细胞冻存与复苏
实验十一、细胞的冻存与复苏
实验十一、细胞的冻存与复苏细胞的冻存与复苏是一种有效的保存和传播生物样品的方法。
该方法可以通过冷冻和贮存，将生物样品保存到未来任意时候使用。
本实验将介绍细胞的冻存和复苏实验步骤及注意事项。
实验步骤：1. 细胞的收集和分装首先，需要使用无菌采集工具收集待冻存细胞，如细胞培养板上的细胞。
然后，将细胞分装到无菌冷冻管中。
注意，每个冷冻管中应该放入适量的细胞，并确保其密封性。
2. 冷冻将装有细胞的冷冻管放入无菌水浴中，降温至-80℃或更低温度。
然后，将冷冻管转移到液氮罐中，进行长期保存。
3. 冻存的解除和复苏在复苏前，需要进行以下步骤：① 快速去除细胞上的冷冻剂：将冷冻管直接转移到37℃预热好的培养基中，震荡或轻轻地摇晃，使其中的冷冻剂快速融化。
② 细胞生长：将冻存细胞转移到新的培养板中，并添加适量的培养基。
然后将培养板放入培养箱中，进行细胞的生长。
注意事项：1. 冷冻剂的熟练使用DMSO是一种常用的冷冻剂，其作用是帮助细胞避免冷冻伤害。
然而，DMSO也具有一定的毒性。
因此，在使用过程中，需要注意浓度的控制以及操作时的保护措施。
2. 细胞处理的无菌性细胞的无菌性是决定细胞冻存和复苏成功的关键。
在操作期间，需要保持实验环境的无菌性，并避免细胞样品受到污染。
3. 冷冻剂和液氮的注意事项冷冻剂和液氮是极冷的物质，具有很强的腐蚀性和危险性。
在操作过程中，需要戴上手套和护目镜等防护器具，避免皮肤接触。
同时，要注意放置位置，避免冷冻剂和液氮的泄漏。
总结：细胞的冻存和复苏是一种非常有用并且实践的实验方法。
如果正确操作和保护，可以保证样品的保存和传播，并且为后续的实验提供便利。
细胞的冻存和复苏实验原理
细胞的冻存和复苏实验原理细胞的冻存和复苏实验主要是为了在需要时能够保存活性细胞，以便以后使用。
此过程主要涉及到细胞的冷冻、保存和复苏等环节。
细胞的冻存过程主要包括细胞培养、准备细胞冻存液、细胞冷冻和冷冻保存。
首先，培养细胞是实验的第一步。
细胞可以来自动物组织、细胞系、细胞株等，根据不同的细胞类型和需要，选取合适的培养基和条件进行细胞培养。
培养基中一般含有营养物质、生长因子、激素等，提供细胞生长所需的基础条件。
接下来，要准备细胞冻存液。
细胞冻存液是用于维持细胞的生命状态和保护细胞免受冻融损伤的溶液。
常用的细胞冻存液成分包括冻存液基础培养基、血清、DMSO(二甲基亚砜)等。
其中，冻存液基础培养基可以提供细胞生长所需的营养物质和生长因子，血清则包含有细胞生长因子、蛋白质、维生素等，可以提供细胞所需的生长因子；DMSO作为一种保护剂，可以降低细胞因冻融过程中的机械损伤。
然后进行细胞的冷冻。
将细胞培养物中的细胞用生长基础培养液洗涤去除残存的细胞培养液和旧的培养基，然后加入适量的细胞冻存液，混匀后分装于冷冻管中，最后将细胞冷冻管放入低温冰箱或液氮罐中。
低温环境下，细胞的代谢活动明显减慢，可以有效降低细胞死亡率。
细胞的冷冻保存是将细胞保存在低温条件下，通常为-80或更低的温度。
在低温下，细胞的代谢活动几乎停止，能够大大延缓细胞的老化和死亡，从而实现长期保存。
冷冻保存期间，细胞内部的水分被DMSO等冻存液成分替代，以防止细胞因冻结而受到损伤。
细胞的复苏是将被冷冻保存的细胞通过逐渐升温，使其从低温环境中恢复到生理温度并重新开始生长的过程。
复苏过程中需要进行一系列的操作，其中最关键的是将细胞从冷冻状态逐渐恢复到室温。
一般情况下，将冷冻管放入37水浴中，然后缓慢将温度逐渐升高。
此外，为了减小细胞受到冻融损伤，可以将细胞冻存液缓慢滴入含有细胞培养基的离心管中，将细胞悬浮液转移到细胞培养器皿中进行培养。
总之，细胞的冻存和复苏实验的主要原理是通过低温环境延缓细胞的代谢活动，同时使用合适的冻存液来保护细胞免受损伤，从而实现细胞的长期保存和生存能力的恢复。
细胞的冻存及复苏PPT课件
冷冻保存方法
1．非玻璃化冷冻 非玻璃化冻存是利用各种温级的冰箱分阶段降
温至-70 ℃ ～-80 ℃ ，然后直接投入液氮进行保 存；或者是利用电子计算机程控降温仪以及利用 液氮的气、液，按一定的降温速率从室温降至1000C以下，再直接投入液氮保存的方法 该种方法冻结的细胞悬液或多或少都有冰晶的形 成
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细胞冻存与复苏的关键因素
复苏速率
复苏速率：在细胞复苏时温度升高的速度。复温 速率不当也会降低冻存细胞存活率。一般来说， 复温速度越快越好，速度过慢，细胞内往往重新 形成较大冰晶而造成细胞损伤。复温时造成的细 胞损伤非常快，往往在极短的时间内发生。
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细胞冻存与复苏的关键因素 冷冻保护剂
冷冻保护剂：可以保护细胞免受冷冻损伤的物质 分为渗透性和非渗透性两类。 不同的冷冻保护剂有不同的优、缺点。目前一般 多联合使用两种以上冷冻保护剂组成保护液。
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细胞冻存与复苏的关键因素
保存温度
冷冻保存温度：能长期保存细胞的超低温度，在 此温度下，细胞生化反应极其缓慢甚至停止，但 经过长期保存，在复苏后仍能保持正常的结构和 功能。 液氮温度（-196℃）是 目前最佳的冷冻保存温度。
