木瓜蛋白酶交联琼脂糖N-羟基琥珀酰亚胺酯共价偶联
《生物化学》课后习题答案
生物化学（第三版）课后习题详细解答第三章氨基酸提要α-氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。
蛋白质中的氨基酸都是L型的。
但碱水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。
参与蛋白质组成的基本氨基酸只有20种。
此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。
除参与蛋白质组成的氨基酸外，还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。
氨基酸是两性电解质。
当pH接近1时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当pH在13左右时，则全部去质子化。
在这中间的某一pH（因不同氨基酸而异），氨基酸以等电的兼性离子（H3N+CHRCOO-）状态存在。
某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质pH称为该氨基酸的等电点，用pI 表示。
所有的α-氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。
α-NH2与2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的DNP-氨基酸（Sanger反应）；α-NH2与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（ Edman反应）。
胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。
半胱氨酸的SH基在空气中氧化则成二硫键。
这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。
除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一个手性碳原子，因此α-氨基酸具有光学活性。
比旋是α-氨基酸的物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。
参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。
核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。
氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。
常用方法有离子交换柱层析、高效液相层析（HPLC）等。
习题1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
生物化学王镜岩(第三版)课后习题解答
第三章氨基酸提要α-氨基酸是蛋白质的构件分子，当用酸、碱或蛋白酶水解蛋白质时可获得它们。
蛋白质中的氨基酸都是L型的。
但碱水解得到的氨基酸是D型和L型的消旋混合物。
参与蛋白质组成的基本氨基酸只有20种。
此外还有若干种氨基酸在某些蛋白质中存在，但它们都是在蛋白质生物合成后由相应是基本氨基酸（残基）经化学修饰而成。
除参与蛋白质组成的氨基酸外，还有很多种其他氨基酸存在与各种组织和细胞中，有的是β-、γ-或δ-氨基酸，有些是D型氨基酸。
氨基酸是两性电解质。
当pH接近1时，氨基酸的可解离基团全部质子化，当pH在13左右时，则全部去质子化。
在这中间的某一pH（因不同氨基酸而异），氨基酸以等电的兼性离子（H3N+CHRCOO-）状态存在。
某一氨基酸处于净电荷为零的兼性离子状态时的介质pH称为该氨基酸的等电点，用pI表示。
所有的α-氨基酸都能与茚三酮发生颜色反应。
α-NH2与2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用产生相应的DNP-氨基酸（Sanger反应）；α-NH2与苯乙硫氰酸酯（PITC）作用形成相应氨基酸的苯胺基硫甲酰衍生物（ Edman反应）。
胱氨酸中的二硫键可用氧化剂（如过甲酸）或还原剂（如巯基乙醇）断裂。
半胱氨酸的SH基在空气中氧化则成二硫键。
这几个反应在氨基酸荷蛋白质化学中占有重要地位。
除甘氨酸外α-氨基酸的α-碳是一个手性碳原子，因此α-氨基酸具有光学活性。
比旋是α-氨基酸的物理常数之一，它是鉴别各种氨基酸的一种根据。
参与蛋白质组成的氨基酸中色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸在紫外区有光吸收，这是紫外吸收法定量蛋白质的依据。
核磁共振（NMR）波谱技术在氨基酸和蛋白质的化学表征方面起重要作用。
氨基酸分析分离方法主要是基于氨基酸的酸碱性质和极性大小。
常用方法有离子交换柱层析、高效液相层析（HPLC）等。
习题1.写出下列氨基酸的单字母和三字母的缩写符号：精氨酸、天冬氨酸、谷氨酰氨、谷氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。
