细胞冻存与复苏技术
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编
细胞培养传代冻存复苏操作规程自编.doc细胞培养传代、冻存、复苏操作规程第一章总则第一条目的为规范细胞培养实验室的操作流程，确保细胞培养的质量和安全，特制定本操作规程。
第二条适用范围本规程适用于所有进行细胞培养、传代、冻存和复苏的实验室人员。
第三条安全与健康实验室人员在操作过程中必须遵守生物安全和个人防护的相关规范。
第二章细胞培养传代第四条传代前的准备检查细胞培养基、血清、胰蛋白酶等消耗品的质量和数量。
确保无菌操作台、培养箱、显微镜等设备正常运行。
第五条传代操作步骤细胞观察：在显微镜下观察细胞形态，确认细胞健康状况。
培养基更换：使用无菌操作吸去旧培养基，加入适量的胰蛋白酶。
细胞分离：待细胞变圆后，轻敲培养瓶，使细胞脱落。
细胞计数：使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
细胞传代：根据细胞密度和传代比例，将细胞加入新的培养基中。
第六条传代后的观察观察细胞在新培养基中的附着情况。
定期检查细胞的形态和生长状态。
第三章细胞冻存第七条冻存前的准备准备冻存管、冻存液（含DMSO）、标签等。
确保液氮罐或程序降温仪处于良好状态。
第八条冻存操作步骤细胞计数：确保细胞密度和活力符合冻存要求。
冻存液配制：按照比例加入DMSO至冻存液中。
细胞悬液制备：将细胞与冻存液混合均匀。
细胞冻存：将细胞悬液分装至冻存管中，标记信息。
降温过程：将冻存管放入程序降温仪或直接浸入液氮中。
第九条冻存后的管理将冻存管放入液氮罐中，记录存放位置。
定期检查液氮罐的液位和温度。
第四章细胞复苏第十条复苏前的准备准备培养基、胰蛋白酶、无菌操作台等。
检查培养箱、显微镜等设备是否正常。
第十一条复苏操作步骤取出冻存管：从液氮罐中取出所需冻存管。
快速解冻：将冻存管置于37°C水浴中快速解冻。
细胞悬液制备：将解冻后的细胞迅速转移到含有培养基的离心管中。
离心去除DMSO：低速离心以去除DMSO。
细胞培养：将细胞重悬于新鲜培养基中，转入培养瓶中培养。
细胞的冻存及复苏PPT课件
冷冻保存方法
1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降
温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保 存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
8
细胞冻存与复苏的关键因素
复苏速率
复苏速率：在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说， 复温速度越快越好，速度过慢，细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
9
细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻保护剂
冷冻保护剂：可以保护细胞免受冷冻损伤的物质 分为渗透性和非渗透性两类。 不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般 多联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。
10
细胞冻存与复苏的关键因素
保存温度
冷冻保存温度：能长期保存细胞的超低温度，在 此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但 经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和 功能。 液氮温度（-196℃）是 目前最佳的冷冻保存温度。
11
冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
细胞冻存与复苏
1
细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
2
细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。
3
冻存细胞复苏步骤
冻存细胞复苏步骤冻存细胞复苏是一种常用的细胞保存方法，它可以将细胞冷冻保存在极低温度下，以防止其失活或死亡。
当需要使用这些冻存细胞时，我们需要进行复苏步骤，使其恢复到正常的生活状态。
下面将介绍冻存细胞复苏的步骤。
第一步：预备工作在进行细胞复苏之前，我们需要做一些预备工作。
