
在滤紙上滴加提取液，通过比色计测定OD值。
4. 测定Cat活性：将提取液加入3%的过氧化氢溶液并充分混合。
加入乙醚和碘仿的混合物，并离心。
提取水相层和乙醚层。
用硝酸溶液判断乙醚层中是否存在过氧化氢。
通过测定乙醚层吸收光谱的变化来测定Cat 活性。
5. 测定Gpx活性：加入适量的提取液到预先调配的反应体系中。
反应开始后，每2分钟测定OD值，记录10分钟之间的OD变化。
绘制OD值和反应时间的曲线，计算反应速率。
6.数据处理：根据测得的OD值和各反应时间点得到的反应速率，计算出抗氧化酶系数和活性。
植物抗氧化酶的活性测定
植物抗氧化酶的活性测定1植物预处理将植物根和shoots（特指陆生植物所有地上的部分。
少数在地下生长；包括茎、叶、花、果、种子等等）分别在液氮中冷冻，用预冷的研钵和液氮使样本在不含1,4－二硫苏糖醇的QB bufer中形成均质[用于SOD、CAT和GST测定]。
对于GR检测，每克组织添加50mg聚乙烯基吡咯烷酮。
粗匀浆在4℃下15000 g离心15min，将上清液置于−20℃下冷冻。
2活性测定以牛血清白蛋白为标准，采用布拉德福德Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白浓度。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法不适用于小分子碱性多肽的定量测定，如核糖核酸酶或溶菌酶。
去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果。
如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定；2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。
如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。
通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线；3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同（最好用PBS）；4．按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去；5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。
染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。
注意，显色反应不得超过30min；6．根据标准曲线计算待测样本的浓度（缺点，线性拟合效果不好）。
注：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。
待一两周左右，皮屑细胞自然衰老即可脱落。
2.1SOD（超氧歧化酶，具有抗氧化和抗衰老的作用，其作用机理主要是清除对机体有害的超氧阴离子自由基(O2-)）活性的测定参照Roth和Gilbert的方法。
抗氧化酶活性等测定方法
叶绿体得提取一、试剂配宜1、PBS 提取液:每L 水依次加入MES（ 1 9 5 .2x0, 05=9、7 6g）、山梨糖醇（0。
33x182。
2=60. 1 26g）. NaC 1（ 0 . 0 10x58.5=0. 5 85g）. MgC 1 （0.002x95=0. 19g）、EDTA（292> 25x 0.0 0 2 = 0、5 84 5 g）. KH2PO4（ 2 00x0.0005= 0 . 1 g）；使用时加入ASA—Na（198o 1x0、00 2=0、3 962g）;2、悬浮液:将PBS 提取液中得MES 换为238。
3x0.05= 1 1、9 15g 得HEP ES（23J 3x 0。
05=11。
915 g）;3、80%Percol :8 0 ml 原液 + 2 Oinl 水;40%Pcr c ol: 4 0ml 原液+60ml 水;实际配制：PBS提取液2000m 1（3个处理*2个品种* 3个重复* 20ml * 3次=1 0 80m I ）,悬浮液lOOmK 3个处理*2个品种*3个重复*lm I *3次二5 4 ml）;8 0 %Percol 2 0 0ml; 40%Perc o 1 200ml。
（3 个处理*2 个品种*3 个重复左3m I * 3 次=162ml）二、提取步骤k 10g 鲜样加20ml 提取P B S（50mM MESPH6、1,含0、3 3M 山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgC I 2, 2 mM EDTA.O .5 mMKH2PO 4,2mM ASA—Na,AS A—Na 使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液200 Og 3 min.小心倒出上淸液，将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值（水平转头•加速度调到9）,约经30s后很快使英下降停止，整个离心持续大约2-3m i n左右完成；4、沉淀用1 ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用lml 悬浮液（5 OmMHEPESpH 7.6,含0、33 mM 山梨糖醇,1 0 mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA.O。
SOD_测定方法
SOD_测定方法SOD（Superoxide Dismutase）是一种重要的抗氧化酶，它可以将有害的超氧自由基转化为氧和过氧化氢，从而保护细胞免受氧化损伤。
SOD的测定方法有多种，下面将介绍常用的几种方法。
1.超氧根自由基抑制法：该方法通过测定SOD对超氧自由基的抑制能力来测定SOD的活性。
超氧根自由基在存在特定底物的条件下，可以引起化学反应的颜色变化，通过测量这种变化的幅度可以得出样品中SOD的活性。
