菊苣农杆菌介导转化受体系统的研究(简报)
基因工程转化实验报告(3篇)

第1篇一、实验目的1. 理解基因工程转化实验的基本原理和方法。
2. 掌握基因工程转化实验的操作步骤和技巧。
3. 通过实验,验证基因转化效果,为后续研究提供基础数据。
二、实验原理基因工程转化实验是将目的基因导入受体细胞的过程。
根据受体细胞的不同,转化方法也有所区别。
本实验采用农杆菌介导转化法,将目的基因导入植物细胞。
三、实验材料1. 受体植物:小麦植株2. 转化质粒:含目的基因的质粒3. 农杆菌:具有转化能力的农杆菌菌株4. 实验试剂:氯化钙、CaCl2溶液、IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、抗菌素等5. 实验仪器:超净工作台、无菌操作箱、移液器、离心机、培养箱、显微镜等四、实验步骤1. 农杆菌活化与扩大培养(1)将冻存的农杆菌菌株复苏,在含有抗菌素的LB培养基中扩大培养。
(2)将培养好的农杆菌转移到无菌条件下,用移液器吸取适量菌液,加入含有转化质粒的LB培养基中。
(3)将菌液在摇床上振荡培养过夜。
2. 农杆菌转化(1)将小麦叶片进行表面消毒,用无菌移液器吸取适量菌液,滴在叶片表面。
(2)将叶片放入无菌培养皿中,在黑暗条件下共培养3-5天。
3. 农杆菌侵染与再生(1)将共培养后的叶片转移到含有抗菌素的培养基上,进行再生培养。
(2)待再生植株长出后,进行筛选,去除未转化植株。
4. 转化植株PCR检测(1)提取转化植株的总DNA。
(2)设计目的基因的引物,进行PCR扩增。
(3)观察PCR产物,判断转化效果。
五、实验结果与分析1. 农杆菌活化与扩大培养实验中,农杆菌菌株在LB培养基中生长良好,菌液呈均匀浑浊状。
2. 农杆菌转化共培养后,小麦叶片出现明显的不定芽,表明农杆菌已成功侵染植物细胞。
3. 农杆菌侵染与再生再生培养过程中,部分植株长出不定芽,表明农杆菌已成功转化植物细胞。
4. 转化植株PCR检测PCR检测结果显示,部分转化植株扩增出目的基因片段,表明基因转化成功。
六、实验结论本实验采用农杆菌介导转化法,成功将目的基因导入小麦植株。
农杆菌介导的瞬时表达系统

农杆菌介导的瞬时表达系统一.溶液配制乙酰丁香酮AS 0.1M,取0.101gAS溶于5mLDMSO中,在工作台上用灭过菌的0.45μM滤膜过滤,分装入无菌小管,-20℃冰冻保存;MES 1M 调pH=5.6,过滤除菌;MgCl2 1M 过滤后灭菌;Kan 终浓度100mg/ml,过滤除菌。
(AS ,MES均购自泰安齐旺试剂公司)YEB过夜培养液(30ml)MES AS Kan 10mM20μM50μg/ mL300μl6μl15μl悬浮培养液(50ml)MES 10mM 500μl AS 200μM 100μl MgCl2 10mM 500μl YEB培养基(pH 7.2)酵母膏牛肉膏蛋白胨蔗糖MgSO4·7H2O 1g/L5g/L5g/L5g/L 493mg/L二.操作步骤1. 挑起单个农杆菌菌落,接种3mL YEB培养基(含抗生素)在200r/min,28℃摇床培养过夜,储存时间比较长的菌液可多活化两次;2. 接种2mL过夜培养的50mL的YEB液体培养基(含抗生素,10mM MES和20μM乙酰丁香酮),28℃摇床培养2-4h;3. 将上述过夜培养菌液在4℃,8000g下离心6min,收集菌体;4. 用渗透培养液重新悬浮沉淀的农杆菌细胞。