首先，准备好培养皿和培养基。
培养皿应该是无菌的，以确保细胞复苏的成功。
培养基应该是适合细胞生长的，可以提供必需的营养物质和生长因子。
其次，准备好所需的实验器材和试剂。
第二步：取出冻存细胞将冻存细胞保存管从液氮罐中取出，迅速将其放入37摄氏度的水浴中。
在水浴中加热的过程中，可以轻轻摇晃管子，以加快冻存细胞的解冻速度。
当冻存细胞完全解冻后，将其转移到无菌的培养皿中。
第三步：培养细胞将解冻后的细胞转移到培养皿中后，加入预先准备好的培养基。
培养基应该是预热的，温度应与细胞生长温度相适应。
将培养皿放入恒温培养箱中，保持适宜的温度和湿度。
同时，确保培养基中的氧气和二氧化碳浓度适当。
第四步：观察细胞生长在细胞复苏的过程中，我们需要定期观察细胞的生长情况。
通过显微镜观察细胞的形态和数量变化，判断细胞是否成功复苏。
如果细胞开始生长并形成典型的细胞群落，说明细胞复苏成功。
第五步：细胞传代当细胞生长到一定程度时，需要进行细胞传代，以维持细胞的正常生长和功能。
细胞传代是将细胞从原来的培养皿中移至新的培养皿中，以减少细胞密度，防止细胞过度生长。
传代的时机应该根据细胞的生长速度和培养皿的容量来确定。
细胞复苏是一项关键的实验操作，它可以使冻存的细胞重新恢复到正常的生长状态。
通过合理的操作步骤和严格的操作要求，可以提高细胞复苏的成功率。
在进行细胞复苏时，我们需要注意操作的无菌性、培养基的配制和温度的控制等因素，以确保细胞复苏的顺利进行。
同时，及时观察细胞的生长情况，并进行适当的细胞传代，可以保持细胞的正常生长和功能。
冻存细胞复苏是一个复杂而重要的过程。
只有严格按照操作步骤进行，并注意细节和细胞的特性，才能够成功复苏冻存的细胞。
细胞冻存后复苏死细胞多并且状态不好的原因
细胞冻存后复苏死细胞多并且状态不好的原因细胞冻存是一种常见的细胞保存方法，它可以将活体细胞在极低温度下保存，以便在需要时进行复苏。
然而，有时在细胞冻存后复苏的过程中，我们可能会遇到一些问题，其中之一就是死细胞的增多以及其状态不佳。
本文将探讨这些问题的原因。
细胞冻存过程中的冷冻损伤可能是导致死细胞增多的主要原因之一。
当细胞暴露在极低温度下时，细胞内的水分会结晶形成冰晶，这可能会导致细胞膜的破裂和细胞器的损伤。
这些冷冻损伤会导致细胞死亡，从而在复苏后出现死细胞的增多现象。
细胞在冻存过程中可能会遭受到化学物质的伤害，这也可能导致细胞复苏后状态不佳。
在冻存过程中使用的保护剂和冷冻介质可能对细胞产生毒性作用，从而导致细胞损伤。
此外，冻存过程中的冷冻和解冻过程可能会引起细胞内部的化学反应，进一步损伤细胞结构和功能。
细胞冻存后复苏死细胞多并且状态不好的原因还可能与细胞的质量有关。
在进行细胞冻存前，细胞的质量和健康状况是非常重要的。
如果细胞在冻存前已经处于亚健康状态或受到其他因素的影响，那么在复苏后，这些细胞可能无法恢复到正常状态，甚至可能无法存活。
冻存和复苏过程中的操作技术也可能对细胞的状态产生影响。
不正确的冻存和解冻过程可能导致细胞受到机械性损伤或温度变化过快，从而影响细胞的复苏能力和状态。
因此，在进行细胞冻存和复苏操作时，需要严格控制操作条件，确保细胞受到最小的损伤。
细胞冻存后复苏死细胞多并且状态不好的原因可能包括冷冻损伤、化学物质伤害、细胞质量问题以及操作技术不当等。
为了解决这些问题，我们可以采取一些措施，如优化冻存和解冻过程、选择合适的保护剂和冷冻介质、提高细胞质量等。
通过不断改进和优化细胞冻存技术，我们可以提高细胞冻存后复苏的成功率，减少死细胞的产生，并保证复苏后细胞的状态良好。
肿瘤细胞的冻存与复苏
肿瘤细胞的冻存与复苏体外培养的肿瘤细胞系的传代及日常维持过程中，在培养容器、培养液及各种预备工作方面都需大量的耗费；而且肿瘤细胞一旦离开活体开头体外培养，它的各种生物学特性都将逐渐发生变幻，并随着传代次数的增强和体外环境条件的转变而不断有新的变幻。
因此准时举行肿瘤细胞冻存非常须要。
现在，肿瘤细胞低温冷冻储存已成为细胞培养室的常规工作和通用技术。
细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时光是无限的。
肿瘤细胞冻存及复苏的基本原则与常规细胞一样，是慢冻快融，试验证实这样可以最大限度地保存细胞活力。
（一）肿瘤细胞的冻存冻存肿瘤细胞时要缓慢冷冻。
由于细胞在不加任何庇护剂的状况下挺直冷冻时，细胞内外的水分都会很快形成冰晶，冰晶的形成将引起一系列的不良反应。
首先细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH转变，部分蛋白质因为上述因素而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质、酶的变性，引起溶酶体膜的损伤使溶解酶释放造成细胞内结构成分的破坏，线粒体肿胀、功能丧失并造成细胞能量代谢的障碍。
胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的转变、使细胞内容物丧失。
细胞核内DNA也是冷冻时细胞易受损伤部分。
如细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间构型发生不行逆的损伤性变幻而引起细胞的死亡。
在细胞冻存时要尽可能的匀称地削减细胞内水分，削减细胞内冰晶的形成是削减细胞损伤的关键。
目前多采纳甘油或(DMSO）作庇护剂。
这两种物质在深低温冷冻后对细胞无显然毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高胞膜对水的通透性；加上缓慢冷冻办法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞形状成冰晶，削减细胞内冰晶的形成，从而削减因为冰晶形成所造成的细胞损伤。
【材料】 (1)待冻存的肿瘤细胞。
(2）含10％～20％血清培养液、0.25％。
(3) DMSO（分析纯）或无色新奇甘油（高压蒸气消毒后用法）。
动物细胞的冻存和复苏
细胞冻存及复苏一、【实验目的】1、掌握低温液氮冻存的原理，学习细胞缓慢冻存实验方法2、掌握细胞快速复苏的原理，学习冻存细胞快速复苏的实验方法。
二、【实验原理】低温液氮冻存贮存细胞是细胞培养室常规通用技术。
这不仅避免了在培养器具、培养液及各种准备工作方面人力物力时间的大量耗费，也避免增加污染的机会；并防止了在多次传代和体外环境变化时细胞发生遗传性状的不稳定。
液氮中温度可达-196℃，细胞贮存的时间理论上是无限的，解冻后细胞仍能生长繁殖。
为培养工作提供了极大的方便。
在不加任何保护剂的情况下直接冻存细胞时，细胞内外环境中的水分会很快结成冰晶，能导致细胞发生一系列不良反应如脱水、电解质浓度增高、渗透压改变pH改变、蛋白质变性、机械损伤等，最终导致细胞死亡。
如向细胞培养液中加入一些保护剂，可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，避免上述现象的发生甘油和二甲亚砜是目前最常使用的保护剂，它们对细胞无明显毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞，提高细胞膜对水的通透性，而对细胞内酶和蛋白质等则具有一定的保护作用。
保护剂的使用浓度一般在5%～15%。
降温方法：使用降温仪：以-1～-2℃/min的降温速率→ -25 ℃以下→以-5～-10℃/min的降温速率→-100 ℃→迅速浸入液氮中。
分步降温：4 ℃放置30～60 min →-70～-80 ℃放置1～2天→迅速浸入液氮中。
三、【实验仪器与试剂】1、仪器：4℃冰箱，-70℃冰箱，液氮容器，微量加样器，水浴锅，离心机。
2、材料：冻存管，离心管，细胞培养用材料，500 mL烧杯，胶布，搪瓷杯，75％酒精棉球。
3、药品：培养基(RPMI1640或DMEM)，小牛血清，0．25％胰蛋白酶溶液，二甲基亚砜(DMSO)或甘油，0．5％台盼蓝染液，液氮。
四、【实验步骤与内容】1、细胞悬液的准备1）75%酒精棉球消毒双手、工作台面、培养瓶和试管等。
动物细胞冻存和复苏的原则
动物细胞冻存和复苏的原则动物细胞的冻存和复苏是细胞生物学研究中的重要技术之一。
下面将详细介绍动物细胞冻存和复苏的原则，主要包括以下几个方面：1.冻存前细胞状态在进行细胞冻存之前，首先要确保细胞处于最佳的生长状态。
一般来说，应该选择生长旺盛、形态正常的细胞进行冻存。
此外，为了获得更好的冻存效果，应该尽可能减少细胞的数量，避免细胞之间的相互影响。
2.冻存方法常用的动物细胞冻存方法有慢速冷冻和快速冷冻两种。
其中，慢速冷冻指的是将细胞悬液以较低的降温速率（约1℃/min）缓慢降温至-10℃左右，然后再快速降温至-196℃。
而快速冷冻则是将细胞悬液直接放入-196℃的液氮中。
两种方法均可有效地保存细胞，具体选择应根据实际情况和需要而定。
3.冻存温度动物细胞的冻存温度范围一般在-80℃至-196℃之间。
在这个温度范围内，细胞内的水分和酶活性被有效地抑制，从而避免了细胞的过度代谢和损伤。
常用的冻存容器有液氮罐、杜瓦瓶、干冰等。
4.复苏步骤细胞复苏是冻存细胞的逆过程，主要包括以下步骤：将冻存管从冻存设备中取出，迅速放入37℃水浴中融解；轻轻摇动冻存管，确保细胞完全融解；将融解的细胞悬液洗涤1-2次，以去除其中的DMSO等保护剂；加入新鲜的培养基，将细胞悬液转移至培养瓶中培养基加入；将培养瓶置于培养箱中进行培养，观察细胞生长状态。