超氧根自由基抑制法具有可操作性强、结果可靠的特点，是常用的SOD活性测定方法之一2.X射线法：该方法利用X射线产生的自由基对辅酶A的氧化程度来测定SOD活性。
辅酶A在被氧化前后，有很大的吸收差别，可以通过比较吸收光谱来计算SOD活性。
3.含氮蓝法：含氮蓝为特定底物，可以在碱性条件下与还原型NBT（硝基蓝）产生紫色的还原型NBT。
SOD能够阻止NBT的还原反应，因此通过测量样品和对照组在一定时间内的吸光度差值，可以计算出SOD的活性。
4.电化学法：该方法利用电化学生物传感器对SOD的电化学反应进行测定。
在电极表面，SOD催化还原型O2为H2O2，而H2O2又在电极表面电催化为电流。
通过测量电流的大小，可以得出样品中SOD的活性。
这些方法各有优缺点，选择合适的测定方法应根据实验条件和目的来确定。
无论采用何种方法，都需要严格控制实验条件，如温度、时间、pH 值等，以确保测定结果的准确性和可重复性。
鉴于SOD活性在不同组织和物种之间有所差异，建议在研究中同时采用多个测定方法进行验证，以获得更可靠的结果。
SOD POD CAT MDA的测定方法
缩写：SOD：超氧化物歧化酶； CAT：过氧化氢酶； POD：过氧化物酶； MDA：丙二醛；PVP：聚乙烯吡咯烷铜K-30；L-Met：甲硫氨酸；NBT：氮蓝四唑；TBA：硫代巴比妥酸；TCA：三氯乙酸；PBS: 磷酸缓冲液1.SOD的测定方法加样顺序：（V=3ml）磷酸缓冲液：1.5ml L-Met: 0.3ml NBT: 0.3ml EDTA-Na2: 0.3ml 核黄素：0.3ml 酶液：0.05ml 蒸馏水：0.25ml试剂配制：(1) 0.05mol/L PBS：pH7.8(2) 130mmol/L L-Met: 1.9399g Met用PBS定容至100ml(3) 750mmol/L NBT: 0.06133g用PBS定容至100ml(避光保存)(4) 100umol/L EDTA-Na2: 0.03721g用PBS定容至1000ml(5) 20umol/L核黄素: 0.0753g用蒸馏水定容至1000ml(避光保存) 注：（1）对照：以加缓冲液、不照光为空白；照光的为最大还原管(2) 照光后至显蓝色要立即避光放置、迅速测定A560值2.MDA的测定方法试剂配制：（1）5% TCA： 5g用蒸馏水定容至500ml（2）0.5% TBA：2.5g用TCA定容至500ml方法：酶液1ml—3ml0.5%TBA和5%TCA—混合后在100度水浴煮沸15min—迅速冷却，10000r/min离心10min—用蒸馏水调零分别测定上清液在532nm、600nm处的吸收值3.POD的测定方法试剂配制：（1）0.1mol/L的醋酸缓冲液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸缓冲液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸馏水中B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—13.6gNaAc.3H2O（2）0.25%愈创木酚溶液—125um愈创木酚溶于50ml 50%乙醇中（临用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml 30% H2O2定容至50ml（临用前配制）方法：比色杯中依次加入2ml 0.1mol/L的醋酸缓冲液—1ml 0.25%愈创木酚溶液—xml酶液（5min值为500-800即可）—0.1ml 0.75%H2O2溶液—迅速巅到混匀把A460调零并开始计时—1次/30s,连续读取3min4.CAT的测定方法试剂配制：(1) 50mmol/L的PBS（pH7.0） (2) 0.3% H2O2—1ml H2O2定容至100ml 方法：(1)以不加H2O2的50mmol/L的PBS（pH7.0）为空白把A240调零(2)50ul酶液—3ml 50mmol/L的PBS（pH7.0）—0.2ml 0.3% H2O2—迅速颠倒混匀，开始计时—1min后在240nm下比色，1次/1min(连续读取5min)。
SOD、POD等的测定
叶绿素，SOD,MDA,POD,硝酸还原酶等测定方法(2009-04-12 20:40:12)标签：教育分类：教育实验测定方法1 叶绿素含量测定：80％的丙酮液的配制：4L丙酮 + 1L蒸馏水。
称0.5g左右的叶片放在50ml的离心管（做三个重复），加入25ml浓度为80％的丙酮液，放在黑暗处浸提大约36小时后取出，稀释4倍后分别在波长663nm、645nm、652nm和470nm下测定光密度，以80％的丙酮液为空白。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P35～36）也可用95%乙醇溶液，在665、649、470nm处有最大吸收峰Cx.c=(1000D470-2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定：（2.5g样）0.05mol/L磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO4·12H2O + 2.65285g NaH2PO4·2H2O, 定容到4L。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》，P134）。
取低温保存的鲜样，称2g左右的叶片（或根）放在50ml的离心管，加入20ml浓度为0.05mol/L磷酸缓冲溶液（pH=7.8）（最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活），研磨（用磨碎机磨），8000r/min的冷冻离心机下离心20分钟，上清液为粗酶液。