[见表3-1]表3-1 氨基酸的简写符号名称三字母符单字名称三字单字号母符号母符号母符号丙氨酸(alanine) Ala A亮氨酸(leucine)LeuL精氨酸(arginine) Arg R赖氨酸(lysine)LysK天冬酰氨(asparagine s) Asn N甲硫氨酸(蛋氨酸)(methionine)MetM天冬氨酸(aspartic acid) Asp D苯丙氨酸(phenylalanine)PheF半胱氨酸(cysteine) Cys C脯氨酸(praline)ProP谷氨酰氨(glutamine) Gln Q丝氨酸(serine)SerS谷氨酸(glutamic acid) Glu E苏氨酸(threonine)ThrT甘氨酸(glycine) Gly G色氨酸(tryptophan)TrpW组氨酸His H 酪氨酸Ty Y(histidine) (tyrosine) r 异亮氨酸(isoleucine ) Ile I缬氨酸(valine)ValVAsn和/或Asp Asx B Gln和/或GluGlsZ2、计算赖氨酸的εα-NH3+20%被解离时的溶液PH。
第九章固定化酶
（游离α--氨基，lys—ζ—NH2, Arg胍基，-COOH, Asp—γ--羧基Glu--羧基， 酚羧基，巯基，咪唑基) 但是，载体、酶分子上的基团是不能直
接反应，功能基团要活化，
第九章 固定化酶
1)重氮化
芳香氨基载体
方法特点：
载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物， 在温和条件和酶分子上相应基团直接偶联。
现有多孔物质包络法，超过滤法 等。实际上用包埋法最多
第九章 固定化酶
各种固定化方法的优、缺点比较
吸附法
固定化方法 物理吸附法 离子吸附法 包埋法 共价键结合法 交联法
制备难易
易
易
较难
难
较难
结合程度
弱
中等
强
强
强
活力回收 高,酶易流失 高
高
低
中等
再生
可能
可能 不能 不能
不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
第九章 固定化酶
2)微囊型包埋 常用微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、
醋酸纤维素等。
用半透膜将酶包埋在里面， 半透膜容许底物和产物自由出入膜囊，
囊的表面积相对体积的比值大， 底物和产物的交换进行迅速。
第九章 固定化酶
例子：尼龙膜界面聚合包埋
(酶+己二胺水溶液)+庚二酰氯有机溶剂(氯仿)
混合
乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有机相交界处聚合
芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入分子 中Tyr等集中的疏水区偶联而导致失效。
a.当载体为电中性或疏水性时，这种倾向 性越大。
b.当载体用亲水极性物质时，这种疏水区 的特性就大大减小了。
木瓜蛋白酶提取实验方案
实验设计题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究一、实验原理：木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。
是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。
工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。
现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。
木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。
它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。
本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。
有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。
有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。
使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。
高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。
硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。
高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。
各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。
胶乳微球与抗体蛋白相互作用机理的荧光光谱法分析
光谱法 （ ＿ ｓ 、圆二 色谱法 （ Ｄ） ｕｖ ） Ｃ 、傅里 叶变换 红外 光谱
法 （ Ｉ Ｒ 及核磁共振法 （ Ｋ＇ ） Ｉ ＮＭＲ）７ 。 而 ，在这 些方 法 中， Ⅲ。 然 。
乳 的凝 聚作用 ， 免疫反应从宏观上被放 大 了。所以将不 同的 抗原 ／ 抗体连接在胶乳 微球 表 面，通 过免 疫检 测 ，可将 一些 常见 疾病 ， 如肝炎 、流感等快速检测 出来 。 常用 的制备胶乳一 体蛋 白复合 物 的方法 有两 种 ：物理 抗 吸附法和共价偶联法。由于吸附会引起固定于胶乳 微球表 面 蛋 白的部分解 吸及结构的变化 ， 以用物理吸 附法制备 的胶 所 乳一 抗体蛋 白复合物特 异性低 ，在生物 诊 断 中的应用 受到 限 制Ⅲ ］ ４ 。共价偶联法能在最 大 限度 上控 制吸 附法 中出现 的问 题 ， 为 目前制备胶乳一 成 抗体蛋 白复合物 的主要方法 。 在胶乳一 抗体蛋 白复合 物 的制备 过程 中 ， 白 与胶乳 微 蛋