调节浓度OD600至0.5-1.0(一般需要100-150mL渗透培养液),置室温培养至少3小时,无需振荡;5. 对需要渗透处理的烟草植株无一定大小要求,一般4-5叶期,已经生长一个月左右的本生烟比较合适。
一般渗透处理下部2-3个比较大的叶片。
用针头在需要渗透处理的叶片背面非常细微地扎一细小的浅微孔,然后用3mL的无针头的注射器吸取2-3mL悬浮有农杆菌的渗透培养液,从针孔处将培养液轻微的注入叶片内。
注意用一手指从叶片下面拖住叶片,将注射器平平地堵住针孔,不让液体从叶片边缘挤压出来。
注射区域接近叶片边缘即可或根据自己的实验目的决定;6. 将处理过的烟草放回温室,照常管理。
农杆菌介导浸花法侵染拟南芥

农杆菌介导浸花法侵染拟南芥一、实验目的1.了解浸花法(floral tip)转化的机理;2.掌握拟南芥浸花法(floral tip)转化的技术二、实验原理拟南芥的花序大量产生时,将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡20秒,3-4周后对转化植株收种子。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选,能够健康生长的幼苗为转基因植株。
三、实验材料及仪器材料:生殖期的拟南芥植株,含目的基因质粒的农杆菌(PCAMIBIA 3301-ZEP),无菌滤纸仪器设备:超净工作台,恒温摇床,培养箱,台式高速离心机,涡旋仪,抽滤器,高压灭菌锅,电子天平,酸度计,培养室用具:微量移液器,金属药匙,牙科手术钩或细菌涂布器,100 ml无菌三角瓶,直径9 cm 培养,200 ml及1ml tip枪头,枪形镊四、实验步骤1)当野生型株系的拟南芥植株生长了个月左右。
将其主薹剪掉,待其次生薹长出,浸染前剪掉植株上的果荚和已经完全开放的花;2)将农杆菌菌液扩大培养接入到250 ml含有50 μg/ml的Kan和Rif的YEP的液体培养基中:3)将装有250 ml YEP液体培养基的500 ml三角瓶置于28℃ 200 rpm下振荡培养24 h;4)分批次将250 ml YEP液体培养基装在50 ml离心管中多次离心,每次7500 rpm离心5 min,直到把所有的农杆菌都聚集在管底;5)用5%的蔗糖溶液。
其中加了0.02%-0.05% (VV)的silwet L-77来重新悬浮聚集在管底的农杆菌,直到把浓度稀释到OD600为1.5左右即可;6)把蔗糖溶液重悬的农杆菌菌液放入50 ml 离心管中,将花盆倒转过来,将花序浸入农杆菌中20 s,轻轻转动和晃动植物,保证腋芽生长的花都能浸到液体溶液中,取出后能看见植物上有一层水膜,轻轻晃动植物3-5 s抖掉过多的液体(花在液体中浸泡时间过长有所伤害)。
7)浸染过得植株放置在塑料盆中并用一个高的遮光的袋子遮住植株以保持其湿度,并将盆置于弱光或黑暗的条件下一天;8)将其遮光袋拿去,移到智能气候室培养,并定期补浇营养液,直到角果成熟收获种。
农杆菌介导遗传转化原理

!
