人成骨肉瘤细胞系MG-63“Holoclone”样单克隆的分离及其成骨分化程度的鉴定

试剂 １ ｌ放 人 ｃ ２ 箱 中孵 育 ２ｈ 酶 标 仪 波 长 ０ ， ｏ孵 ，
４ ０ｎ ， ５ ／ 读取 光 密 度 Ｏ ｎ Ｄ值 。记 录结 果 （ 细胞 Ｏ Ｄ值
＝
细 胞孔 Ｏ Ｄ值 一清 零组 Ｏ Ｄ值 ） 。以不 同单 克 隆亚
系为 横坐 标 ， 细胞增 殖 百 分 率 （ 为 纵 坐标 （ ０ｈ ％） 以 增值 率作 为 １０ ）使 用 Ｍｉｏｏ ｘｅ软件 绘制 细 ０％ ， ｃ ｓｆＥ ｃｌ ｒ ｔ
①取 传 代 生 长 良好 的对 数
生长 期 细胞 ， ． ５ ０ ２ ％胰 酶 消 化 收 集 细 胞 。加 入 ４Ｃ ￣
预 冷 的 ７ ％ 乙醇 固定 ２ ， ５ ４ ｈ 预冷 Ｐ Ｓ洗 两 次 ， ０ ０ Ｂ １ ０ ｒｍ离心 ５ ｍｎ 调 整 细 胞 浓 度 为 １ ０／ Ｌ ｐ ｉ， ×１６ｍ 。加 入 ０ ５ｒ 碘 化 丙 啶 （ ０ｔ ／ Ｌ ， ℃避 光 染 色 ３ ｉ。 ． ｎ ｌ ５ ｇｍ ） ４ ￣ ０ｍ ｎ
孙树 东 ， 娄 楠 王 ， 岩 赵 建武 ，
（． １吉林大学第二 医院 骨科 ， 吉林 长春 １０４ ；． ３０ １２ 吉林 大学中 日联谊医 院 骨科 ；
３ 吉 林 大 学 中 日联 谊 医 院 基 因诊 疗 中心 ） ．
骨 肉瘤 无论 从 临床 角度 还是 分子 生物 学 角度来
胞生 长 曲线 。 １３ ３ 软 琼脂 集 落 形 成 试 验 取 ３ ％保 温 的不 同 ．． ７ 密度 的细 胞 悬 液 ９ ４ ｍ 移 人 小 烧 杯 中， 入 ５ ℃ ． ｌ 加 ０
５ ％琼 脂 ０ ６ｍ ， 速混 匀 ， 即浇 入 铺 有 底 层 琼 脂 ． ｌ迅 立
物表 达更 趋近 于未 分化 状态 。
流式 细胞 仪 分 析 ， 波 长 为 ４ ８ｎ 、０ ｖ氩 离子 在 ８ ｌ ３０ ｍ ｎ 激光 条件 下 ， 每份 样 品检测 １ ０／ Ｊ ×１４ｍ 个细胞 。
１３ ５ Ｒ —Ｃ 将 选 定 细胞 株 分 别 接 种 ２ ． ． ＴＰ Ｒ ４孔 板 ，
６ 细胞在 ９ 孔板 中稀释成 每孔含 ０ ５ 个细胞 ， ３ ６ ． —１ 在克 隆化 后 ３—５ ｄ选 出仅 含 有 单 个 细 胞 生 长 的并 生长 成完 全克 隆 的孔 进 行 标 记 ， 细胞 增殖 至孔 面 待 积 １３时 （ ／ 即细 胞数 超过 ６０个 ） 将细 胞移 至 ２ ０ ， ４或
１ 材 料和 方法
１ １ 材 料 ．
（ 浓度 为 ０ ３ ． ％）的 ２ 培 养 板 中 ， 孔 加 ０ ８ｍ ， ４孔 每 ． ｌ 置 室 温 使 琼 脂 凝 固 ， 孑 细 胞 数 为 １０ 接 种 １ 每 Ｌ ０， ４ｄ 后， 计算 克 隆数 ， 个 集 落 细 胞 数 ≥５ 为 １ 克 每 ０时 个
隆。
人 成 骨 肉 瘤 细 胞 ＭＧ６ 购 自 Ａ Ｃ 。 高 糖 －３ ＴＣ
