不同转移潜能骨肉瘤细胞株的建立与生物学性质的分析(一)
不同转移潜能骨肉瘤细胞株的建立与生物学性质的分析(一)
作者：陈翔，杨彤涛，马保安，范清宇’
【关键词】骨肉瘤
Establishmentofhumanosteosarcomacellsublineswithdifferentpotentialofmetastasisandstudiesontheirbiologicalcharacteristics
【Abstract】AIM:Togethumanosteosarcomacellsubcloneswithdifferentpotentialofmetastasis.METHODS:WegotdifferentmonocellclonesbythelimiteddilutionmethodfromthehumanosteosarcomacelllineSOSP9607.Afterpreliminaryscreeningbyinvitroinvasionassay,weselectedtwocelllinesashighmetastasispotentialcellsubclonesandthreecellsubclonesaslowmetastasispotentialcellsubclones.Weinoculatedthesesubclonesintonudemiceforthreecirclesandobtaineddifferentmetastaticpotentialsubclones.Wetheninspectedtheirdifferentbiologicalpropertiesbytestsofcellgrowthcurveassay,chromosomenumber,softagarcloningtechnique,flowcytometryandautometastasisinnudemice.RESULTS:Wegotthetwosubcloneswiththedifferentmetastasispotential:lowpotentialsubcloneH9andhighpotentialsubcloneE10.Theyhadthesamehypotriploidkaryotypewithhumanchromosomemorphology.E10hadfastergrowthspeedthanH9andtheartificiallungmetastasisrateofH9andE10innudemicewas10%and100%,respectively.TherateofSphasecellcyclewasrespectively16.8%and21.0%.CONCLUSION:Thesetwosubclonescomefromthesamemothercelllineandtheirdifferencemainlyliesinthedifferentmetastaticphenotype.Thisstudywillhelpthescreeningofmetastasiscorrelatedgene,thestudyofthemetastaticmechanismandclinicalstudyofosteosarcoma.
【Keywords】osteosarcoma；neoplasmmetastasis；cellsubclone；biologicalspecialties
【摘要】目的：获得不同转移潜能的骨肉瘤细胞株.方法：从我室建立的人成骨肉瘤细胞系SOSP9607中通过有限稀释法获得不同的单细胞克隆，经过侵袭试验初筛后获得5株转移潜能不同的细胞株，再通过裸鼠体内连续传代法筛选出具有不同转移能力的细胞系.并利用细胞生长曲线测定，软琼脂克隆形成试验，流式细胞仪，裸鼠体内自发转移试验分析了他们的生物学性质.结果：获得两株转移潜能不同的骨肉瘤细胞株.其中,H9为具有低转移潜能的骨肉瘤细胞株,E10为具有高转移潜能的骨肉瘤细胞株，其染色体众数分布特征与母系SOSP9607基本相似，保持人类染色体核型；所至皮下移植瘤及肺转移瘤均符合人成骨肉瘤组织学特征，它们具有差异明显的体外生长速度，软琼脂克隆形成率H9（22±5）明显高于E10(98±12)，裸鼠体内试验性自发肺转移率分别为10%和100%，流式细胞仪测定H9和E10的S期细胞分别为16.8%和21.0%.结论：这两株细胞株来源于同一亲本，他们之间的差异集中在转移表型上，为今后利用分子生物学的方法筛选出转移相关基因从而为成骨肉瘤的转移机制及临床研究奠定基础.
【关键词】骨肉瘤；肿瘤转移；细胞株；生物学特性 0引言
肿瘤转移是一系列步骤组成的，包括侵袭周围组织，延血管或淋巴管运行、在靶器官上增殖等.自Fidler〔1〕提出肿瘤转移异质性概念后，国内外已相继有一些实验室建立了黑色素瘤，前列腺癌，肺癌的不同转移潜能的细胞亚系〔2-4〕.但从人骨肉瘤细胞中分离出具有不同转移潜能的肿瘤转移亚群的报道却不多见，这在一定程度上限制了对骨肿瘤转移机制的深入研究.为了在分子水平对其进行比较研究，获得具有相同的遗传背景不同转移潜能的肿瘤细胞株十分重要.