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冷冻速率：慢冻 复苏速率：快融 冷冻保护剂：渗透性和非渗透性 冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）
细胞冻存与复苏
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细胞的冻存和复苏
1.细胞冻存
细胞冻存与细胞传代保存相比优势在于：一，可以减少 人力、经费投入，减少污染，减少细胞生物学特性变化； 二，有利于保存那些不立即使用的细胞系或者将细胞系 转给其他使用者。
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细胞的冻存和复苏 1.细胞冻存
目前，动物细胞一般保存于液氮（-196℃）。
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细胞冻存和复苏的原则
细胞冻存和复苏的原则细胞冻存和复苏是一种先进的技术，可以将细胞保存在极低温下，并在需要时重新复苏。
它在医学和科学研究领域有着广泛的应用，包括细胞治疗、尸体保存和生物研究等。
然而，细胞冻存和复苏并不是一件简单的事情，它涉及到许多原则和技术。
本文将介绍细胞冻存和复苏的原则和一些常见的方法。
细胞冻存的原则主要包括细胞处理、冷冻保护剂和冷冻过程等。
1.细胞处理：在冻存细胞之前，需要进行适当的处理。
首先，需要确保细胞的纯度和活力。
通常使用细胞培养的方法，将细胞培养至富有生长活力的阶段，然后进行冷冻。
同时，还需要对细胞进行适当的处理，如细胞除膜、固定细胞骨架等，以增加细胞的抵抗力。
2.冷冻保护剂：冷冻保护剂是一种在冷冻过程中起到保护细胞的作用的物质。
常见的冷冻保护剂包括甘油、DMSO（二甲基亚砜）和微生物发酵的液体。
这些保护剂可以减少细胞在冷冻过程中的损伤，防止冰晶的形成，从而保证细胞的完整性和功能。
在添加保护剂时，通常需要控制浓度和时间，以避免对细胞的毒性。
3.冷冻过程：冷冻过程是细胞冻存的核心环节。
一般来说，冷冻过程需要经历冷冻速率的调控、冷冻温度的选择和冷冻存储条件的维护等步骤。
细胞的冷冻速率是决定细胞成活率的一个重要因素，过快或过慢的冷冻速率都会导致细胞死亡。
冷冻温度的选择也非常重要，通常选择深度冷冻，即将细胞冰冻至极低温下，以防止细胞的新陈代谢和生物活动。
冷冻存储条件的维护是确保细胞冷冻的安全和稳定性的关键，包括低温保存、无菌保存和无氧保存等。
细胞复苏的原则主要包括解冻过程和恢复过程等。
1.解冻过程：解冻过程是将冷冻细胞重新回温至正常温度的过程。
在解冻过程中，需要控制解冻速率和解冻温度，以避免细胞的损伤。
解冻速率过快或温度过高都会导致冰晶的形成和细胞的破坏。
因此，解冻过程需要缓慢而温和，可以通过温水浴、离心和悬液稀释等方法进行。
2.恢复过程：细胞在解冻后需要进行恢复过程，以恢复其正常的生理和生化功能。
细胞冻存与复苏
细胞冻存
1.观察CO2罐压强，，均为0时表示CO2没了
2.打开紫外半小时
3.关闭紫外半小时
4.打开超净台，点燃酒精灯，擦拭台面
5.取出所需药品：PBS 胰酶完全培养基(如果所剩完全培养基不够的话，需拿不完全培养基，双抗，胎牛血清)、DMSO(在细胞间那个柜子里，右手边棕色瓶)
6.取出细胞，倒出旧培养基，用PBS洗三遍后倒净
7.加入胰酶1ml，迅速放入培养箱中，此步不超过3min
8.取出细胞，如果超过3min消化时间可先把细胞培养瓶直立起来，，加入5ml完全培养基，吹打培养瓶细胞贴壁面，至细胞全部悬浮
9.吸出细胞至15ml离心管中，加入5ml含10%DMSO的完全培养基吹打制成细胞悬液，大概吹打60-100次即可
10．取出冻存管，每管加入1.6ml细胞悬液。
最后:4℃ 40min 负20 40min，然后放入负80保存
细胞复苏
开关紫外各半小时
1.打开水浴（37℃）(关紫外时打开即可)
2.酒精棉擦拭台面
3.从负80取出细胞，快速在水浴锅中解冻，，不断快速摇晃(不能让水进入冻存
管中)，此步一定保证尽可能快速解冻，一般1-2min即可解冻。
4.吸出冻存管中细胞至培养瓶，加入5ml完全培养液即可
5.第二天观察细胞状态，并给其换液
还有一种方法可以第二天不用换液，就是从冻存管中吸出细胞悬液加入15ml 离心管内，离心弃上清后，加入5ml完全培养基，吹打制成细胞悬液，加入细胞培养瓶内即可。
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤
细胞学堂｜细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存方法，用于长期保存细胞并保持其生理活性。
下面将详细介绍细胞冻存与复苏的技术原理和操作步骤。
技术原理：细胞冻存是通过将细胞在低温下快速冷冻，并加入保护剂以减少冷冻引起的细胞损伤，从而降低细胞的新陈代谢活动，保持细胞的生命特性。
具体原理如下：1.冷冻缓慢升温原理：冷冻过程中细胞内水分形成冰晶，容易损伤细胞结构。
为了降低损伤，冷冻时的降温速率应尽量缓慢。
而复苏时，也需要采取缓慢升温的方法，以避免溶解冰晶时造成的细胞破坏。
2.保护剂的添加：在冷冻过程中，加入一定浓度的保护剂能够防止细胞水分快速冻结而形成冰晶，从而减少冷冻引起的细胞膜和细胞器损伤。
一般常用的保护剂有甘露醇、二甘醇和甘油等。
操作步骤：下面将介绍细胞冻存与复苏的具体操作步骤：1.细胞选择与培养：选择要冻存的细胞，并保证细胞处于健康和活跃状态。