2.1丙二醛（MDA）的测定：20％三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称200g三氯乙酸，用蒸馏水定容到1000ml。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）；0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称5g硫代巴比妥酸（TBA）,用20％三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到1000ml。
（参考陈建勋，王晓峰主编的《植物生理学实验指导》,P124）（先加少量的氢氧化钠1mol/L溶解）；0.5ml酶液（对照用0.5ml的0.05mol/L pH=7.8的磷酸缓冲液代替酶液）（做三个重复）+ 3mlTBA――振荡――沸水浴上反应30min――冷却（至少30min）――比色（OD600、OD532、OD450）。
SOD活性测定
SOD活性测定SOD活性测定：SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。
阻止中间物的积累而测定其酶活性。
1、试剂及仪器(1)邻苯三酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。
(2)UV－754紫外分光光度计。
2、测定方法：(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。
在25度、45ml`50mmol/L、PH值、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在mm 左右。
(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。
－A325mm/min----------------------------------------＊100％度样液稀释倍数样液稀释倍数酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------50％样液体积3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。
蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。
4、比活(u/mg蛋白)的计算：单位活力(u/ml) 总活力比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白超氧化物歧化酶的活性测定超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，简称 SOD)广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。
SOD活性测定
超氧化物歧化酶（SOD）活力测定POD过氧化物酶（英文：Peroxidase）广泛存在于植物体中,是活性较高的一种酶.它与呼吸作用,光合作用及生长素的氧化等都有关系.在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化.一般老化组织中活性较高,幼嫩组织中活性较弱.这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素,增加木质化程度,而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加,所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标.此外,过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视.过氧化物酶能催化过氧化氢氧化酚类,产物为醌类化合物,此化合物进一步缩合或与其他分子缩合,产生颜色较深的化合物.一、目的学习和掌握氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法和原理，并了解SOD的作用特性。
二、原理SOD是含金属辅基的酶。
高等植物含有两种类型的SOD：Mn－SOD和Cu.Zn－SOD，它们都催化下列反应：由于超氧自由基（O2.－）为不稳定自由基，寿命极短，测定SOD活性一般为间接方法。
并利用各种呈色反应来测定SOD的活力。
核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替（黄色），继而还原生成二甲月替，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。
当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替生成速度减慢。
通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT 光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD 抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。
找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。
三、实验材料、主要仪器和试剂1．实验材料小麦、玉米、水稻、棉花等新鲜叶片2．主要仪器（1）722型或其他型号的可见分光光度计（2）万分之一分析天平（3）高速冷冻离心机（4）冰箱（5）光照箱：4 500Lux（6）带盖瓷盘 1个/处理（7）移液管架（8）研钵（9）离心管 5mL数个（10）微烧杯 10～15mL 8个/处理（11）移液管或加样器 0.5mL×4；1mL×2；2mL×2；5mL×1（12）微量进样器50μL×2；100μL×2（13）烧杯 50mL×3；100mL×5；500mL ×1；1 000mL×2（14）量筒 50mL×1；100mL×2（15）容量瓶 50mL×1；100mL×5；250mL×1；1 000mL×2（16）细口瓶 125mL×53．试剂（1）0.1 mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液A液（0.1 mol/L Na2HPO4溶液）：准确称取Na2HPO4· 12H2O（MW=358.14）3.5814g于100mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀。
