菊苣农杆菌介导转化受体系统的研究(简报)

１３Ｏ一１３４　２／２００８　草　业学报　

ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ　第１７卷第１期　

Ｖｏ１．１７，Ｎｏ．１　

菊苣农杆菌介导转化受体系统的研究（简报）　

程林梅　，孙毅　，王亦学　，吴家和　（１．山西省农业生物技术研究中心，山西太原０３００３１；２．山西省农业科学院棉花研究所，山西运城０４４０００）　

摘要：对影响菊苣转化受体系统几种重要因素进行了初步探讨。研究结果表明，采用菊苣叶片、茎段作为外植体，　在ＭＳ＋６一ＢＡ　１．５　ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ　０．２　ｍｇ／Ｌ培养基上．再生频率达ｌＯＯ％，农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４介导菊苣遗传转化体　系中，经生根后２Ｏ～２５　ｄ的叶片．遗传转化效果最佳。共培养２　ｄ，同时附加２Ｏ～２５　ｍｇ／Ｌ卡那霉素和５００～６００　ｍｇ／Ｌ头孢霉素，转化频率由１．５　提高到７．１　左右。　关键词：菊苣；农杆菌介导；受体系统；转化　中图分类号：￥６８２．１　；Ｑ９４３．１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００４—５７５９（２００８）０１—０１３０—０５　

干旱、盐渍和土壤沙化是影响全球农业生产与生态环境的重要因素，在我国干旱、半干旱地区的盐碱地占国　土面积的１／２左右，严重的制约农业生产的发展。选育抗盐碱、耐干旱能力强的作物，提高林木、牧草耐旱耐盐性　是解决干旱和盐渍的一条经济有效的途径。近几年，由于西部大开发战略的实施以及生态建设事业的需要，培育　优质抗逆的牧草和草坪草品种Ｆｔ益成为研究的热点问题［１］，并被列入国家“十五”转基因植物研究与产业化重大　专项嘲。因此，随着基因克隆和转基因技术手段的不断完善，将一些与抗性密切相关的外源目的基因导人栽培植　物中来提高其抗性，已经引起国内外科学家的广泛关注。　菊苣（Ｃｉｃｈｏｒｉｕｎ　ｉｎｔｙｂｕｓ）为菊科菊苣属多年生草本植物，不仅是一种高产优质的牧草，而且还具有食用、药　用和观赏等诸多方面的开发潜力　。　。因此，大力开展菊苣的研究工作对农业产业化结构调整、退耕还林、还草　和畜牧业的发展具有重要的现实意义。本研究采用农杆菌（Ａｇｒ０比ｃ　ｒ　“　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）介导法，将抗坏血酸过　氧化物酶（ａｓｃｏｒｂａｔｅ　ｐｅｅｏｘｉｄａｓｅ，ＡＰＸ）基因导人菊苣中，提高其体内ＡＰＸ水平，增强抗逆性。然而，建立良好的　基因转化受体系统是植物基因工程的基础［６］。本研究对影响菊苣遗传转化系统的几种相关因素进行了研究，建　立起良好的基因转化受体系统，为今后进一步开展菊苣的遗传转化奠定了基础。　１材料与方法　１．１材料　采用新西兰引进的菊苣品种——普那（ｐｎａ）Ｌ３“　进行实验。　１．２根癌农杆茵及质粒　农杆菌菌株为ＬＢＡ４４０４，质粒载体为ＰＢｉｎ４３８，载体上带有抗卡那霉素选择标记基因和抗坏血酸过氧化物酶　

基因，由ＣａＭＶ　３５Ｓ启动子调控。　１．３培养基种类　再生培养基：ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）＋６－苄基嘌呤（６－ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ，６－ＢＡ）１．５　ｍｇ／Ｌ＋吲哚丁酸（ｉｎ—　ｄｏｌｅ一３一ｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ，ＩＢＡ）０．２　ｍｇ／Ｌ￣继代培养基：Ｍｓ＋６－ＢＡ　１．０　ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ￣生根培养基：１／２ＭＳ＋　１一　萘乙酸（ｎａｐｈｃｔｈｙｌ　ａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ，ＮＡＡ）０．１　ｍｇ／Ｌ；预培养培养基：Ｍｓ＋６－ＢＡ　１．５　ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ　０．２　ｍｇ／Ｌ，共培　养培养基；Ｍｓ＋６一ＢＡ　１．５　ｍｇ／Ｌ＋ＩＢＡ　０．２　ｍｇ／Ｌ＋卡那霉素（Ｋａｎ）１０　ｍｇ／Ｌ＋头孢霉素（ｃｅｆ）６００　ｍｇ／Ｌ，筛选生　根培养基：１／２ＭＳ＋ＮＡＡ　０．１　ｍｇ／Ｌ＋Ｋａｎ　１０　ｍｇ／Ｌ＋ｅｅｆ　５００　ｍｇ／Ｌ。　以上培养基蔗糖均为３　ｏ，４，生根培养基为２％，ｐＨ值５．８，琼脂０．６　ｏ，４。　