1材料和方法
1.1材料
成骨肉瘤细胞系SOSP9607细胞系由第四军医大学唐都医院全军骨肿瘤研究所实验室建立；RPMI1640(Gibco,USA),胰蛋白酶（华美生物工程公司）；胎牛血清与小牛血清（兰州民海生物制品公司）；细胞培养瓶与细胞培养板（Nunc，USA）；基底膜胶（北京大学医学部细胞中心）；侵袭小室（MiliporePI8P01250，USA）；流式细胞仪（第四军医大学免疫教研室提供）；BALB/cnu/nu裸小鼠（上海思莱克动物试验有限公司）；琼脂（Spain兰州民海生物制品公司）.
1.2方法
1.2.1SOSP9607的克隆化分离培养SOSP9607骨肉瘤细胞至对数生长期，用2.5g/L胰酶消化，倒置显微镜下记数，梯度稀释至4.6mL含230个细胞（每0.1mL含5个细胞），加入96孔板前36个孔，每孔0.1mL.还剩1.0mL，加培养基至5mL（每0.1mL含1个细胞）再加入相邻的36孔，每孔0.1mL.剩余1.4mL，再加培养基至终体积2.8mL，（每0.1mL含0.5个细胞）加入剩余的24孔，每孔0.1mL.放入培养箱中，在37℃，50mL/LCO2，饱和湿度环境下培养5d，倒置显微镜下观察有单细胞克隆生长，补充培养基继续培养，待长满孔底后消化移至24孔板，6孔板，最后移至培养瓶中培养，得到单克隆的细胞株，分别命名为B7，B12，C2，C11，D12,E10,E12,F6,H4和H9.
1.2.2利用体外侵袭试验进行初筛将细胞培养至对数生长期后，用2.5g/L胰酶消化，记数，加入Millipore中，每室2×105个细胞数.放入培养箱中常规培养7h，用棉签擦去侵袭膜上的瘤细胞和基底膜胶，甲醇固定30min，常规染色记数膜背面的细胞数，将其平均分为4个象限，每株细胞3孔，取平均值.
1.2.3原位移植法在裸小鼠体内连续传代筛选转移细胞株
1.2.3.1皮下移植瘤模型取对数生长期的细胞株，消化，记数5×106/mL，取0.2mL（含1×106个细胞）注射于3wk龄裸小鼠股部及颈部皮下，2wk后开始有肿瘤生长，待长至1.0cm×1.5cm后处死，将其剪成直径0.5mm大小瘤块备用.
1.2.3.2裸小鼠原位移植取3~4wk龄裸小鼠，手术前每只裸鼠腹腔注射枸橼酸芬太尼（国产）和咪达唑仑（国产）混合液，每种药水用无菌药水稀释1倍后1∶1混合，每只裸鼠0.2mL.手术在清洁环境下进行，将裸鼠固定后，乙醇消毒，沿右胫骨表面剪开皮肤，皮下，剥离部分胫前肌，暴露胫骨平台，用皮试针头沿45℃方向撬开一骨片，将准备好的肿瘤碎片植入骨髓腔中，盖好骨片，用尼龙线全层缝合皮下、皮肤.
1.2.3.3体内连续传代5wk后观察到肿瘤生长，待10wk后处死全部裸鼠，如有呼吸困难，恶液质情况立即处死，取肺组织，肉眼观察及病理切片有肺转移者，留取肺组织中较大转移结节行原代培养并进行组织学观察，培养的细胞经5次传代后按上述办法进行第二次肺转移试验，共进行3个循环，第3次（肺转移率已达100%）从裸鼠肺转移结节原代培养获得的细胞为具有高转移潜能的肿瘤细胞株，相反的，肉眼观察及肺组织切片观察3次均不转移的细胞株为具有低转移潜能的细胞.然后连续扩大培养约30代，分别冻存.