5.细胞状态监测在细胞复苏后，应该及时对细胞的生长状态进行监测。
一般来说，可以通过观察细胞的形态、生长速率、细胞活性等方面来评估细胞的状态。
此外，还可以采用流式细胞术、免疫荧光等技术对细胞的特性进行检测和分析。
6.及时传代为了保持细胞的生长状态和稳定性，应该及时对复苏后的细胞进行传代。
传代过程中，应该选择适当的胰酶或EDTA等消化剂对细胞进行消化，控制消化时间，避免对细胞造成过度的损伤。
此外，传代过程中还应注意无菌操作，避免污染。
7.记录管理在进行细胞冻存和复苏过程中，应该建立完整的记录管理体系。
细胞传代冻存复苏步骤
细胞传代冻存复苏步骤细胞的传代冻存技术是生物医学研究中的一个重要方式。
该技术可以将细胞批量保存并长期维持其活性，以便进行进一步的研究。
细胞传代冻存的过程可以简单地概括为以下几个步骤：从培养皿中收集细胞，处理和停滞细胞增殖，添加冻存保护剂，将细胞悬液冷冻存储，最后进行复苏。
下面我们就详细描述一下这个具体步骤：1. 收集细胞收集细胞需要注意细胞的龄期，通常在细胞的对数生长期收集更好。
另外要注意细胞的数量不能过少或过多。
2. 停滞细胞增殖为了将细胞传代，减少增值周期并停滞细胞增殖是必要的。
对于一些高度增殖性的细胞，可以通过干预细胞内基因表达、添加生长因子等方式来实现。
一般可以使用过量的培养基，并将细胞保存在低吸附的容器中来停滞细胞增殖。
这样可以防止细胞形成多层，而保证单层生长。
3. 添加冻存保护剂添加冻存保护剂是细胞传代冻存的关键步骤之一。
冻存保护剂可以有效地保护细胞免受冻结脱水、冰晶形成和低温应力等因素的损害。
最常用的冻存保护剂是一些有机溶剂，例如DMSO（二甲基亚砜）、甘油等。
这些保护剂可以在细胞冷冻存储的过程中降低溶液的结冰点，防止冰晶的形成。
4. 冷冻存储在添加了冻存保护剂后，可以将细胞悬液装入冷冻管中，使用缓慢冷冻和液氮快速冷冻两种方法将细胞冷冻存储；液氮快速冷冻的方式冷冻效率高，但是会对细胞产生更大的应激，可能会降低细胞的复苏率。
缓慢冷冻是比较安全的方式，可以使用-80度的冰箱进行冷冻，时间从数小时到数日不等。
5. 复苏细胞冻存后，想要复苏它们，需要将细胞迅速退回到正常培养条件下。
此时需要谨慎地处理，以免破坏细胞结构和细胞膜等。
复苏的过程需要按照以下步骤：- 缓慢加热：将冻存细胞悬液从液氮中取出，快速将冻存管放入37度的水浴中，缓慢加热，让细胞悬浮在解冻液中的DMSO等有机溶剂逐渐被稀释。
- 洗涤：用无血清的培养基或PBS等洗涤一遍细胞，约10分钟，以去除有机溶剂。
- 均匀吸附：将无血清培养基或PBS加入细胞悬液中，让细胞吸附于培养皿上，约30分钟。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞冻存与复苏技术 概述 细胞培养技术自1907年开创以来，历经一个世纪现已成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一。在细胞培养技术广泛用于科学研究领域的令天，细胞株的冷冻保存和解冻复苏这一基础技术日益得到重视。 低温保存是活体组织保存最常用的方法之一。冷冻保存一般是指在0— 196 oC进行保存，就是将体外培养物悬浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率降至零下某一温度，并在此温度下对其长期保存的过程。主要有-20~-40℃ 冰箱保存、-60~-80℃深低温冰箱和液氮(一196℃)超低温保存等。
应用方向 1. 医学方面 近年来干细胞的研究越来越被人们关注，由于它是一种具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，可分化为多种功能细胞。 根据发育阶段和取材来源，干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。骨髓和脐血是成体干细胞的主要来源。 骨髓干细胞在骨髓中含量极少，约占骨髓有核细胞的十万分之一，所以要在临床上广泛应用首先必须具备先进的冻存与复苏技术。 而干细胞研究的深入将解决包括癌症等一系列为人们所知的“绝症”。而“冬眠”技术对医学的发展有着里程碑式的意义。 2. 生物学方面 细胞冻存技术是生物学保存物种的重要手段。在环境遭到史无前例的破坏动物、植被随时可能面临灭绝危险的今天，更是尤为关键，虽然不是治本的方法，但至少可以尽可能的留下那些曾经存在的生命痕迹。