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抗氧化酶（ SOD、 POD、 CAT ）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD ）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1） 0.05mol/L 磷酸缓冲液 (PBS ， pH7.8) ：A母液： 0.2mol/L 磷酸氢二钠溶液 : 取 Na2HPO4·12H2O（分子量 358.14） 71.7g；B母液： 0.2mol/L 磷酸二氢钠溶液：取 NaH2PO4·2H2O（分子量 156.01） 31.2g。
分别用蒸馏水定容到 1000ml 。
0.05mol/L PBS （ pH7.8 ）的配制：分别取 A 母液 (Na2HPO 4) 228.75ml ，B 母液 (NaH 2PO4) 21.25ml ，用蒸馏水定容至1000ml 。
加入 10gPVP （聚乙烯吡咯烷酮）参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000： 267～ 268。
（2） 130mmol/L 甲硫氨酸溶液：取 1.399g Met 用磷酸缓冲液（ pH7.8 ）定容至 100ml 。
网上说定容到 100ML 我也不懂。
拜托（ 3）100μ mol/L EDTA-Na 2溶液：取 0.03721g EDTA - Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml ；（4） 100μM核黄素溶液：取 0.0075g 核黄素用蒸馏水定容至 100ml ，避光保存，随用随配，并稀释 10 倍（ 5）750μ mol/L 氮蓝四唑（ NBT ）溶液：称取 0.06133g NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml 避光保存；酶液制备：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g 于预冷的研钵中，加2ml 磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，加缓冲液使终体积为10ml 。
取 5ml 于 10000r/min 下离心10min ，上清液即为SOD 粗提液。
提取酶液时如何保存;如果没有测完的需要放在4℃的冰箱里。
2、酶活性测定2．显色反应取试管（要求透明度好） 5 支， 3 支为样品测定管， 1 支为对照管，另外1 支作为空白，按表39-1 加入各溶液。
混匀后将空白管置暗处，其它各管于4000lx日光灯下反应20min （要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。
试剂（酶）0.05mol/L 磷酸缓冲液130mmol/L Met溶液750μ mol/L NBT 溶液100μ mol/L EDTA-Na 2液20μ mol/L 核黄素酶液蒸馏水总体积表 39-1各溶液加入量用量 (ml)终浓度（比色时）1.50.313mmol75μ mol0.310μ mol0.32.0μ mol0.3空白和对照管加缓冲液代替0.05酶液0.253.0加核黄素时记得要快并且要避光，SOD 活性测定与计算至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其它各管560nm 波长下的消光度值，已知 SOD 活性单位以抑制 NBT 光化还原的 50%为一个酶活性单位表示。
按下式计算 SOD 活性：( A 0 A S )V TSOD 总活性 = A00.5 FW V 1式中SOD 总活性以每克鲜重酶单位表示；比活力单位以酶单位/mg 蛋白表示；A 0—照光对照管的消光度值；A S—样品管的消光度值；V T—样液总体积（ml ）；V 1—测定时样品用量（ml）；FW —样重（ g）；蛋白质浓度单位为每克鲜重含蛋白毫克数(mg/g) 。
用荧光灯20w 照 20min 可以吗不可以,二、 POD、CAT 酶活性的测定粗酶液制备同SOD。
1、过氧化物酶（POD ）活性测定（愈创木酚法）（ 1）试剂配制：100mmol/L 磷酸缓冲液 (pH6.0) ：分别取 A 母液 (Na2HPO4 ) 61.5ml 和 B 母液 (NaH 2PO4 ) 438.5ml 混匀即为 1000ml PBS(0.2M ， pH6.0) ；（ 2）反应混合液配制：取 50ml PBS(100mmM ，pH6.0) ，加入 28ul 愈创木酚（ 2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入19ul 30 ％的 H2O2，混匀后保存于冰箱中备用。
（ 3）样品测定：称取 1g，放入预冷研钵，加适量磷酸缓冲液研磨至匀浆以液转入 100ml 容量瓶 ,用磷酸缓冲液定容至刻度，贮于冷处备用。
4000r/min离心15min ，上清取试管 3 支，一支取3ml 反应液并加入磷酸缓冲液1ml 作调零，两支取3ml 反应液并加入 1ml 酶液，立即计时，在470nm 测定，酶隔30s 读书一次。
测一个样加一个，不要全部加上。
（边加样边测定，测定前等待 5 秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）（ 4）酶活性计算：以每min OD值变化（升高）0.01 为1 个酶活性单位（u）。
POD= （A470× Vt） /（ W× Vs×0.01×t）(u/g min)A470：为反应时间内吸光度的变化；W 为样品鲜重(g) ；t为反应时间(min) ； Vt为提取酶液总体积；Vs 为测定时取用酶液体积。
