转基因小鼠的制备

转基因小鼠的制备显微注射法这一方法的实验程序如下：⑴准备假孕母鼠（养母）：将可育雌鼠与输精管结扎后绝育的雄鼠交配，剌激雌鼠发生一系列妊娠变化而得到假孕母鼠作为受精卵转基因后的养母；⑵受精卵的准备：可育雌鼠注射孕马血清与绒毛膜促性腺激素（hcg）促使超排卵。

处理后与可育雄鼠交配。

次日从输卵管内收集受精卵备用；⑶基因导入：用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内；⑷胚胎移植：将已转入基因的受精卵自背部植入假孕母鼠的输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟；⑸对幼鼠的鉴定：①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交，鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）；②建立鼠系，将带有外源基因的小鼠与未经转基因的小鼠交配、传代后，后代有50%机率带有整合的基因供实验用。

也可将合适的组织进行细胞培养建立细胞系；③自小鼠内脏提取rna，与目的基因探针做分子杂交，比鉴定外源基因的表达和表达的组织特异性。

表达产物可以测定活性的，也可直接自血液或组织测定活性蛋白质，常用的方法如酶联免疫吸附试验（elisa）或放射免疫测定（ria）等。

亦可取胚胎进行分析。

显微注射法简化的实验过程如图23-2所示。

我国已有少数实验室（如中国医学科学院基础医学研究所）应用此法进行载脂蛋白tgm研究。

基因打靶与基因剔除技术ES细胞是从哺乳动物早期胚胎发育产生的内胚团（inner cell mass）中分离出来的。

它本身是二倍体，能在体外培养，具有高度的全能性，可以形成包括生殖细胞在内的所有组织，并且在不同的培养条件下表现出不同的功能状态。

这种细胞有两个特点，一是它本身可以分裂、增殖，形成细胞集落；另一特点是经过发育可以形成正常的动物后代。

因此，借用ES细胞系可将人们企望的某种不完整的、无功能基因直接引入到ES细胞中，通过细胞增殖、筛选可得到丧失了某种基因功能的动物后代。

正是由于ES细胞的研究成功与广泛应用，才使得基因打靶与基因剔除技术在转基因动物中的应用成为可能而且近来取得长足发展。

基因打靶是指外源DNA片段上带有与受体细胞染色体相应部位的同源序列，导入ES细胞后在同源部位发生定点整合，这种整合是通过同源重组的方式来实现的。

该方法的一般策略如下：基因剔除----如果外源DNA含有突变失活的基因，定点整合人ES细胞染色体后取代原来的同源序列，即是基因剔除。

将这样的ES细胞转入小鼠胚胎，便可得到基因剔除的基因小鼠。

多采用突变基因（mutated gene）剔除正常基因以产生定位突变（target mutation）。

即首先选定需要突变基因的全部或部分DNA序列，通过插入、修饰、删除或置换等手段落使其突变，成为靶载体，将靶载体导入小鼠ES细胞中，使之与细胞染色体内同源的靶序列进行重组，达到定位突变细胞内该基因的目的。

然后在细胞水平和分子水平筛选富集发生突变细胞，并注射到小鼠囊胚腔内，将这些囊胚导入假孕母鼠子宫中，所产生的子代雄性嵌合鼠与正常雌鼠交配可获得生殖系携带该突变基因的纯合鼠。

最后对纯合鼠的表型、基因型、基因表达及其产生等进行分析。

目前筛选真正发生了同源重组的ES细胞的方案有数种，如正负双向选择法（positive and negative selection,pns）、标记基因的特异位点表达法及PCR法，其中用得最多的方法首推pns法。

其基本原理是：构建含有一段与靶基因同源序列（10～15kb）的载体，该序列的一个外显子插有neo r基因作为正选择的标志，在此序列3’端插有不含启动子的疱疹病毒胸苷激酶（hsv-tk）基因作为负选择，hsv-tk基因由邻近的neo r基因启动子调节。

用电转移（electroporation）法将重组体导入ES细胞，继续作体外培养，并以新霉素（g418）和致死核苷类似物（ganc）作双重筛选。

因随机插入的DNA通常以从头至尾整合入受体细胞DNA中，hsv-tk+基因产物可使ganc转变成一种有毒物质使细胞死亡。

如果发生同源重组，由于tk基因在同源区之外不能整合，neo r基因在同源区之内得以保留，这样受体细胞抗g418有正选择作用，对ganc无转变功能而有负选择作用，因此认为存活的细胞是与导入基因发生同源重组的。

plump等（1992）用基因剔除技术已培育出缺apoe基因的tgm模型，并利用这一as小鼠模型研究了饮食和遗传因素对as的影响。

条件性基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。

目前多采用cre-loxp重组系统（cre-loxp-mediated gene replacement ,cre-loxp recombination system）。