采用无菌操作，将细胞培养在适当的培养基中，并严格控制培养条件。
2.细胞冻存液的配制：将适当的冻存液配制好。
一般的冻存液组成包括培养基、胎牛血清/胎儿犊牛血清、20%-50%的甘油或其他保护剂。
保护剂的浓度取决于细胞的类型和耐受性。
3.细胞冻存：将培养好的细胞用冻存液冷冻保存。
首先，用培养基洗涤细胞，去除残留的培养基。
然后，添加冻存液，将细胞悬浮均匀。
最后，将细胞悬液装入标记好的冻存管中，并缓慢冷冻至-80℃或液氮中。
4.细胞复苏：将冷冻的细胞迅速取出，用温暖的手掌加热，迅速溶化冰晶。
将细胞悬液转移到离心管中，并加入预先配制好的培养基。
然后，用离心机离心，除去冻存液或保护剂。
最后，加入适当的培养基，将细胞继续培养。
5.细胞复苏后培养条件的控制：在细胞复苏后的培养过程中，需要严格控制培养条件，包括温度、CO2浓度、培养基成分和营养物质的供给等，以确保细胞能够正常生长和繁殖。
总结：细胞冻存与复苏是一种常用的细胞保存技术，可以长期保存细胞并保持其生理活性。
细胞复苏与冻存
细胞冻存与复苏原则：慢冻快融在超低温的液氮中进行冻存（-196度）。
在冻存过程中，随着温度的改变，细胞内部结构讲发生一系列的变化。
细胞快速冻存时，将会受到很大的损伤，甚至导致细胞的死亡。
温度急速下降时细胞脱水少，还会使细胞内结冰。
细胞内冰晶的形成会造成蛋白质和酶的变性，以及细胞器的损伤，并最终导致细胞的死亡。
因此，冰冻细胞时，应使温度缓慢下降，从而使细胞内水分渐渐脱出，使细胞内不结冰。
由于冰冻细胞体中的冰晶体很小，融化时必须快，以防这些微小晶体转化为较大的冰晶体。
因此，细胞的冻存和融化过程要在缓冰速融”下进行。
一般冷冻时，在-30度之前药缓慢降温，速度控制在每分钟下降1度，—30度以下可快速冷冻，使温度降至—196度。
冰冻时还要加入5〜10 %的甘油或二甲基亚砜作为冷冻保护剂。
因为二者分子量小，容易穿透细胞降低细胞内的冰点，并提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冻存，可使细胞内的水分渗出在细胞外形成冰晶，从而避免细胞损伤。
在细胞复苏过程中，必须快速溶解,否则容易造成细胞外溶解的水分进入细胞内重新形成冰晶，造成细胞死亡。
一、细胞复苏如果冻存前细胞状态好，而且冻存时间长，复苏用的培养液没问题的话，复苏细胞出现问题最可能的原因是解冻时间过长和解冻后没有及时稀释接种KEY：1．冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。
2．细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常（例如产生单株抗体或是其它蛋白质）。
Protocal（以贴壁细胞系tsA201 为例）1. •准备材料：37C〜40 C水浴，37 C预热培养液，离心管、血球计数盘与盖玻片2. 细胞实验室进行常规消毒，紫外照射30 min 以上，超净台开启通风10 min。
培养液孵温至于37 °C3. 培养液回温后喷以70 % 酒精并擦拭，移入无菌操作台内。
将7-10 ml 左右新鲜培养基移入离心管中，备用。
细胞冻存和复苏的基本原则
细胞冻存和复苏的基本原则在科学的世界里，细胞就像我们的好朋友一样，既珍贵又脆弱。
想象一下，如果能把这些小家伙冷冻起来，等到需要的时候再把它们复苏，这简直是个梦吧！不过，冻存和复苏可不是随便一冻一热就能搞定的，今天咱们就来聊聊这背后的基本原则，让你轻松掌握这些小窍门。
1. 冻存的基本原则1.1 冻存前的准备首先，冻存之前可得好好准备。
这就像是出去旅行之前得收拾行李一样。
要确保细胞的健康状态，最好先让它们在适合的环境中“养精蓄锐”，这样才能确保它们的“战斗力”。
对了，培养基可别忘了换，培养环境也要保持稳定，不然细胞可受不了这种折腾，估计连个“自我保护”的机会都没有。
1.2 冻存剂的选择接下来，我们得选好冻存剂。
市面上有各种各样的冻存剂，最常用的就是二甲基亚砜（DMSO）和甘油。
这些东西就像是细胞的“保暖内衣”，能帮助它们抵御严寒。
用冻存剂的时候，记得浓度别太高，太浓了反而对细胞不好。
你想啊，就像喝酒一样，太烈了，谁受得了？所以，适量最重要。
1.3 冻存过程现在，到了最关键的环节，冻存过程。
这个时候，细胞需要缓慢降温，让它们适应冷冻的环境。
通常，咱们会用一个叫“程序化冷冻”的设备，把温度控制得稳稳的，像个温柔的妈妈，慢慢带着宝宝入睡。
记得，细胞在80°C或者液氮环境下存放，一年又一年，它们依然保持着“青春永驻”。
2. 复苏的基本原则2.1 复苏前的准备好了，冻存结束，接下来是复苏。
复苏可得快点，细胞在冰箱里待久了，可是受不了冷的，像是被冻住的小龙虾，急需解救！在复苏前，我们需要准备好复苏的培养基，确保它是温暖的，就像是冬天里的一杯热可可，温暖又舒心。
2.2 复苏过程复苏的时候，要小心翼翼，把冻存的细胞迅速放入37°C的水浴中，快速解冻。
这就像是在冰天雪地里给小家伙们来一场“温泉浴”，让它们感受到春天的气息。
解冻的时间可得掌握好，太长了会让细胞崩溃，太短了又不够，所以就像是调味料，恰到好处才是王道。
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细胞冻存与复苏细胞冻存与复苏细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。
细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。