冠瘿碱代谢基因
农杆菌转化植物的过程 •植物受伤部位酚类化合物的分泌 •附着(chvA、chvB) •VirA/G的双组分系统感受受伤信号 (signal to A Pi to G) •其他Vir基因的表达 •T-DNA链的切出(VirD1+VirD2;Border to Border) •T-complex的形成 •运输(从细菌中输出、进入入植物细胞、入入核) •整合
A
B
C
PCR(A)、RT-PCR(B)和 Southern(C)鉴定结果
影响植物农杆菌转化效率的因素 •植物品种(基因型效应); •农杆菌菌株及载体; •起始材料; •侵染所用用菌浓度(OD值); •共培养条件(温度、时间、光照、培养基成分); •共培养之后的筛选方方式; 等等;
农杆菌介导的 植物遗传转化
农杆菌的分类 革革兰氏氏阴性菌、杆状; 按侵染植物的后果分为: •根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 形成冠瘿(crown gall) •发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) 形成发根(hairy root)
按合成/代谢冠瘿碱(Opine)的种类,根癌农杆菌分为 : •章⻥鱼碱(Octopine)型 •胭脂碱(Nopaline)型 •农杆碱(Agropine)型
The Plant Cell, Vol. 18, 3350–3352
冠瘿病的害处: 苗木木感病后发育受阻;生生⻓长缓慢;植株矮小小;严重 时叶片片萎蔫、早衰,甚至至死亡; 大大树受害后树势衰弱,生生⻓长不良,提前落叶,果实 变小小,树龄缩短。主干受害降低材质及工工艺价值。
农杆菌能够导致植物产生生冠瘿病的原因: Ti(Ri)质粒
•T-complex的转运 通过细菌细胞壁上由11个VirB蛋白白和VirD4组成的通 道从农杆菌向外输出
农杆菌转化原理及技术

农杆菌侵染过程
❖ 损伤的植物细胞产生植物酚类作为农杆菌的侵染信号;
❖ 这些化学诱导物透过农杆菌的细胞膜,活化virA和 virG 基因,再诱导Vir区的其他基因;
❖ Vir基因的活化,作用于T-DNA的加工及T-DNA的转移; ❖ T-DNA进入植物细胞后整合到核DNA上; ❖ T-DNA在植物细胞中表达产生冠瘿碱及植物激素; ❖ 农杆菌Ti质粒上有专一性的冠瘿碱分解酶基因(ocs),该基
❖ 5.愈伤组织的筛选
❖ 将愈伤转移至选择培养基筛选抗性愈伤,每两周转 接1次。
抗性愈伤
非抗性愈伤
❖ 6.抗性愈伤组织的继代与植株的再生
❖ 每两周将愈伤转移至新选择培养基上,约需三周即 可见瘤状鲜黄色抗性愈伤从褐化干瘪的愈伤中长出。 待愈伤长大后挑选抗性愈伤的一部分转移至分化培 养基上。2周后愈伤开始转绿,3周后即可长出幼芽, 随后根也长出。将幼苗移至生根培养基上,每培养 瓶1个克隆。待幼苗生根长成后,移出培养瓶,洗 净根上的培养基后,移至温室盆栽。
❖ 1.诱导培养基:NB+2,4-D2 mg·L-1 ;pH 5.8-5.9。 ❖ 2.预培养培养基:NB+2,4-D2 mg·L-1 ;pH 5.8-5.9。 ❖ 3.共培养培养基:NB+2,4-D2 mg·L-1 +AS100 µM·L-1 ;pH 5.2。 ❖ 4.选择培养基:NB+2,4-D 2mg·L-1 + 羧苄青霉素 250mg·L-1 + Hyg
+ cytokinin
This procedure is easy for dicotyledone plants
(legumes etc)
Agrobacterium tum efaciens
农杆菌介导的水稻转化

农杆菌介导的水稻转化实验目的学习农杆菌介导的将目的基因导入水稻的方法。
实验原理随着分子生物学的发展,越来越多的参与植物抗病有关的基因被分离出来,如防卫反应有关的基因、参与抗病信号传导的基因,参与对病原物识别的基因等,要鉴定这些基因在植物抗病性中的作用和地位,就要构建转化植物的双元载体如超量表达、反义和RNA干涉的双元载体转化植物,来明确该基因在植物抗病中的作用。