1.2.4细胞生长曲线取两株相同代数细胞株培养至对数增长期，消化计数后，调整细胞数为1×105个，接种至25mL细胞培养瓶，每日任取3瓶细胞消化后计数，取其平均数，连续7d后绘制细胞生长曲线.
1.2.5H9,E10与母系SOSP9607细胞染色体的制备染色体制备参照鄂征〔5〕所介绍的方法.
1.2.6软琼脂克隆形成试验用三蒸水制备浓度为12g/L的低熔点琼脂糖液，高压灭菌后，放于40℃水浴锅中防止凝固.按1∶1混合12g/L琼脂糖液和2×DMEM（含200mL/L小牛血清），取3mL上述液体注入直径3.5cm的平皿中，冷却凝固.消化细胞制成悬液并计数.按1∶1混合0.7mg/L琼脂糖液和2×DMEM（含200mL/L血清），在上述3mL液体中加入0.2mL细胞悬液（含600个细胞）充分混匀，注入底层琼脂已凝固的平皿，冷却凝固.置37℃孵箱中培养10~14d，计录克隆形成数.
1.2.7裸鼠实验性肺转移率测定按常规分别消化培养瓶中的两株同代克隆细胞株，制成细胞悬液，经细胞计数后按每鼠1×105细胞量在无菌环境下分别注入两组裸鼠（每组10只）的尾静脉.实验鼠均在接种瘤细胞后1.5mo后处死，分别取出两组裸鼠的肺作全面的病理学检查，计算其转移率.
1.2.8流式细胞术测定细胞周期分布收集培养瓶中细胞，PBS洗涤，用体积分数750mL/L的冷乙醇固定.将细胞数调整在1×105/mL左右，溴化丙锭染色，上机检测.
统计学处理：数据用x±s表示，采用SPSS10.0软件进行数据处理，不同细胞株间比较采用方差分析及SNKq检验；H9与E10之间软琼脂克隆细胞数比较采用t＇检验，P0.05为有统计学意义.
舒尼替尼调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移与凋亡机制研究
第22卷第6期北华大学学报(自然科学版)Vol.22No.62021年11月JOURNALOFBEIHUAUNIVERSITY(NaturalScience)Nov.2021
文章编号:1009-4822(2021)06-0743-05DOI:10.11713/j.issn.1009-4822.2021.06.009
舒尼替尼调控骨肉瘤细胞的增殖、迁移与凋亡机制研究
李 凡1,朴香花2,马 越1,段显亮1(1.北华大学附属医院,吉林吉林 132011;2.吉林市中心医院,吉林吉林 132011)
摘要:目的 探讨抗肿瘤药物舒尼替尼对骨肉瘤细胞增殖、迁移与凋亡的影响及潜在作用机制.方法 制作骨肉瘤原位癌和转移癌的小鼠模型,将模型小鼠分为A组(40mg/kg舒尼替尼)、B组(10mg/kgPD-L1抗体)、C组(舒尼替尼和PD-L1抗体联合治疗)、D组(PBS对照);定期测量肿瘤体积大小,通过观察转移的骨肉瘤小鼠肺组织,确定骨肉瘤细胞的百分比;通过流式细胞学染色技术观察小鼠的免疫细胞群数量,明确肿瘤的免疫微环境;通过Westernblot方法测定骨肉瘤的PD-L1和STAT3,通过CCK-8和Transwell法分析骨肉瘤的侵袭性.结果 PD-L1表达水平在各骨肉瘤细胞间比较差异具有统计学意义(P<0.05),其中KRIB、U2OS、143B和LM7细胞中表达水平较高,而在MG63.2和SAOS-2细胞中的表达水平较低;舒尼替尼可显著降低KRIB和LM7细胞的转移和侵袭能力,有效降低骨肉瘤细胞的转移和侵袭;舒尼替尼通过调控STAT3而降低PD-L1的表达,并且还能重建实验小鼠的免疫系统,有效控制骨肉瘤的转移;舒尼替尼和PD-L1抗体联合应用可以更好地控制骨肉瘤生长与远处转移.结论 舒尼替尼可有效控制荷瘤小鼠骨肉瘤的增殖与迁移.关键词:舒尼替尼;骨肉瘤;凋亡;增殖中图分类号:R73文献标志码:A
收稿日期:2021-08-14基金项目:吉林省卫生与健康技术创新项目(2019J045);吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20200070KJ).作者简介:李 凡(1982—),男,主治医师,主要从事创伤骨科、骨肿瘤、骨关节重建研究,E-mail:28643632@;通信作者:段显亮(1977—),男,副主任医师,主要从事创伤骨科、骨肿瘤、骨关节重建研究,E-mail:714418649@.OnMechanismofSunitinibRegulatingCellProliferation,MigrationandApoptosisinOsteosarcoma
LEF1在骨肉瘤组织中的表达及其对骨肉瘤细胞增殖和转移影响研究
LEF-1在骨肉瘤组织中的表达及其对骨肉瘤细胞增殖和转移影响的研究培养类别全日制学位类型学术学位一级学科(专业类)临床医学二级学科(专业)外科学（骨外）研究方向骨肉瘤转移机制研究指导教师马保安教授（主任医师）培养单位唐都医院骨科二O一三年五月分类号R73-37UDC616-006密级公开任坤独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位为第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文等使用本论文工作成果时第一署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文；学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。同意学校将论文加入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》和编入《中国知识资源总库》等，并可浏览和下载，同时享受《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定的相关权益。