细胞的冻存【用品】（1） 5%胰蛋白酶（2）含10%~20%血清培养液（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒）（4）吸管、离心管、冻存管【步骤】（1）从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。
在冻存前一天最好换一次培养液。
（2）用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。
依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。
（3）去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。
用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。
（4）装完细胞后的冻存管即可直接冻存。
以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。
以后取出冻存管移入液氮容器内。
在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。
细胞在液氮中储存时间理论上是无限的，但为妥善起见，特别是很多为被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏一次观察细胞对冻存的适应性。
已建系的细胞最好也每年取一支复苏一次后，再继续冻存。
细胞的复苏【用品】培养液，吸管，离心管，培养瓶，37℃温水【步骤】（1）从保存冻存管的支架中取出冻存管应直接投入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
如果冻存管密封不严，在保存过程中液氮进入冻存管中，从液氮罐中取出时由于温度升高导致液氮急速气化而爆炸，可能会危及面部等。
因此，存取冻存管时都要佩戴眼镜和手套。
（2）从37℃水浴中取出冻存管，用酒精消毒后，拧开冻存管，用吸管吸出细胞悬液，注入离心管并滴加10倍以上培养液，混合后低速离心，除去上清液，在重复用培养液洗一次。
（3）用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放在37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养。
如果复苏时细胞密度较高要及时传代。
细胞复苏时细胞数可以做10~20倍稀释，接种密度以5×105/ml为宜。
1 冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 °C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管之爆裂。
2 细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，应直接放入含有10-15ml 新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3 可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。
4 可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。
血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清，在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5 何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，两者都是指胎牛血清， FCS 错误的使用字眼，请不要再使用。
CS (calf serum) 则是指小牛血清。
HS (horseserum) 则是指马血清。
6 培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。
当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时，则应使用5 % CO2 培养细胞。
7 何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
8 培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。
9 附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。
第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于�C20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低，并可减少污染之机会。
10 悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即可，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法容纳为止。
分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。
11 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1,000rpm)，5 - 10 分钟，过高之转速，将造成细胞死亡。
12 细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。
细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
13 细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。
注意：由于 DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。
14 DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO 等级，必须为Tissue culture grade 之DMSO (如SigmaD2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4°C，避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。
若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
15 冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*)→ -80 °C16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至�C80 °C以下，再放入液氮槽vapor phase 长期储存。
*-20 °C 不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
16 细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106cells/ml vial 为宜。
17 应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。
主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。
严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
18 如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？直接灭菌后丢弃之。
19 支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？不能。
除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
20 支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。
故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
21 侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
22 CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
23 为何培养基保存于 4 °C 冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH 值会越来越偏碱性？培养基保存于4 °C 冰箱中，培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。
而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。
培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。
若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH 值。
24 各种细胞培养用的dish板，flask瓶子是否均相同？不同厂牌的dish 或flask，其所coating 的polymer聚合物不同，制造程序亦不同，虽对大部分细胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。
25 购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。
建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
26 购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。
血清使用错误或血清的品质不佳。
解冻过程错误。
冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。
悬浮细胞误认为死细胞。
培养温度使用错误。
细胞置于�C80 °C 太久。
27 收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。
另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
感谢您的阅读，祝您生活愉快。