水稻上常用的遗传转化方法分为DNA直接导入法和农杆菌介导的转化法。
DNA直接导入法主要包括PEG(polyethylene glycol)介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。
其中PEG法、电穿孔法以原生质体为受体,由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。
基因枪法优点是受体广泛,不受寄主范围的限制,转化率较高,但和其它DNA直接导入法一样存在共同的缺点:外源DNA的整合方式复杂,常常是多拷贝插入,较易出现转基因沉默现象,转化的外源基因片断不能太大(上限是16-20kb),转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。
同DNA直接导入法相比,农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养,简便易行,能有效地转入较大的外源DNA片断;转化效率高,转化的外源基因整合位点比较稳定(一般在T-DNA 25bp处与植物基因组整合),整合的外源基因基本上保持其结构的完整性;整合的外源基因多为单拷贝或低拷贝;整合的外源基因在转基因植株中的显性表达率较高,共抑制现象相对较少;转入的外源基因通常以孟德尔遗传规律遗传。
所以已成为转化单子叶植物的首选方法。
一、目标基因对农杆菌的转化1.1农杆菌感受态细胞的制备1.取-70℃保存的农杆菌EHA105于含50μg/ml利福平YM平板划线,28℃黑暗培养。
2.挑取单菌落接种于5ml YM液体培养基中,220rpm 28℃振荡培养12-16小时。
3.取2ml菌液转接于100ml YM液体培养基中,28℃,220rpm振荡培养至OD600=0.5。
农杆菌介导的假俭草遗传转化体系的建立
景观建 设 , 是世 界三大 暖季型草 坪草之一[ ] 。 。但是 , 假俭 草 的抗 寒性在 三大暖 季型草坪 草 中位 居末位 , 绿期也 较 短, 而且枯黄 的叶片不是 金黄色 , 而是黄 中带褐 , 降低 了假 俭 草 的观赏 价值 和 景 观效 应
草并未 在亚热带 北部和 暖温带地 区草坪生产 和景观绿 化 中得 到大 面积 的应用 。 随着 生物技术 的发展 , 基 因技术 日趋成 熟 , 转 可将 特定 的 目的基 因进行 遗 传转 化 , 提高 育种 效率 。在 各种植 物转基 因方法 中 , 由于农杆 菌介导法具 有易操 作 、 费用 、 低 高效 率 、 插入 片段确定 性好 和转基 因拷贝数低 等独特优
草坪 草和牧草 。其 中, D B/ B 脱水响应 元件结合 因子 ) 因E3 转 RE C F( 基 2 的报 道见 于高羊茅l 多年 生黑麦 草 o 2 、 引、 多花 黑麦草 、 缕 草 、 华结 缕 草 ( o s ii [3 匍 匐 翦 股 颖 _ 草 地 早 熟 禾 l 百喜 草 ( a p lm 结 中 Z y i snc z 、 a a) s l 、 _ 2 、 P s au n ttm)2 但 尚未见应 用于假俭 草 中。禾 本科植物 的 自身特点使得 许多草 坪草和 牧草 的组 织培 养和 再生体 系 aau [ , 不完善 , 遗传转化率 低 。因此 , 草坪 草 的转基 因研究 大多处 于遗传 转化 体 系 的建 立 和完 善 阶段 , 基 因操 作与 应 转
介 导法 , 将实 验室克 隆的源于 结缕草 的 D E 基 因导人假 俭草 的胚性愈 伤组织 , R B1 建立 了农 杆菌介 导 的假俭 草
1 4— 1 2 8 9 草来自业学报
第 z o卷
农杆菌介导的玉木耳遗传转化体系的建立
从平 板 上 挑 取 pCAMBIA1301 单 菌 落ꎬ 接 种 于
基上继代培养 4 ~ 5 次后ꎬ 选择生长良好的转化子ꎬ 接
210rmin 小摇振荡过夜培养ꎮ 第 2 天将摇好的菌液转
入适量配制好的 GUS 染色工作液ꎬ X - gluc 溶液 ( 50
5mL YEP 液体培养基中 ( 含 50mgL Kan) ꎬ 28℃ ꎬ
择广ꎬ 转化效率高ꎬ 单拷贝插入ꎬ 能够稳定复制及表