发展历史 1. 1776年．Spallanzani最早发表了“冷”处理对“细胞”生命活动影响的报道。 2. 十九世纪中后叶，许多早期的工作者(Prevost，1840；de Quatrefages，1853；Mantegazza，1866；Scheuk，1870)重复研究了低温处理对精子活动的影响，得出了和Spallanzani相似的结论。即“冷不能杀死精子”。 3. 1900年前后，科学家基本上肯定了生物成份能够在零下温度储存的事实。 4. 二十世纪50年代 Luyet等多位学者发现了电解质浓度对储存细胞的损伤作用，他们的基本结论是。电解质浓度增大是造成储存细胞损伤的主要原因。 5. 1972年．Mazur等首先根据中国仓鼠组织培养细胞的低温保存实验数据分析，提出关于冷冻损伤的两因素假说目，即冰晶损伤和溶液损伤假说。 这个假说认为随着温度的下降，细胞内外的水分结冰，所形成的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏并引起细胞死亡。这种因细胞内部结冰而致的细胞损伤即就是冰晶损伤(Intracellular ice damage)。冰晶损伤是由冷却速度过快造成，冷却速度越快，冰晶损伤越大。 同时随着温度的下降．细胞外部的水分会先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度升高，细胞膜上的脂质会因长时问暴露在高溶质的溶液中而受到损坏，细胞发生渗漏，导致在复温时大量水分渗入细胞内造成细胞死亡。这种因保存溶液溶质浓度增高而致的细胞损伤被称为溶液损伤(Solution damage)。溶液损伤是由冷却速度过慢，使细胞在高浓度的溶液中暴露的时间过长而造成，冷却速度越慢，此损伤越严重。
冻存技术
冻存技术 1. 液氮法 目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。 常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。 细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121°C蒸气高压消毒)，2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。 主要操作步骤为： （1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。 （2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或甘油，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。 （3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。 （4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，最后沉入液氮中。 2. 分布降温法 细胞系冻存程序： 1) 单层细胞的消化。将经24~48小时培养已长成单层的传代细胞培养物弃去生长液，加适量ATV，1~2分钟后倒弃ATV，再加入少量ATV液，经0.5～1分钟倒去ATV，室温或37oC温箱作用2~3分钟，视细胞解离情况，拍打细胞培养瓶。使单层细胞完全解离。SP2／0瘤细胞，待生长好后用吸管吹打，再经1 000转／ 分离心lO分钟。 2) 离心洗涤：向培养瓶内加5~1 0m1预冷的MEM使细胞悬浮，再将其吸出置灭菌离心管中，以1 000rpm 离心8～10分钟后弃去上清液。 3) 细胞悬液的制备：向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液，使细胞浓度为150~400万／ml，然后迅速分装于安瓿瓶中，每瓶加量为lml。 4) 致冷冻结：将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内，直立置不同条件下致冷冻结果保存： a、4oC两小时后移至一2OoC作用2小时，再移入一4OoC4小时后在一7OoC下24小时投入液氮。 b， 一20oC4小时后移致一4OoC。C经4小时移人一7OoC冰箱24小时，投入液氮。 c， 一4OoC4小时后移入一70oC24小时后投入液氮。 d、一20oC4小时后移入一70oC经24小时后投入液氮中。 e、一70oC24小时后投入液氮中。 5) 液氮中保存：将冻结后的安瓿装入预冷的小布袋中，投入液氮。为防止安瓿漂浮，可预先在小布袋中加入几块小卵石。 3. 