其中cre重组酶来源于侵染大肠杆菌p1噬菌体。

分子量38000，无论在大肠杆菌体内或体外，它都能启动DNA分子间或分子内的联合与重组，重组发生在一个被称为loxp的特异位点（loxp site），且不需要其他的蛋白质因子。

在cre酶存在时，两个loxp位点可以同源重组，切除其中间的部分，留下一个loxp位点。

其原理如上图所示。

研究发现，在哺乳动物细胞中cre重组酶也同样能引起DNA联合和位点特异性重组。

条件性基因剔除系统的建立，使得转基因的目的更加明确，效果也进一步精确可靠，是基因剔除方法上的一个重大突破。

Cre酶作用原理1、cre基因转译成cre酶；2、cre酶作用于基因组上loxp位点；3、cre酶使两个loxp 位点联合；4、两个loxp位点发生同源重组切除x基因及一个loxp位点而仅留下一个loxp 位点。

1、有待于被剔除的基因组上某野生型基因片段；2、将一个loxp位点插在野生型基因片段的3’端；3、将新构建的DNA序列整合到基因组上；4、在cre酶的作用下切除hsv-tk、neo r野生型基因及一个loxp位点；5、经过cre-loxp重组系统作用后所形成的DNA序列。

Cu等（1994）在鼠的ES细胞中利用cre-loxp重组系统进行条件性基因剔除的程序如下：①用常规性基因剔除方法将一段新构建的DNA序列整合至内源基因组，这段新构建的DNA序列由新的（突变的）基因片段，选择性标记基因hsv-tk及neo r、一个将被取代的正常基因片段等几部分组成。

在此新构建的DNA序列中，在可选择性标记基因和正常基因片段的两侧都连有loxp位点；②经过基因剔除的ES细胞被一个编码cre 重组酶载体迅速传染，因此处于两个loxp位点之间的hsv-tk、neo r及正常的野生型基因均在cre酶的作用下而被切除，只在原来的位置上留下了突变的基因和其3’端带有一个loxp位点，其cre-loxp重组系统进行条件性基因剔除程序如上图所示。

基因打靶目前的基因转移技术，如显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等方法，已能有效地将外源基因导入靶细胞内。

但这些导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，可能导致下面几种情况出现：导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺如；导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。

为避免上述情况的出现，最好的途径就是将外源基因导入预先确定的位点。

即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶，而研究该基因的功能或在生物发育中的作用。

随着人类及四十多种微生物基因组测序的完成，发现了大量未知功能的基因，应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向修饰，是研究其功能最直接最有效的手段。

因此，基因打靶就日益成为继基因转移技术后亟待发展的新技术。

同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。

基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术ES细胞是一类具有在体外培养条件下保持未分化状态的增殖能力及分化为多种细胞类型的细胞。

胚胎干细胞注入体内与完整胚胎形成嵌合体后，可以发育形成包括生殖细胞在内的一系列成体组织；正是由于胚胎干细胞的特殊功能，ES细胞基因打靶技术已被广泛地应用于建立转基因动物之中。

打靶载体的构建-------基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列，其中同源序列是同源重组效率的关键因素。

基因打靶载体有基因插入型载体(Gene-insertion vector)和基因置换型载体(Gene—replacement vector)。

插入型载体中与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点，线性化后，同源重组导致基因组序列的重复，从而干扰了目标基因的功能。

置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因外侧，线性化后，同源重组使染色体DNA序列为打靶载体序列替换。

大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。

外源DNA导人的方式-------外源DNA导人的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等。

目前应用最广的是显微注射法。

占接受外源DNA细胞的10％~20％，但显微注射每次只能注射一个细胞，而电穿孔法可同时使许多细胞得到转染。

逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力，可用于时空特异性基因打靶，在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。

基因打靶的筛选方法-----正负双向选择系统、正相选择法。

（1）正负双向选择系统(positive-negative-selection, PNS)-----为了更好地筛选发生同源重组的克隆，1988年Mansour等人设计了PNS, 解决了定点整合与随机整合的鉴别问题。

同源重组时，只有载体的同源区以内部分发生重组，同源区以外部分将被切除。

随机整合时，是在载体的两端将整个载体连入染色体内。

置换型载体含有正负选择基因各一，正选择基因多为neo r在随机整合和同源重组中均可正常表达。

负选择基因3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重组时，tk基因将被切除而丢失，相反在随机整合时，所有的序列均保留（包括tk）。

胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸，而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排除随机整合的细胞株。

故同源重组时，G418和GANC都有抗性，随机整合时对G418有抗性，但对GANC敏感，细胞将被杀死，无整合的将被G418杀死。

用G418作正筛选，选出含有neo r基因的细胞株，再用丙氧鸟苷作负筛选淘汰含有tk基因的细胞株，保留未含有tk基因的同源重组细胞株。