玉木耳菌株 ( 菌种编号: CCMJ2567) 由吉林农
EHA105 购于南京百斯凯科技有限公司ꎮ 植物表达载
1 1 2 培养基
1 1 2 1 MYG 固体 / 液体培养基
用于复壮玉木耳菌丝及培养玉木耳菌丝球ꎮ 称取
葡萄糖 10gꎬ 麦芽糖 5gꎬ 酵 母 浸 粉 5gꎬ 琼 脂 粉 15gꎬ
羧苄青霉素、 其他化学试剂均为国产分析纯ꎮ
1 2 方法
设置 潮 霉 素 浓 度 梯 度 为 0mg L 、 5mg L 、
-1
-1
10mg L 、 15mg L 、 20mg L 、 25mg L 、
-1
-1
1 2 7 共培养时 AS 浓度筛选
设置 AS 浓度梯度为 0μmol L 、 50μmol L 、
DOI: 10 19754 / j nyyjs 20230730004
玉木耳 ( Auricularia cornea Ehrenb ) ꎬ 隶属于木
达等特点ꎮ 目前ꎬ 利用农杆菌介导的遗传转化技术已
过对木耳属白色变异菌株进行栽培驯化而选育出的适
糙皮侧耳 [ Pleurotus ostreatus ( Jacq ) P Kumm] 、 香
水稻遗传转化实验报告
一、实验目的本实验旨在探究农杆菌介导法在水稻遗传转化中的应用效果,通过构建基因表达载体,将目的基因导入水稻细胞中,从而实现基因功能的验证和水稻性状的改良。
二、实验材料1. 实验材料:水稻品种为南桂占,农杆菌菌株为Agrobacterium tumefaciens EHA105,目的基因(GFP基因)载体为pBI121。
2. 试剂:农杆菌转化培养基、抗生素、潮霉素、DNA提取试剂盒、PCR试剂盒等。
3. 仪器:PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
三、实验方法1. 目的基因的克隆:将GFP基因从质粒载体pBI121中切出,插入到农杆菌载体pBin19中,构建重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌的活化:将农杆菌菌株EHA105接种于YEB培养基中,在28℃条件下培养过夜。
3. 农杆菌转化:将活化后的农杆菌与重组载体pBin19-GFP混合,用涂布法将混合液涂布于农杆菌转化培养基上,28℃条件下培养2-3天。
4. 水稻叶片的消毒:将水稻叶片用70%酒精浸泡30秒,再用无菌水冲洗3次,然后用无菌滤纸吸干水分。
5. 农杆菌侵染:将农杆菌转化菌液滴加到水稻叶片上,用无菌滤纸轻轻擦拭叶片,使农杆菌均匀分布在叶片表面。
6. 愈伤组织诱导:将侵染后的水稻叶片放入农杆菌转化培养基中,28℃条件下培养5-7天,诱导愈伤组织形成。
7. 抗性筛选:将愈伤组织转入含有潮霉素的筛选培养基中,28℃条件下培养3-4周,筛选出转化成功的愈伤组织。
8. 转化植株再生:将筛选出的转化愈伤组织转入再生培养基中,28℃条件下培养2-3周,诱导再生植株。
9. 抗性鉴定:将再生植株种植于田间,对植株进行潮霉素筛选,筛选出抗潮霉素植株。
10. PCR检测:对筛选出的抗潮霉素植株进行PCR检测,验证GFP基因是否成功导入水稻基因组。
四、实验结果1. 目的基因的克隆:成功构建了重组载体pBin19-GFP。
2. 农杆菌转化:农杆菌转化效率较高,大部分叶片出现愈伤组织。
转基因拟南芥实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握转基因技术的基本原理和操作流程。
2. 学习拟南芥转基因方法,包括农杆菌介导转化和基因枪法。
3. 鉴定转基因植株,并分析其遗传稳定性。
二、实验材料与试剂1. 拟南芥植株(野生型、突变型)2. 农杆菌菌株(如Agrobacterium tumefaciens C58)3. 转基因载体(含目的基因、抗生素抗性基因)4. 培养基、抗生素、除草剂等5. PCR试剂盒、DNA提取试剂盒、DNA测序仪等三、实验方法1. 目的基因克隆:根据目的基因序列设计引物,从基因库中克隆目的基因,并进行测序验证。
2. 构建转基因载体:将目的基因克隆到载体上,并插入抗生素抗性基因作为筛选标记。