玻璃化法 玻璃化保存(Vitrification)是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞，使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质，而不形成冰晶。这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的盐浓度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤，可获得较高存活率。 玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他认为生命是生物活体系统的原子或其他结构元的一种特殊排列．并且轻微的排列位置扰动就会破坏平衡从而导致死亡，而结冰时的驱动力会破坏这种特殊的排列，这就是冰冻死亡的原因。玻璃 化比冻结固化方法引起的结构变化要小，因而是一种较理想的低温保存途径。 1981年，Fahy首先明确提出，用高浓度的低温保护剂溶液，可在较慢地冷却速率以及高压条件下实现完全的玻璃化，以后又发展了一些所谓“玻璃化溶液”，使细胞、组织乃至器官等范围广泛的生物系统玻璃化低温保存成为可能。 1985年，Rail和Fahy[ 目用这种玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存获得成功，是这种技术走向实用化的首次突破。 复苏技术 1. 细胞复苏的原则 在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。 2. 细胞复苏的主要操作步骤 （1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 （2）迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。 （3）在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。 3. 注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。
技术总结要点 1. 冷冻速度 冷冻速度也就是降温的速度，它与冷冻效果直接相关。Morris认为在冷冻过程中生物物理作用比生物化学作用更重要。冷冻速度、细胞收缩引起细胞膜和细胞器的变化是造成损伤的主要因素目。冷冻速度不同，细胞内水分向细胞外流动的情况也会不同。如果冷冻速度过慢，细胞内水分外渗多，细胞脱水，体积缩小，同时细胞内溶质浓度增高，细胞内不发生结冰；冷冻速度过快，细胞内水分没有足够时间外渗，随着温度的下降，细胞内会发生结冰；如果冷冻速度非常快，细胞内形成的冰晶反而非常小或不结冰而呈玻璃状凝固(玻璃化冷冻)。 不同的冷冻速度会使细胞内外产生不同的生理变化，同样也会对细胞造成损伤。冷冻速度过慢，细胞严重脱水，体积急剧收缩．超过一定程度时细胞失去活性。冷冻速度过慢会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度增高，产生溶液损伤。冷冻速度过快，细胞内水分来不及外渗，会在胞内形成较大冰晶，造成细胞膜和细胞器的损伤，产生细胞内冰晶损伤。1937年，Luyet实液体的凝固可分为两种形式：一种是晶体化，液体中的分子呈有序的排列；另一种为非晶体化即玻璃化，液体中的分子呈无序排列，保持未凝固前的状态。故从细胞存活角度来说玻璃化冷冻是最为理想的冻存方法。细胞内外呈玻璃化凝固。无冰晶形成或形成很小的冰晶，对细胞膜和细胞器不造成破坏；细胞也不会在高浓度溶质的溶液中因暴露时间过长而受损。 不同细胞的最适冷冻速度不同，主要取决于水分渗透过程是否与降温速度相匹配；同时还取决于细胞的表面积与体积之比，以及细胞膜的渗透率。一般来说。小细胞(如红细胞等)对水通透性强，适用于快冻，最佳冷冻速率较高，可达 103oC／min或更高；相反大的细胞或组织，如直径100 m以上的胚胎，对水的通透性弱，则适于慢冻。此外，最佳冷冻速度还受是否应用防冻剂、防冻剂的含量以及培养的细胞所处的状态等多方面的因素影响。目前被普遍接受的是皮肤的低 温保存中采用慢冻快复温，一般认为降温速率以1~5 oC／min为最佳。 2. 冷冻保存温度 冷冻保存温度是指长久保存细胞的超低温度，在此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止。经过长期保存的细胞和组织在复苏后仍能保存正常的结构和功能。 冷冻保存温度可以随着不同的细胞和生物体以及不同的冷冻保存方法而不同。液氮温度(-196 oC)是目前最佳冷冻保存温度。在-196 oC时，细胞生命活动几乎停止，但复苏后细胞结构和功能完好。应用-70~-80 oC条件冷冻保存细胞，