第六章基因芯片分析
基因芯片技术及其应用
基因芯片技术及其应用随着生物学、生命科学的发展，基因芯片技术越来越受到关注。
基因芯片又称为DNA芯片，是一种利用微阵列技术来检测基因表达水平的高通量方法。
基因芯片技术的发展带来了许多应用领域的新成果，包括疾病预测、药物研发等。
本文将介绍基因芯片技术及其应用。
一、基因芯片技术的原理基因芯片技术是一种高通量的生物技术，它利用微阵列生物芯片来检测基因表达的水平。
这种技术利用了DNA分子的特异性与完整性，它可以在任何生物样品中高效地检测出其蛋白质表达水平和基因组变异情况。
基因芯片技术的工作原理基于蛋白质表达水平与基因组变异情况的探测。
首先，需要将基因DNA序列通过逆转录过程转换成mRNA序列，进而使用荧光标记标记mRNA序列。
接下来将标记好的mRNA序列通过微阵列技术固定到芯片上，并使用高通量扫描技术来观察标记后荧光强度的变化程度。
荧光值越高，则说明该基因表达水平越高。
基因芯片技术不仅可以检测基因表达水平，还可以检测基因序列的变异情况，用于了解某种疾病或细胞状态的基因组变化情况。
比如，可以用这种技术针对某种疾病相关的单核苷酸多态性位点检测基因变异情况。
二、基因芯片技术的应用1. 癌症筛查基因芯片技术可用于癌症筛查，将肿瘤组织中的RNA与正常细胞组织的RNA进行比较，寻找表达水平具有显著差别的基因，进而确定这些基因是否与癌症发展相关。
利用这种方法可以更加准确地判断某个癌症的种类、发展程度等。
2. 个性化药物设计基因芯片技术可用于个性化药物设计，通过基因芯片可以确定某个病人，是否会对某种药物产生不良反应，从而确定是否使用该药物。
同时，可以利用基因芯片技术根据病人的基因组变异情况，设计出一种更加适合该病人的药物。
3. 遗传疾病筛查基因芯片技术可用于遗传疾病筛查，利用基因芯片技术可以检测出某些基因的表达水平是否异常，从而确定在某些疾病中，基因的表达水平是否存在异常。
4. 农业和环保应用基因芯片技术不仅可以应用在医学领域，还可以应用于农业和环保领域，例如种植业、畜牧业、水产养殖业等。
基因芯片的设计和应用
基因芯片的设计和应用科技的发展，让人类的生活变得越来越便利。
医学领域也不例外，基因芯片的出现让疾病的诊断和治疗更加精准。
本文将从基因芯片的设计和应用两方面进行探讨。
一、基因芯片的设计基因芯片是一种微型芯片，可以用来分析大量DNA或RNA序列。
在基因芯片的设计中，有两个关键的步骤：探针的设计和探针的引物。
1.探针的设计探针是基因芯片的核心部分。
它可以通过基因序列的互补性进行结合，同时可以检测样本中是否存在这些基因。
探针的设计需要根据不同的应用场景和研究目的进行选择和设计。
2.探针的引物在基因芯片的设计中，探针需要和探针引物进行结合。
探针引物是一种小分子序列，可以通过互补性结合到DNA或RNA的末端。
探针引物对于基因芯片的设计是至关重要的，合理的引物设计可以提高基因芯片的分析效率和准确性。
二、基因芯片的应用基因芯片的应用范围非常广泛。
下面介绍一些常见的应用场景。
1.基因表达分析基因表达分析是基于基因芯片技术的一种方法。
这种方法可以用来研究某个生物体中哪些基因在什么条件下被激活。
通过这种方法可以得到生物体中基因表达的全面信息，对于疾病的研究和治疗非常有帮助。
2.基因检测基因检测是基于基因芯片技术的一种方法。
这种方法可以用来检测某些遗传疾病。
通过这种方法可以对个体的基因信息进行全面、准确地检测，从而帮助医生进行诊断和治疗。
3.个体化治疗个体化治疗是基于基因芯片技术的一种方法。
这种方法可以根据患者的基因信息，为患者提供个体化的治疗方案。
通过这种方法，可以提高治疗的准确性和效果，减少不必要的治疗和药物副作用。
基因芯片的出现，无疑为医学研究和治疗带来了新的希望。
随着技术的不断推进和发展，基因芯片在生物医学领域的应用将会越来越广泛，同时也将会为人类的健康事业做出更大的贡献。
第六章 基因预测和基因结构分析
2. 根据模式序列预测基因 各种基因预测软件 取决于人们对已知基因结构特征的认识
采用统计学方法
基于一个或多个已知序列模式对未知序 列进行分类 启动子结构 外显子、内含子 密码子偏爱性
对发现的模式进行统计检验
原核微生物（大肠杆菌lexA基因的DNA模式） LexA repressor的结合位点（启动子区段） CTGNNNNNNNNNNCAG 与RNA聚合酶相互作用位点（-10至-35的启动 子区）
Arabidopsis(拟南芥 ) Maize(玉米 ) 在GenScan主页粘贴AY364476的DNA序列、选择 “Arabidopsis”作为参照 分析结果（文字和图像）
分析举例（3）
GrailEXP（/grailexp） 分析重复序列 在GrailEXP主页选择参照物种和“Repetive Elements”分析功能、粘贴AY364476的DNA序列 在GrailEXP的分析网页点击“Check results” 分析结果：检测到两处simple repeat（位 于Xa26基因后）
不同的基因预测软件分析结果有差异
综合多个基因预测软件的分析结果
一种分析工具可选择分析基因的不同结构 exon, poly-A, promoter(启动子 ) 重复序列 某些分析工具可选择物种模式（matrix）作 为参照比较对象 某些分析工具可用不同的方式呈现分析结果 （文字或图形）