收稿日期：２００７—０４—１７；改回Ｆｔ期：２００７－０８－１４　基金项目：山西省自然科学基金项目（Ｎｏ．２００６０１１９２）和山西省农业科学院高薪项目（Ｎｏ．ＹＧＸ０５０７）资助。　作者简介：程林梅（１９５４－），女，山西太原人，副研究员。Ｅ—ｍａｉｌ：ｃｈｌｍｌ０００＠１６３．ｃｏｍ　

维普资讯 http://www.cqvip.com 第１７卷第１期　草业学报２００８年　１．４　方法　无菌苗的制备，选用籽粒饱满的菊苣种子，用纱布包好，先用洗洁剂漂洗３　ｒａｉｎ，然后用自来水冲洗３次，用　７５％酒精灭菌２　ｒａｉｎ，０．Ｉ％ＨｇＣ１　灭菌２０　ｒａｉｎ，最后用无菌水冲洗５或６次后接种到１／２Ｍｓ培养基上。待小苗　长大后，取叶片和茎段切成５～６　ｍｍ小块，接种到直径９　ｃｍ培养皿的再生培养基上，每个培养皿放２Ｏ块，待分　化成植株后接种到继代培养基上以单株方式增殖继代，小苗长到３～４　ｃｍ高时，转移到生根培养基上，大约７　ｄ　左右开始生根，生根后小苗迅速长大，１５　ｄ左右根系较发达，２５～３０　ｄ取健壮的叶片和茎段作为转化受体材料，　进行遗传转化，培养期间的温度全部控制在２０￣２８℃，培养室每天光照１２　ｈ，光照强度３　０００　ｌｘ。　１．５　转化　农杆菌介导采用Ｈｏｒｓｃｈ等　和Ｎｅｈｒａ等　。　的方法。首先挑取农杆菌菌落接种于含卡那霉素５０　ｍｇ／Ｌ　ＹＥＢ　（ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｌｔ　ｂｒｏｔｈ）液体培养基中，在２８℃下振荡培养，农杆菌菌液ＯＤ６。。（ｏｐｔｉｌａｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ，光密度）值应达到０．５　左右，浸染预培养２～３　ｄ后的菊苣叶片，在菌液中浸泡５～８　ｒａｉｎ，用蒸馏水洗１遍，随后用无菌滤纸吸干叶片上　多余的菌液，放在再生培养基上共培养３　ｄ后，转到附加卡那霉素１０　ｍｇ／Ｌ与头孢霉素６００　ｍｇ／Ｌ的再生培养基　上培养１周，然后转到头孢霉素不变，卡那霉素增加到２０　ｍｇ／Ｌ的培养基上继续培养２周，筛选出不定芽，在附　加卡那霉素３０　ｍｇ／Ｌ继代培养基上继续筛选并增殖，待不定芽长大取叶片培养于附加卡那霉素２０　ｍｇ／Ｌ再生培　养基上观察转化植株的再生情况，继续进行转化体的筛选培养，每４周换１次新鲜培养基，并将卡那霉素降低到　１０　ｍｇ／Ｌ。用这种方法可作为转化芽的早期鉴定。　２结果与分析　２．１　外植体类型和生理状态对转化的影响　表１不同外植体对转化芽诱导的影响　２．１．１不同外植体对转化芽诱导的影响　正确的选　择外植体是植物转基因操作成功的重要条件，作为转　基因外植体材料及植物的各个组织器官使转化率有明　显的不同，选用再生频率高达１００　的叶片和茎段进　行转化，结果表明，茎段的转化芽诱导频率明显低于叶　片，虽然茎段转化芽出现的时间较叶片转化芽早４～５　ｄ，但转化芽没有叶片健壮（表Ｉ）。　

Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｘｐｌａｎｔｓ　ｏｎ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｂｕｄｓ　