Ｄ Ｍ（ ． ＭＥ ＭＥ Ｈ Ｄ Ｍ）Ｇｂｃ Ｓ 优 等 胎 牛 血 清 （ Ｂ ） ｉｉ Ｕ Ａ ｏ Ｆ Ｓ Ｈ ｃ ｎ Ｓ ｙｌ ｅＵ Ａ胰 酶 Ｐ ｍ ｇ Ｓ Ｍ Ｏ天 佳生 物科 技 ｏ ｏ ｒ ｅａＵ Ａ Ｄ Ｓ
有 限公 司 Ｃ ｉａＤ Ｐ ｈｎ Ｅ Ｃ鼎 国生 物科 技有 限公 司 Ｃ ｉａ ｈｎ
Ｔｉｏ Ｉｖｔ ｇｎＵＳ Ｔ Ｋ ＿ａＲ － Ｃ ｔ ａ Ｒ ａ ａ ｒ ｌ ｎ ｉｏ ｅ Ａ ａ ａ Ｔ Ｐ Ｒ ＫｉＴ Ｋａ ａＪｐ ｎ ｚ ｒ Ｒ
１３ ４ 细 胞周 期 检 测 ．．
１ ３ ２ 细胞增 殖率 测 定 ．．
பைடு நூலகம்
用 ９ ： 板 接种 细胞 数 为 ６Ｌ ￣
讲都 是 一个异 质 性 的肿 瘤 ， 其 一 直 就 采 用 间 充质 而 的分 化标 准来 进 行分 级 。尽管 目前 在 医学研 究 和外 科手 术上 都取 得 了长 足 的进 步 ， 对 于高 危 骨 肉瘤 但
Ｍ ｒｅ １０ ａａ ａａ ａ Ｎ 聚 合 酶 Ｔ Ｋ Ｒ ａｋｒ ５０ Ｔ ｋｒ Ｊｐ Ｔ ｑ Ｄ Ａ ａ ｎ ＡＡＡ ＪｐｎＣ ｋ８碧 云天 生物研 究 所 Ｃ ＩＡ ａａ Ｃ ． ＨＮ １ ２ 克 隆筛选 ． 采用 有 限稀 释 法 ， 对 数 生 长 期 的骨 肉瘤 Ｍ 将
形成 能力 和更 强 的粘 附能 力 ［２。其 成 骨 分 化 标 志 １３ ，
１３￣ ， 续 计 数 ７ ｄ 绘 制 生 长 曲 线 。采 用 Ｃ ｌ ０ Ｌ连 ／ ， ｅ ｌ
Ｃｕｔｇ ｔ （ Ｃ Ｓ分析骨肉瘤细胞增殖 。每组取 ｏ ｉ 一 ＣＫ） ｎｎ Ｋ ８ ｉ ６ 复 孔 ， 培 养 板 移 人 Ｃ ＇ 箱 中 ， ３ ℃ ， ％ 个 将 ０孵 在 ７ ５ ｃ ２ ９ ％湿度 条 件 下 ， 养 ２ 。每 孔 加 Ｃ Ｋ ８ ｏ及 ５ 培 ４ｈ Ｃ ．
的死 亡 率 仍 然 停 滞 在 ３ ％到 ５ ％ ， 如 何 针 对 其 ０ ０ 而 近年 来 已有学 者 通 过 骨 肉瘤 的研 究 ， 用 单 细胞 克 使 隆筛选 的方 法 ， 图得 到 高 侵 袭 ， 致 瘤 的 细 胞 亚 以 高 群 。而 我们采 用 先分 离得 到 ｈｌ ｌ ｅ 通过 多个 成 ｏｃ ｎ后 ｏｏ 骨细 胞分 化标 志 物 的检 测 ， 到 高侵 袭 及 高致 瘤 的 得 骨 肉瘤 细胞株 。并 对这 些 骨 肉瘤细 胞株 进行 了一 系 列 的 鉴 定 试 验 。 而 通 过 观 察 我 们 发 现 能 够 形 成 “ ｏ ｃ ｎ” ｈｌ ｌ ｅ 的恶 性 肿 瘤 细 胞 是 肿瘤 中 的真 正 致 瘤 部 ｏｏ 分， 而这 些细胞 株形 成 的克 隆更 小 ， 具有 很高 的克 隆
中国实验诊 断学
２１ ００年 １ 月 １
第ｌ ４卷
第 １ 期 １
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文 章 编 号 ：０７—４８ （００ １ —１６ —０ １０ ２７２ １）１ ７９ ３
人 成 骨 肉瘤 细胞 系 ＭＧ ６ “ ｏｏｌｎ ＂ 单 克 隆 的 一３ Ｈ ｌｃ ｅ 样 ｏ 分 离 及 其 成 骨分 化 程 度 的鉴定