分析举例（4） Gene Feature Searches （） 包括多个基因预测软件 NNPP分析启动子位点 在BCM的分析主页选择“Gene Feature Searches”
在“Gene Feature Searches”网页粘贴AY364476 序列、选择“NNPP/Eukaryotic-eukaryotic promoter prediction”
基因芯片讲义
展望
尽管基因芯片技术已经在一些科学研究和医 学
临床实践中得到了一些应用，但是在一些领域 尤其
在兽医领域中基因芯片技术还尚处于初步的探 索发
–用生物素标记并经扩增（也可使用其它放大技术 ）的靶序列或样品然后再与芯片上的大量探针进 行杂交 –用链霉亲和素(streptavidin)偶联的荧光素（常用 的荧光素还有lassamine 和phycoerythrin）进行显 色 –图 象 的 采 集 用 落 射 荧 光 显 微 镜 (epifluorescence microscope)、激光共聚焦显微镜或其它荧光显微 装置对片基扫描 –由计算机收集荧光信号，并对每个点的荧光强度 数字化后进行分析。
光刻DNA合成法 点接触法 喷墨法
光刻DNA合成法
寡聚核苷酸原位光刻合成技术是由Affymetrix公司 开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5‘ 羟基末端连上一个光敏保护基。
合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然 后一个5‘端保护的核苷酸单体连接上去，这个过 程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以 更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循 环中探针数目呈指数增长。
优点： 合成效率高，点阵密度高，实现标准化和 批量化大规模生产
缺点： 设备昂贵，技术复杂，反应产率低
点接触法(点膜法)
点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定 的高速点样机器人直接点在芯片上。采用的机器人有一套 计算机控制三维移动装置；多个打印/喷印针的打印/喷印 头；一个减震底座，上面可放内盛探针的多孔板和多个芯 片。根据需要还可以有温度和湿度控制装置；针洗涤装置 。打印/喷印针将探针从多孔板取出直接打印或喷印于芯 片上。直接打印时针头与芯片接触，而在喷印时针头与芯 片保持一定距离。
基因表达谱芯片数据分析及其Bioconductor实现
基因表达谱芯片数据分析及其Bioconductor实现1.表达谱芯片及其应用表达谱DNA芯片（DNA microarrays for gene expression profiles）是指将大量DNA片段或寡核昔酸固定在玻璃、硅、塑料等硬质载体上制备成基因芯片，待测样品中的mRNA被提取后，通过逆转录获得cDNA,并在此过程中标记荧光，然后与包含上千个基因的DNA芯片进行杂交反应30min~20h后，将芯片上未发生结合反应的片段洗去，再对玻片进行激光共聚焦扫描，测定芯片上个点的荧光强度，从而推算出待测样品中各种基因的表达水平。
用于硏究基因表达的芯片可以有两种：①cDNA芯片；② 寡核昔酸芯片。
cDNA芯片技术及载有较长片段的寡核昔酸芯片采用双色荧光系统：U前常用Cy3—dUTP （绿色）标记对照组mRNA, Cy5—dUTP （红色）标记样品组mRNAUl。
用不同波长的荧光扫描芯片，将扫描所得每一点荧光信号值自动输入计•算机并进行信息处理，给出每个点在不同波长下的荧光强度值及其比值（ratio值），同时计算机还给出直观的显色图。
在样品中呈高表达的基因其杂交点呈红色，相反，在对照组中高表达的基因其杂交点呈绿色，在两组中表达水平相当的显黄色，这些信号就代表了样品中基因的转录表达情况⑵。
基因芯片因具有高效率，高通量、高精度以及能平行对照研究等特点，被迅速应用于动、植物和人类基因的研究领域，如病原微生物毒力相关基因的。
基因表达谱可直接检测mRNA的种类及丰度，可以同时分析上万个基因的表达变化，来揭示基因之间表达变化的相互关系。
表达谱芯片可用于研究：①同一个体在同一时间里，不同基因的表达差异。
芯片上固定的已知序列的cDNA或寡聚核昔酸最多可以达到30 000多个序列，与人类全基因组基因数相当，所以基因芯片一次反应儿乎就能够分析整个人的基因⑶。
②同一个体在不同时间里，相同基因的表达差异。
③不同个体的相同基因表达上的差异。
基因工程第6章大分子的分离与分析
temperature 0.5%
4℃-30℃
low melting point 4℃
buffer TAE TBE TPE 50mM (pH7.5～8.0)
(colony or plaque)
Colony growth
positive clones two plates (有/无膜)
Replicating
most colony or plaque is recombinants (white color)
DNA release and crosslinking
Southern,Northern,Western,Dot,colony(plaque) Denature(变性)