3. 农杆菌转化:将转基因载体转化农杆菌,制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选:将转化介质喷洒或浸泡拟南芥植株,筛选出转基因植株。
5. PCR检测:提取转基因植株DNA,进行PCR扩增,检测目的基因是否成功插入。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析:通过自交、回交等手段,分析转基因植株的遗传稳定性。
四、实验结果与分析1. 目的基因克隆:成功克隆目的基因,并进行测序验证。
2. 构建转基因载体:成功构建转基因载体,并插入抗生素抗性基因。
3. 农杆菌转化:成功转化农杆菌,制备转化介质。
4. 转基因植株的筛选:通过喷洒或浸泡转化介质,成功筛选出转基因植株。
5. PCR检测:提取转基因植株DNA,进行PCR扩增,成功检测到目的基因。
6. 转基因植株的遗传稳定性分析:通过自交、回交等手段,分析转基因植株的遗传稳定性,结果表明转基因植株遗传稳定性良好。
五、实验讨论1. 农杆菌转化法是一种常用的植物转基因方法,具有操作简便、转化效率高等优点。
2. 在转基因过程中,抗生素抗性基因作为筛选标记,可以有效筛选出转基因植株。
3. PCR检测是鉴定转基因植株的重要手段,可以快速、准确地检测目的基因是否成功插入。
4. 遗传稳定性分析是评估转基因植株遗传特性的重要环节,有助于确保转基因植物的安全性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
13O一134 2/2008 草 业学报
ACTA PRATACULTURAE SINICA 第17卷第1期
Vo1.17,No.1
菊苣农杆菌介导转化受体系统的研究(简报)
程林梅 ,孙毅 ,王亦学 ,吴家和 (1.山西省农业生物技术研究中心,山西太原030031;2.山西省农业科学院棉花研究所,山西运城044000)
摘要:对影响菊苣转化受体系统几种重要因素进行了初步探讨。研究结果表明,采用菊苣叶片、茎段作为外植体, 在MS+6一BA 1.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L培养基上.再生频率达lOO%,农杆菌菌株LBA4404介导菊苣遗传转化体 系中,经生根后2O~25 d的叶片.遗传转化效果最佳。共培养2 d,同时附加2O~25 mg/L卡那霉素和500~600 mg/L头孢霉素,转化频率由1.5 提高到7.1 左右。 关键词:菊苣;农杆菌介导;受体系统;转化 中图分类号:¥682.1 ;Q943.1 文献标识码:A 文章编号:1004—5759(2008)01—0130—05
干旱、盐渍和土壤沙化是影响全球农业生产与生态环境的重要因素,在我国干旱、半干旱地区的盐碱地占国 土面积的1/2左右,严重的制约农业生产的发展。选育抗盐碱、耐干旱能力强的作物,提高林木、牧草耐旱耐盐性 是解决干旱和盐渍的一条经济有效的途径。近几年,由于西部大开发战略的实施以及生态建设事业的需要,培育 优质抗逆的牧草和草坪草品种Ft益成为研究的热点问题[1],并被列入国家“十五”转基因植物研究与产业化重大 专项嘲。因此,随着基因克隆和转基因技术手段的不断完善,将一些与抗性密切相关的外源目的基因导人栽培植 物中来提高其抗性,已经引起国内外科学家的广泛关注。 菊苣(Cichoriun intybus)为菊科菊苣属多年生草本植物,不仅是一种高产优质的牧草,而且还具有食用、药 用和观赏等诸多方面的开发潜力 。 。因此,大力开展菊苣的研究工作对农业产业化结构调整、退耕还林、还草 和畜牧业的发展具有重要的现实意义。本研究采用农杆菌(Agr0比c r “ tumefaciens)介导法,将抗坏血酸过 氧化物酶(ascorbate peeoxidase,APX)基因导人菊苣中,提高其体内APX水平,增强抗逆性。然而,建立良好的 基因转化受体系统是植物基因工程的基础[6]。本研究对影响菊苣遗传转化系统的几种相关因素进行了研究,建 立起良好的基因转化受体系统,为今后进一步开展菊苣的遗传转化奠定了基础。 1材料与方法 1.1材料 采用新西兰引进的菊苣品种——普那(pna)L3“ 进行实验。 1.2根癌农杆茵及质粒 农杆菌菌株为LBA4404,质粒载体为PBin438,载体上带有抗卡那霉素选择标记基因和抗坏血酸过氧化物酶