2、过氧化氢酶（CAT ）活性测定（ 1）试剂配制：0.2mol/L 磷酸缓冲液（ pH7.0）：取 A混合后至100ml 。
(加 1gPVP)母液 (Na 2HPO 4) 61.0 ml和 B 母液 (NaH 2PO4 ) 39.0 ml （ 2）反应液配制：吸取 5.68ml 30%的H 2O2（原液）稀释至1000ml，摇匀即可。
（3）样品测定： 1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g 3ml 4 ℃下预冷的 pH7.0 磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。
混合均匀将量瓶置置研钵中，加入 2 ～25ml 容量瓶中，并4 ℃冰箱中静置10min ，取上部澄清液在 4000rpm 下离心 15min ，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
4℃下保存备用 .2.测定：取 10ml 试管 3 支，其中 2 支为样品测定管， 1 支为空白管（加入酶液后在沸水中煮沸 5-10min ，冷却之后加入 H2O2 测定吸光值），按表 40-2 顺序加入试剂。
表 40-2紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管号粗酶液 (ml)pH7.8磷酸 (ml)蒸馏水 (ml)S10.2 1.5 1.0S20.2 1.5 1.0S30.2 1.5 1.025 ℃预热后 ,逐管加入0.3ml 0.1mol/L 的 H2O2 ，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中， 240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数 1 次，共测4min ，待 3 支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
调零用磷酸缓冲液（pH=7.8 ）3.结果计算：以1min 内 A240 减少 0.1 的酶量为 1 个酶活单位（ u）。
过氧化氢酶活性 (u/g/min)= A24 0× Vt/0. 1×V 1×t × FW式中A240 = AS0 －（ AS1+AS2 ）/2AS0 —加入煮死酶液的对照管吸光值；AS1, AS2 —样品管吸光值；Vt —粗酶提取液总体积（ml ）；V1 —测定用粗酶液体积（ml ）；FW —样品鲜重（ g）；0.1 —A240 每下降 0.1 为 1 个酶活单位（ u ）；t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min）五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：10%TCA： 100g 三氯乙酸→ 1L0.6%TBA：0.6g 硫代巴比妥酸, 加少量氢氧化钠（ 1mol/l ）溶解→用10%TCA定容100ml（避光）1mol/l氢氧化钠；称4gNaOH用蒸馏水溶解定容100ml3、测定步骤 :称取剪碎的试材1g，加入 2ml 10％TCA和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8ml TCA进一步研磨，匀浆离心（4000r ）离心 10min ，上清液为样品提取液。
3.显色反应和测定吸取离心的上清液2ml（对照加2ml 蒸馏水），加入 2ml 0.6%TBA 溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。
取上清液测定532nm、 600nm 和450nm波长下的消光度。
(2) 双组分分光光度法按公式③可直接求得植物样品提取液中MDA的浓度。
用上述任一方法求得MDA的浓度，根据植物组织的重量计算测定样品中MDA的含量：MDA（μ mol/g FW ）＝C2(umol/L)=6.45*(D532－D600)－0.56*D450C2－为 MDA的浓度；D450、 D532、 D600分别代表450nm、 532nm和 600nm波长下的消光度值。
七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1、试剂的配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取 0.001g 考马斯亮蓝，溶于 50 ml 90％乙醇中，加入 100 ml 85％（ W/V ）的磷酸（不懂）， 85%是磷酸的质量分数，买回来时直接就是 85%的磷酸，加入 100ml 就行。
再用蒸馏水定容到 1Ｌ，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置 1 个月。
（ 2）100μg/ml 牛血清蛋白（BSA ）标准溶液：称取 25mg BSA 加水溶解后定容至100 ml ，再从中吸取 40ml 用蒸馏水定容至 100 ml （也可取 10mg BSA 定容至 100ml 即为 100μg/ml 标准BSA 溶液）。
2、样品可溶性蛋白含量的测定（1）样品可溶性蛋白含量测定：称取鲜样 0.5g, 用 5ml 蒸馏水或磷酸缓冲液研磨提取。
吸取样品提取液 1.0Ml ，放入具塞试管中 ( 每个样品设置两个重复 ) ，加入 5Ml 考马斯亮蓝 G－250 溶液，充分混合，放置 2Min 后在 595nM 下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。
调零管是用蒸馏水样品中蛋白质的含量(Mg ／ g) ＝C×VT/(V1× FW× 1000) （ 2-2 ）式中 C：查标准曲线值( μg)；VT：提取液总体积(Ml) ；ＦW ：样品鲜重 (g) ； V1 ：测定时加样量(Ml) 。
我就测这五个所以帮下我谢谢。