２．１．２外植体生理状态对转化芽诱导的影响植物体任何器官都可以作为建立再生系统的外植体，甚至作为植　物基因转化的外植体，并能接受外植体基因的整合，但不同部位组织细胞发育年龄和生理状态不同，会导致农杆　菌感染存在差异。采用再生频率为１００　的叶片和茎段进行转化，未经生根的叶片和茎段转化芽为０，生根５　ｄ　后转化芽诱导率开始呈明显上升趋势，并且叶片较茎段的转化频率高，２０　ｄ达到最高，为５．８％，２５　ｄ后开始呈下　降趋势。所以选用生根后２０￣２５　ｄ叶片作为转化的外植体具有较高的转化频率（图Ｉ）。　２．２培养方法对转化的影响　２．２．１外植体预培养、浸泡和共培养时间对转化频率的影响农杆菌与外植体共培养在整个转化过程中是非常　重要的环节，通过农杆菌附着Ｔ－ＤＮＡ（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ　ＤＮＡ）的转移和整合都在这个时期完成。因此，掌握共培养技　术是转化成功的关键［ｇ］。不进行预培养，直接用农杆菌感染叶片，转化诱导频率为０ｃ　］，所以，选用经过预培养２　ｄ的外植体，菌液ＯＤ。。。为０．５时，设计共培养时间为１，２，３，４和５　ｄ，浸染外植体叶片时间为２，４，６，８和１０　ｒａｉｎ，　进行了转化实验。结果表明，农杆菌浸泡时间和共培养时间均对菊苣的转化有较大影响，浸泡６　ｒａｉｎ及共培养２　ｄ效果最佳（图２）。　２．２．２转化细胞的选择选择转化细胞是植物基因转化的重要步骤，植物转基因中通常有２种目的需要抗生　素：一是抑制农杆菌的生长；二是筛选转化细胞。只有转化获得了抗生素基因的细胞才能在抗生素的选择培养基　上生长，当选择的抗生素浓度过低时，会获得许多假阳性植株，造成后期选择困难，当抗生素浓度过高时，又会抑　制一些真正的转化细胞生长，降低培养效率。所以，确定和选择适宜的抗生素浓度是转化系统必不可少的步骤。　

维普资讯 http://www.cqvip.com １３２　ＡＣＴＡ　ＰＲＡＴＡＣＵＬＴＵＲＡＥ　ＳＩＮＩＣＡ（Ｖ０ｌ＿１７，Ｎｏ．１）　２／２００８　卡那霉素和头孢霉素对叶片的再生能力有很大的抑制作用　］。为了筛选较合适的卡那霉素浓度，设计了　５个卡那霉素浓度，分别为０，１０，２０，３０和４０　ｍｇ／Ｌ，结果显示，２０　ｍｇ／Ｌ的卡那霉素较为适宜，分化频率达７０　。　卡那霉素４０　ｍｇ／Ｌ条件下，分化频率显著降低，并且在较短的时间内外植体很快褐化、坏死。本实验结果与豆科　牧草百脉根（Ｌｏｔｕｓ　ｃｏｍｉｃｕｌａｔｕｓ）相似　］。附加２０　ｍｇ／Ｌ卡那霉素和５００～６００　ｍｇ／Ｌ头孢霉素是菊苣转化筛选　的最佳条件（表２）。同时，还进行了卡那霉素选择压的实验。首先选择压力为１０　ｍｇ／Ｌ卡那霉素，经过１０　ｄ后增　加到２０　ｍｇ／Ｌ，这样就最大限度地保留了可能获得的转化芽，随后移栽到卡那霉素为２０　ｍｇ／Ｌ生根培养基上，延　长选择压力，降低非转化芽的比例。筛选２０　ｄ后，将生长良好的芽转到无卡那霉素生根培养基上并能正常生根，　３０　ｄ后移栽成活（图３和４）。　３讨论　菊苣不同外植体影响诱导芽的再生能力和农杆菌的感受能力。本实验中发现，菊苣叶片、茎段、花蕾和花瓣　４种外植体诱导再生频率有较大差异，叶片和茎段诱导再生频率为１００　，而花蕾次之，只有２０　，花瓣几乎为　０Ｅ　］。用再生频率为１００　的叶片和茎段进行转化，叶片转化率明显高于茎段，虽然茎段转化芽出现的时间比叶　

片早４～５　ｄ，但芽没有叶片健壮。ＭｅｙｅｒｓＥ¨　研究农杆菌转化机理指出，转化细胞只发生在细胞分裂的一个较短　时间内，因为核基因组ＤＮＡ只有在复制时才能使外源ＤＮＡ整合，所以可能只处于细胞分裂周期的Ｓ期（ＤＮＡ　合成期）才具有外源基因转化能力。发育早期的组织，如分生组织、维管束形成层组织、薄壁组织及胚、雄配子体　和雌配子体等，这些组织的细胞具有很强的分裂能力。