基因,由CaMV 35S启动子调控。 1.3培养基种类 再生培养基:murashige skoog(MS)+6-苄基嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)1.5 mg/L+吲哚丁酸(in— dole一3一butyric acid,IBA)0.2 mg/L ̄继代培养基:Ms+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L ̄生根培养基:1/2MS+ 1一 萘乙酸(naphcthyl acetic acid,NAA)0.1 mg/L;预培养培养基:Ms+6-BA 1.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L,共培 养培养基;Ms+6一BA 1.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L+卡那霉素(Kan)10 mg/L+头孢霉素(cef)600 mg/L,筛选生 根培养基:1/2MS+NAA 0.1 mg/L+Kan 10 mg/L+eef 500 mg/L。 以上培养基蔗糖均为3 o,4,生根培养基为2%,pH值5.8,琼脂0.6 o,4。
收稿日期:2007—04—17;改回Ft期:2007-08-14 基金项目:山西省自然科学基金项目(No.200601192)和山西省农业科学院高薪项目(No.YGX0507)资助。 作者简介:程林梅(1954-),女,山西太原人,副研究员。E—mail:chlml000@163.com
维普资讯 http://www.cqvip.com 第17卷第1期 草业学报2008年 1.4 方法 无菌苗的制备,选用籽粒饱满的菊苣种子,用纱布包好,先用洗洁剂漂洗3 rain,然后用自来水冲洗3次,用 75%酒精灭菌2 rain,0.I%HgC1 灭菌20 rain,最后用无菌水冲洗5或6次后接种到1/2Ms培养基上。待小苗 长大后,取叶片和茎段切成5~6 mm小块,接种到直径9 cm培养皿的再生培养基上,每个培养皿放2O块,待分 化成植株后接种到继代培养基上以单株方式增殖继代,小苗长到3~4 cm高时,转移到生根培养基上,大约7 d 左右开始生根,生根后小苗迅速长大,15 d左右根系较发达,25~30 d取健壮的叶片和茎段作为转化受体材料, 进行遗传转化,培养期间的温度全部控制在20 ̄28℃,培养室每天光照12 h,光照强度3 000 lx。 1.5 转化 农杆菌介导采用Horsch等 和Nehra等 。 的方法。首先挑取农杆菌菌落接种于含卡那霉素50 mg/L YEB (yeast extralt broth)液体培养基中,在28℃下振荡培养,农杆菌菌液OD6。。(optilal density,光密度)值应达到0.5 左右,浸染预培养2~3 d后的菊苣叶片,在菌液中浸泡5~8 rain,用蒸馏水洗1遍,随后用无菌滤纸吸干叶片上 多余的菌液,放在再生培养基上共培养3 d后,转到附加卡那霉素10 mg/L与头孢霉素600 mg/L的再生培养基 上培养1周,然后转到头孢霉素不变,卡那霉素增加到20 mg/L的培养基上继续培养2周,筛选出不定芽,在附 加卡那霉素30 mg/L继代培养基上继续筛选并增殖,待不定芽长大取叶片培养于附加卡那霉素20 mg/L再生培 养基上观察转化植株的再生情况,继续进行转化体的筛选培养,每4周换1次新鲜培养基,并将卡那霉素降低到 10 mg/L。用这种方法可作为转化芽的早期鉴定。 2结果与分析 2.1 外植体类型和生理状态对转化的影响 表1不同外植体对转化芽诱导的影响 2.1.1不同外植体对转化芽诱导的影响 正确的选 择外植体是植物转基因操作成功的重要条件,作为转 基因外植体材料及植物的各个组织器官使转化率有明 显的不同,选用再生频率高达100 的叶片和茎段进 行转化,结果表明,茎段的转化芽诱导频率明显低于叶 片,虽然茎段转化芽出现的时间较叶片转化芽早4~5 d,但转化芽没有叶片健壮(表I)。