hot, extreme pH, orgonic agents, urea Annealing(复性)
complementary ss annealing to form ds Hybridization (杂交)
Kit Qiagen corp.
Isolation, purification and detection of RNA
A typical mammal cell: 10-5g RNA，but 80-85% is rRNA(28S,18S,5.8S and or 5S (23S,16S,5S),and 15～20% consist of small RNA（e.g. tRNA，hsRNA etc.）.
EDTA：Mg2+，DNase inhibitor
SDS：resolve membrane protein and lipid to break cell membrane; resolve nuclear membrane and nucleosome to release nucleic acid; partially inhibit RNase and DNase; denature protein.
基因芯片数据处理流程与分析介绍
基因芯片数据处理流程与分析介绍关键词：基因芯片数据处理当人类基因体定序计划的重要里程碑完成之后，生命科学正式迈入了一个后基因体时代，基因芯片(microarray)的出现让研究人员得以宏观的视野来探讨分子机转。
不过分析是相当复杂的学问，正因为基因芯片成千上万的信息使得分析数据量庞大，更需要应用到生物统计与生物信息相关软件的协助。
要取得一完整的数据结果，除了前端的实验设计与操作的无暇外，如何以精确的分析取得可信数据，运筹帷幄于方寸之间，更是画龙点睛的关键。
基因芯片的应用基因芯片可以同时针对生物体内数以千计的基因进行表现量分析，对于科学研究者而言，不论是细胞的生命周期、生化调控路径、蛋白质交互作用关系等等研究，或是药物研发中对于药物作用目标基因的筛选，到临床的疾病诊断预测，都为基因芯片可以发挥功用的范畴。
基因表现图谱抓取了时间点当下所有的动态基因表现情形，将所有的探针所代表的基因与荧光强度转换成基本数据(raw data)后，仿如尚未解密前的达文西密码，隐藏的奥秘由丝丝的线索串联绵延，有待专家抽丝剥茧，如剥洋葱般从外而内层层解析出数千数万数据下的隐晦含义。
要获得有意义的分析结果，恐怕不能如泼墨画般洒脱随兴所致。
从raw data取得后，需要一连贯的分析流程(图一)，经过许多统计方法，才能条清理明的将raw data整理出一初步的分析数据，当处理到取得实验组除以对照组的对数值后(Iog2 ratio)，大约完成初步的统计工作，可进展到下一步的进阶分析阶段。
Rosetta profile error model calculation2Sqweeze replicated probes^Normalize intensities (exclude flagged ^nd wontroldata) with median scaling"Basic statistic plot and Pearson correlationcoefficient^Combine tech nicar repeatPairwise ratid calculation图一、整体分析流程。
第六章分子生物学研究法
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第一节 基因表达研究技术
2 RNA的选择性剪接技术
❖ RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前 体产生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪 切、5’选择性剪 切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及 相 互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在 选择性剪切。
负对照， mRNA的 同义 链, 无杂交 信号
2020/8/14
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正对照， UBQ10杂交信 号遍布于 整个 胚珠
第一节 基因表达研究技术
3. 原位杂交技术
❖ 荧光原位杂交（FISH）
❖ 首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后用原位杂 交法与靶染色体或DNA上特定 的序列结合，再通过与荧光 素分子相耦联的 单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上 的 位置。
2020/8/14
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寡核苷酸 介导的 DNA 突变技 术
2020/8/14
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重叠延伸介导的定点诱变
2020/8/14
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大引物诱变法