公司 ；１苯 胺基 萘一一 － ８硝基 苯 甲酸 盐 （ ＡＮＳ ，美 国 Ｓｇ ） ｉｍａ公
球的相互作用总会存在 ， 而这些相互作用会 对 固定 于胶 乳微
球表面抗体蛋 白的功能特性 、空间结构 、生物 活性及其 在生 物诊断 中的应用产 生一定 的影 响，所以研 究它们之 问相互作 用 的机理 以及这些 相互作 用对胶 乳一 抗体蛋 白复合 物 中抗体
司； 其余化学试剂均为分析纯 ；实验用水为去离子水 。
１ ２ 主要 仪 器 ．
超 声 波 细 胞 粉 碎 机 （Ｙ ９ Ｉ 型 ） Ｊ －２Ｉ ，宁 波 新 芝 生 物 科 技 股
酵母蔗糖酶的固定化
酵母蔗糖酶的固定化实验三酵母蔗糖酶的固定化一、实验原理1.固定化酶通过物理或化学的方法，将水溶性的酶与水不溶性载体结合，使酶固定在载体上，并在一定的空间范围内进行催化反应的酶称为固定化酶。
与游离酶相比，固定化酶有以下优点:?提高酶的稳定性;?易与产物分离;?可反复利用。
酶的固定化方法有:吸附法、共价偶联法、交联法、包埋法。
本实验用壳聚糖固定化酵母蔗糖酶属共价偶联法。
由于载体带电性质的不同，会引起酶与底物亲和力的变化，从而引起米氏常数Km值的改变。
酶固定化后，对变性剂、抑制剂的抵抗能力增强，贮存稳定性和操作稳定性也得以提高。
2.酶活测定蔗糖酶催化非还原糖中的α-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性，能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖。
本实验用测定生成还原糖(葡萄糖和果糖)的量来测定蔗糖水解的速度，在碱性条件下，还原糖与3,5-二硝基水杨酸(DNS)共热，DNS被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质)，还原糖则被氧化成糖醛酸及其它产物。
在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质深浅成比例关系。
酶活定义: 在540 nm 光吸收处，光密度每增加0.001个光吸收值定义为1个酶活力单位。
二、实验材料、仪器和试剂1.材料壳聚糖、实验一纯化得到的酵母蔗糖酶酶液2.仪器移液管、注射器、分光光度计、水浴锅、铁架台等3.试剂(1)1% 3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂:酒石酸钾钠100 g溶于400 mL蒸馏水，加热中依次加入NaOH 5 g，3，5-二硝基水杨酸5 g，苯酚1 g，亚硫酸钠0.25 g，搅拌至溶。
冷却后定容至500 mL，储于棕色瓶室温保存。
(2)10%蔗糖溶液(3)0.1 mol/L pH 7.8 Tris-HCl缓冲液(4) 1%戊二醛溶液:将4 mL 25%戊二醛溶液用上述Tris-HCl缓冲液稀释至100mL (5)0.2 mol/L pH 4.5醋酸缓冲液三、实验步骤1.壳聚糖载体的制备及戊二醛的偶联(1)称取3 g壳聚糖溶于98 mL蒸馏水中，搅拌均匀，再滴加2 mL冰醋酸，搅拌至均匀的粘稠状。
量子点在生物标记中的应用【完整版】
量子点在生物标记中的应用【完整版】(文档可以直接使用，也可根据实际需要修订后使用,可编辑放心下载）量子点在生物标记中的应用【摘要】：生物医学检测领域，荧光标记分子是研究抗原-抗体，DNA链段、酶与底物等分子间相互作用的重要研究工具。
荧光量子点作为一种新型荧光纳米材料，具有量子效率高，摩尔消光系数大，光稳定性好，可控的荧光发射波长和宽的荧光激发波长范围等优异的光学性能，因而在生物分析，检测等领域得到广泛应用。
前言纳米量子点是准零维材料。
当颗粒尺寸和电子的德布罗意波长相比较的时候，尺寸限域将引起尺寸效应，小尺寸效应和宏观量子隧道效应，从而展现出不同于宏观材料的光学性质。
[1]由于其独特的发光性质，量子点在医学生物芯片，药物和基因载体、以及生物化学分析、疾病的诊断与治疗等方面的应用得到的广泛的关注。
与传统荧光染料相比，量子点存在以下优点：[2]（1）量子点的发射光谱可以通过改变量子点的尺寸大小来控制。
通过改变量子点的尺寸和它的化学组成可以使其发射光谱覆盖整个可见光区。
而传统的邮寄荧光染料激发光谱窄，发射光谱很宽。
激发光谱窄导致每一个不同的荧光染料必须使用一种特定的激发波长来激发，限制了使用有机荧光染料作为荧光探针进行多色标记。
而且其荧光发射峰的半峰宽很宽，导致不同波长的有机荧光染料的发射峰彼此重叠，大大限制了可以同时使用的荧光探针的数量。
（2）量子点具有良好的光稳定性，量子点的荧光强度比最常用的邮寄荧光材料“罗丹明6G〞高20倍，稳定性是100倍以上，因此，量子点可以对标记的物体进行长时间的观察。
有机荧光染料的荧光稳定性不好，见光极易分解，产生光漂白现象，导致量子产率下降，对检测过程造成影响。
（3）量子点具有宽的激发谱和窄的发射谱。
使用同一激发光源就可实现对不同粒径的量子点进行同步检测，因而可用于多色标记，极大地促进了荧光标记在生物钟的应用。
（4）量子点具有较大的斯托克斯位移。
可以防止发射光谱和激发光谱的重叠，有利于荧光光谱信号的检测。
固定化酶ppt课件
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酶固定化方法选择依据：