Table 1 Effects of different explants on induction ratio of regenerated buds
2.1.2外植体生理状态对转化芽诱导的影响植物体任何器官都可以作为建立再生系统的外植体,甚至作为植 物基因转化的外植体,并能接受外植体基因的整合,但不同部位组织细胞发育年龄和生理状态不同,会导致农杆 菌感染存在差异。采用再生频率为100 的叶片和茎段进行转化,未经生根的叶片和茎段转化芽为0,生根5 d 后转化芽诱导率开始呈明显上升趋势,并且叶片较茎段的转化频率高,20 d达到最高,为5.8%,25 d后开始呈下 降趋势。所以选用生根后20 ̄25 d叶片作为转化的外植体具有较高的转化频率(图I)。 2.2培养方法对转化的影响 2.2.1外植体预培养、浸泡和共培养时间对转化频率的影响农杆菌与外植体共培养在整个转化过程中是非常 重要的环节,通过农杆菌附着T-DNA(transferred DNA)的转移和整合都在这个时期完成。因此,掌握共培养技 术是转化成功的关键[g]。不进行预培养,直接用农杆菌感染叶片,转化诱导频率为0c ],所以,选用经过预培养2 d的外植体,菌液OD。。。为0.5时,设计共培养时间为1,2,3,4和5 d,浸染外植体叶片时间为2,4,6,8和10 rain, 进行了转化实验。结果表明,农杆菌浸泡时间和共培养时间均对菊苣的转化有较大影响,浸泡6 rain及共培养2 d效果最佳(图2)。 2.2.2转化细胞的选择选择转化细胞是植物基因转化的重要步骤,植物转基因中通常有2种目的需要抗生 素:一是抑制农杆菌的生长;二是筛选转化细胞。只有转化获得了抗生素基因的细胞才能在抗生素的选择培养基 上生长,当选择的抗生素浓度过低时,会获得许多假阳性植株,造成后期选择困难,当抗生素浓度过高时,又会抑 制一些真正的转化细胞生长,降低培养效率。所以,确定和选择适宜的抗生素浓度是转化系统必不可少的步骤。
维普资讯 http://www.cqvip.com 132 ACTA PRATACULTURAE SINICA(V0l_17,No.1) 2/2008 卡那霉素和头孢霉素对叶片的再生能力有很大的抑制作用 ]。为了筛选较合适的卡那霉素浓度,设计了 5个卡那霉素浓度,分别为0,10,20,30和40 mg/L,结果显示,20 mg/L的卡那霉素较为适宜,分化频率达70 。 卡那霉素40 mg/L条件下,分化频率显著降低,并且在较短的时间内外植体很快褐化、坏死。本实验结果与豆科 牧草百脉根(Lotus comiculatus)相似 ]。附加20 mg/L卡那霉素和500~600 mg/L头孢霉素是菊苣转化筛选 的最佳条件(表2)。同时,还进行了卡那霉素选择压的实验。首先选择压力为10 mg/L卡那霉素,经过10 d后增 加到20 mg/L,这样就最大限度地保留了可能获得的转化芽,随后移栽到卡那霉素为20 mg/L生根培养基上,延 长选择压力,降低非转化芽的比例。筛选20 d后,将生长良好的芽转到无卡那霉素生根培养基上并能正常生根, 30 d后移栽成活(图3和4)。 3讨论 菊苣不同外植体影响诱导芽的再生能力和农杆菌的感受能力。本实验中发现,菊苣叶片、茎段、花蕾和花瓣 4种外植体诱导再生频率有较大差异,叶片和茎段诱导再生频率为100 ,而花蕾次之,只有20 ,花瓣几乎为 0E ]。用再生频率为100 的叶片和茎段进行转化,叶片转化率明显高于茎段,虽然茎段转化芽出现的时间比叶
片早4~5 d,但芽没有叶片健壮。MeyersE¨ 研究农杆菌转化机理指出,转化细胞只发生在细胞分裂的一个较短 时间内,因为核基因组DNA只有在复制时才能使外源DNA整合,所以可能只处于细胞分裂周期的S期(DNA 合成期)才具有外源基因转化能力。发育早期的组织,如分生组织、维管束形成层组织、薄壁组织及胚、雄配子体 和雌配子体等,这些组织的细胞具有很强的分裂能力。