第二节 基因敲除技术
1. 基本原理
❖ 经典遗传学（Forward genetics）是从一 个突变体的表型 出发，研究其基因型，进而 找出该基因的编码序列。
❖ 现代遗传学（Reverse genetics，反向遗传 学）首先从基 因序列出发，推测其表现
❖ T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最 为广泛的基 因敲除手段。
❖ 利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报 告基因的 DNA序列整合到基因组DNA上，如 果这段DNA插入到目 的基因内部或附近，就 会影响该基因的表达，从而使该 基因“失 活”。
❖ LongSAGE技术。标签来自转录物3’端一段21bp的序列， 可 以进行快速分析并与基因组序列数据相匹 配。其原理与 ShortSAGE方法类似，只是 用了不同的IIS类标签酶（ MmeI），并将程 序做了相应修改。
现代分子生物学课件-第六章上课讲义
6.3.5 RNAi技术及其应用
RNAi（RNA interference ，RNA干扰）技术： 利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源 mRNA从而阻断靶基因的表达，使细胞胞出现 靶基因缺失的表型。
dsRNA：双链RNA；siRNA：short interfering RNA，小分子干扰RNA。
异构体BTLAi（BTLA isoform）的氨基酸序列比对及其结构分析
BTLAi和BTLA跨膜预测
BTLA和BTLAi的跨膜螺旋段预测结果
A: BTLAi; B: BTLA
融合蛋白BTLAs-DsRed2和BTLAs-DsRed2的 在转染细胞膜上表达的检测
图3.5 流式细胞术检测HVEM-Fc融合蛋白和单抗MIH26与基因转染细胞结合的结果
图6-15 酵母单杂交的基因原理示意图
6.3.2 酵母双杂交系统
酵母双杂技术主要用于研究蛋白质之间的 相互作用。
酵母双杂系统利用了真核生物转录调控因 子的组件式结构特征：DNA结合结构域；转录 激活结构域。
酵母双杂原理示意图：图6-17。
GTAC 连接，形成多联体
CATG GTAC
克隆，测序
计算机数据分析
6.1.2 RNA的选择性剪接技术
RNA选择性剪接是指用不同的剪接方式从一 个mRNA前体产生不同的mRNA剪接体的过程。
选择性剪接一般分为：平衡剪接，5’ 选择性剪接， 3’选项择性剪接，外显子遗漏和相互排斥性剪接。 如6-2。
策略与步骤
6.3 蛋白质及RNA相互作用技术
6.3.1 酵母单杂交系统(yeast one-hybrid system)
20世纪90年代发展，用于研究蛋白质—DNA相 互作用。在酵母细胞内研究真核生
第六章分子生物学基本研究法(下)基因功能研究技术
EST的应用
1.ESTs与基因识别
● 在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs)。 ● 在不同物种间搜寻功能相同的基因(orthologs)。 ● 已知基因的不同剪切模式的搜寻。
2.ESTs与基因图谱的绘制
3.ESTs与基因预测
对预测基因的交替剪切和3‘ 非翻译区很有效。
4.ESTs与SNPs
不同个体冗余的ESTs可用于发现基因组中转录区域的SNP。
5.利用ESTs大规模分析基因表达水平
因准化和差减杂交的cDNA EST分析特定组织的基因表达谱。
ESTs数据的不足
◆ ESTs很短，没有给出完整的表达序列； ◆ 低丰度表达基因不易获得。 ◆ 由于只是一轮测序结果，出错率达2%-5%； ◆ 有时有载体序列和核外mRNA来源的cDNA污染或
分子杂交类型
根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为3种类型：
Southern杂交：将DNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上， 然后与核酸探针进行杂交。由E.M.Southern于1975年创立。 Northern杂交：将RNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上， 然后与核酸探针进行杂交。 Western杂交：将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上， 然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质进行反应。
（2）基因表达系列分析技术 (serial analysis of expression, SAGE） 以DNA序列测定为基础分析全基因组表达模式的技术。
（3）高通量测序技术
Sanger双脱氧核苷酸链终止法
原理：
双脱氧（2′，3′）-核苷酸可以象2′-脱氧核苷酸那样直接掺 入新合成的DNA链中，但因3′ 端不具OH基，DNA链合成 至此终止。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位 置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。