（1） 酶的性质 （2） 载体的性质 （3） 制备方法的选择
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四、辅酶固定化
原因
有机辅因子中具有某些特殊的化学基团，参与酶的催化 反应
有机辅因子在使用过程中要流失，并且不能自行再生 有机辅因子价格昂贵
——工业上应用全酶的关键是有机辅因子的保留和再生
•可以形成共价键的基团： 游离氨基， 游 离羧基， 巯基， 咪唑基， 酚基， 羟基， 甲硫基， 吲哚基，二硫键
•常用载体：天然高分子、人工合成的高聚 物、无机载体
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共价键结合法制备固定化酶的“通式”
1. 载体上引进活泼基团 2. 活化该活泼基团 3. 此活泼基团再与酶分子上某一基团形
成共价键
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优点： 固定化时酶分子的构象很少
或基本不发生变化。
缺点： 结合力弱，易解吸附。
载体： 纤维素、琼脂糖、活性炭、
沸石及硅胶等。
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II 离子结合法
酶分子与含有离子交换基团的固相载 体相结合
第一个离子结合法固定化酶： DEAE — Cellulose 固定化过氧化氢酶
第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
=6*106IU
2.酶比活定义（游离）：每毫克酶蛋白或酶RNA（DNA)所具有的 酶活力单位
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固定化酶的指标：
1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的
酶活力单位。 或：单位面积（cm2）的酶活力单位表示（酶膜、酶管、
酶板）。
2. 操作半衰期：衡量稳定性的指标。
连续测活条件下固定化酶活力下降为最初活力一半所需 要的时间（t1/2）
壳聚糖-海藻酸钠微球固定化木瓜蛋白酶的工艺研究
摘摇 要: 以壳聚糖和海藻酸钠为原材料, 采用乳化交联法制备空白微球, 通过戊二醛固定木瓜蛋白酶, 以固定化木瓜蛋白
酶的活性回收率作为最终测定指标, 并以星点设计-效应面法优化实验条件。 通过一系列的实验, 结果表明最优条件为: 固定化时 间是 4 h, 壳聚糖与海藻酸钠的质量配比( m / m) 为 55、 加酶量为 700 U / mL、 戊二醛浓度为 1郾 0% 、 固定化温度为 40 益 。 木瓜蛋 白酶的固定化效果良好, 木瓜蛋白酶活性回收率为 68郾 9% 。
个羧基的氨基酸或芳香 L-氨基酸。 具有酶活高、 适用 pH 范围 广、 热稳定性好、 天然卫生安全等特点, 因此在食品、 医药、 饲料、 日化等行业得到广泛应用。 但其稳定性差, 在温度、 pH 和无机离子等外界因素影响下, 容易变性失活。 酶的固定化通 常是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内, 但是仍能进行 其特有的催化反应, 并且可以回收及重复利用的一类技术。 为 了提高木瓜蛋白酶的稳定性, 研究者们正努力探索酶类药物的 固定化载体和固定化方法。 杨頔[1] 、 李红[2] 、 袁春桃等[3] 采用 了固定化酶的方法, 将其固定在合适的载体上, 较多报道的固 定化载体为壳聚糖[4] 。 其他, 有李琳、 丁利君和刘佳炜等[5-7] 分别以竹纤维素、 壳聚糖-埃洛石纳米管微球和明胶-壳聚糖海藻酸钠凝胶为载体研究了其对木瓜蛋白酶的固定化作用。
Abstract: Chitosan and sodium alginate were used as raw materials to prepare blank microspheres by emulsifying crosslinking method郾 Papain was immobilized with glutaraldehyde郾 The activity recovery rate of papain was determined as the final index, and the experimental conditions were optimized by the star point design effect surface method郾 Through a series of experiments, the results showed that the optimum conditions were as follows: the immobilization time was 4 h, the mass ratio of chitosan and sodium alginate was 5 5, the enzyme dosage was 700 U / mL, the concentration of glutaraldehyde was 1% , the temperature was 40 益 郾 The recovery rate of enzyme activity was 68郾 9% 郾 The chitosan sodium alginate microspheres had the positive immobilization effect on Papain郾