论文作者签名：导师签名：日期：第四军医大学硕士学位论文目录缩略语表...............................................................................................................................1中文摘要...............................................................................................................................3英文摘要...............................................................................................................................6前言...............................................................................................................................9文献回顾.............................................................................................................................111骨肉瘤......................................................................................................................112Wnt信号通路...........................................................................................................163LEF-1的研究进展...................................................................................................22正文.............................................................................................................................25实验一LEF-1在骨肉瘤组织中的表达及临床意义..................................................251材料..........................................................................................................................252方法..........................................................................................................................253结果..........................................................................................................................274讨论..........................................................................................................................28实验二不同转移能力骨肉瘤细胞株中LEF-1差异表达的验证.............................311材料..........................................................................................................................312方法..........................................................................................................................323结果..........................................................................................................................374讨论..........................................................................................................................37实验三siRNA干扰LEF-1基因的表达及转染效果检测.........................................391材料..........................................................................................................................392方法..........................................................................................................................40第四军医大学硕士学位论文3结果..........................................................................................................................424讨论..........................................................................................................................43实验四LEF-1对骨肉瘤细胞侵袭、迁移及增殖能力的影响.........................................451材料..........................................................................................................................452方法..........................................................................................................................463结果..........................................................................................................................484讨论..........................................................................................................................50小结.............................................................................................................................52参考文献.............................................................................................................................53个人简历和研究成果.........................................................................................................64致谢.............................................................................................................................65第四军医大学硕士学位论文
不同转移潜能的人前列腺癌细胞原位转移模型的建立与比较
安徽医科大学学报Ａｃｔａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓ Ａｎｈｕｉ ２００６ Ｏｃｔ；４１（５） 。４９３・ 不同转移潜能的人前列腺癌细胞 原位转移模型的建立与比较 张明霞，张玉侠，邓松华 摘要 目的建立不同转移潜能的人前列腺癌细胞转移模 型，并比较其结果。方法利用人前列腺癌细胞系ＰＣ３单克 隆细胞株裸鼠皮下移植瘤，通过外科原位移植技术植入 ＢＡＬＢ／ｃ．ｎｕ／ｎｕ雄性裸小鼠，建立人前列腺癌高、低转移细胞 株转移模型；并观察比较两细胞株转移模型的原位成瘤率、 自发转移率、两细胞株形态学特征和转移抑制基因ＣＤ４４ｓ 的表达。结果人前列腺癌高转移细胞株裸鼠原位种植后 原位成瘤率１００％，主动脉旁淋巴结转移率为１００％，低转移 细胞株裸鼠原位种植后原位成瘤率１００％，主动脉旁淋巴结 转移率为４０％，两者主动脉旁淋巴结转移率差异有显著性 （Ｐ＜０．０５）。高、低转移细胞株形态学特征亦不同。ＣＩＭ４ｓ 蛋白在人前列腺癌高转移性单克隆细胞株ＰＣ３一Ｈ中的表达 强度低于低转移性单克隆细胞株ＰＣ３．Ｌ。结论遗传背景相 似的人前列腺癌高、低转移细胞株原位移植转移模型为研究 人前列腺癌转移机制提供了有力工具。 主题词前列腺肿瘤；肿瘤转移；小鼠，裸；细胞系；基因表 达 中图分类号Ｒ７３７．２５；Ｒ一３３２ 文献标识码Ａ文章编号１０００—１４９２（２００６）０５—０４９３—０４ ２００６—０８一Ｏ１接收 基金项目：安徽省自然科学基金资助课题（编号：０５０４３０７０６） 作者单位：安徽医科大学病理生理学教研室，合肥２３００３２ 作者简介：张明霞，女，３１岁，硕士研究生； 邓松华，男，５２岁，教授，硕士生导师，责任作者，Ｅ—ｍａｉｌ ＤＥＳ０Ｈ＠１２６．Ｃ０Ｍ 前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的肿瘤， 在美国肿瘤致死的男性人群中，前列腺癌占第二位， 仅次于肺癌 。近年来，我国随着人口老龄化和饮 食结构的改变，前列腺癌的发病率和死亡率有逐年 增高的趋势 Ｊ。前列腺癌转移发生早是治疗失败 的主要原因，为深入了解前列腺癌细胞的恶性生物 学行为，需要建立相应的模型和方法。本课题旨在 对转移性人前列腺癌细胞系ＰＣ３进行优化选择，以 建立更符合临床和实验研究需要的转移性人前列腺 癌细胞模型系统，为推动深入研究人前列腺癌转移 机制、寻找预测转移的新指标、筛选防治新策略奠定 工作基础。 １材料与方法 １．１材料和裸鼠ＰＣ３细胞系购于中国科学院上 海细胞生物研究所。所用试剂和仪器为：美国Ｇｉｂｃｏ 公司的Ｈａｍ Ｆ１２培养液，杭州四季青生物技术公司 的胎牛血清，重庆麦克光电仪器有限公司的ＸＤＳ．１ Ｂ 倒置相差显微镜，美国ＲＥＶＣＯ公司的ＲＮＷ３０００． ＴＶＢＢ二氧化碳培养箱，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ公司的鼠抗人 ＣＤ４４ｓ单抗，武汉博士德的小鼠抗人Ｂ．ｔｕｂｕｌｉｎ单抗 及ＨＲＰ・羊抗鼠ＩｇＧ，中科院上海生物化学研究所的 低分子量蛋白ｍａｒｋｅｒ，Ａｍｅｒｓｈａｍ公司的Ｈｙｂｏｎｄ． ＥＣＬ硝酸纤维素膜，Ｐｉｅｒｃｅ公司的ＥＣＬ检测系统， Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ＩＬ－１５ ｃＤＮＡ ｉｎ Ｅ ｃｏｌｉ Ｌｕｏ Ｘｉｎ，Ｘｕ Ｃｏｎｇｚｈｅｎ，Ｆａｎｇ Ｍｉｎ， ａｌ （Ｄｅｐｔ ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａｎｈｕｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ ２３００３２） Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｃｌｏｎｅ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｃＤＮＡ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ．１５（ｈＩＬ．１５）ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｔ ｉｎ Ｅ ｃｏｌｉ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ．ｈＩＬ．１５ ｃＤＮＡ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ＲＴ．ＰＣＲ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＥＴ２８ａ（＋）・ｈｉＬｌ５ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｉｎｓｅｒｔｉｎｇ ＩＬ．１５ ｃＤＮＡ ｉｎｔｏ ｐＥＴ２８ａ（＋）ａｎｄ ｔｈｅｎ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｉｎｔｏ Ｂ １（ＤＥ３）．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈＩＬ．１５ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｉ Ｇ ａｔ ３７℃ｆ０ｒ ６ｈ．Ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｗａｓ ａｎａｌｙｚｅｄ ｕｓｉｎｇ ＳＤＳ・ＰＡＧＥ ａｎｄ Ｗｅｓｔｅｒｎ．ｂｌｏｔ．Ｒｅｓｕｌｔｓ ｈＩＬ．１５ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ ｃｏｌｉ ｓＨａｃｅｓｓｆｕｌｌｖ． ＳＤＳ・ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ．１５ ｗａｓ ａｂｏｕｔ １６．１ ｋｕ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｒｈＩＬ．１５ Ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ。ｗｈｉｃｈ ｌａｙｓ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｉｔｓ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． ＭｅＳＨ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ・１５／ｇｅｎｅｔｉｃｓ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ／ｇｅｎｅｔｉｃｓ；ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔ
人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析(精)
人骨肉瘤MG63多药耐药细胞亚系建立及生物学特性分析
[ 10-09-11 16:53:00 ] 编辑：studa20
作者：刘岩 张德宝 杨华
孙大辉
【摘要】 目的 建立阿霉素(DXR)诱导的人成骨肉瘤MG63多药耐药细胞株亚系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100并观察其生物学特性。方法 以DXR为诱导剂，采用逐步增加剂量的方法诱导MG63细胞，建立多药耐药细胞株亚系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100;MTT法检测药物敏感性;光镜、透射电镜观察细胞形态及超微结构变化，绘制细胞生长曲线;流式细胞术检测细胞周期、凋亡指数。结果 (1)经DXR 6个月的诱导建立了MG63/DXR细胞株亚系。(2)MG63/DXR对DXR的耐药指数为 76.87，对长春新碱、氨甲蝶呤、环磷酰胺亦产生不同程度的交叉耐药。(3)光镜观察可见：MG63细胞排列规则，形态呈梭形，大小一致;MG63/DXR细胞株亚系排列不规则，大小不均，形态呈三角形、多角形及多核现象。透射电镜显示：MG63细胞膜平滑，粗面内质网较丰富;MG63/DXR细胞株亚系细胞表面突起增加，粗面内质网丰富，胞质内可见髓样小体、溶酶体及大量糖原池。(4)MG63细胞与其多药耐药细胞株亚系MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞生长曲线相近。(5)细胞周期分析显示MG63、MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100细胞G0/G1期分别为86.34%、83.67%、78.11%、68.81%;G2/M期分别为5.92%、7.45%、7.78%、10.90% ;S期分别为 7.74%、8.87%、14.11%、20.30%;而MG63/DXR与MG63细胞的凋亡指数无显著差异。结论 (1)小剂量DXR为诱导剂建立了人骨肉瘤多药耐药细胞株亚系(MG63/DXR10、MG63/DXR40、MG63/DXR100)，MG63/DXR、MG63/DXR细胞对于甲氨蝶呤、长春新碱、环磷酰胺产生不同程度交叉耐药。(2)MG63/DXR细胞株亚系细胞形态、超微结构、细胞周期分布与母系细胞MG63有显著差异，凋亡指数无显著差异。(3)MG63/DXR耐药细胞的存在及其分裂、增殖可能是导致骨肉瘤化疗失败和肿瘤局部复发的原因之一。
人骨肉瘤耐阿霉素细胞模型的建立及其生物学特性(精)
中国组织工程研究与临床康复 第 15卷 第 37期 2011– 09– 10出版
Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 10, 2011
Vol.15, No.37 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
6913 1Department of Orthopedics, Ninth People’s Hospital of Chongqing,
Chongqing 400700, China; 2Department of Orthopedics,
Second Affiliated Hospital of
Chongqing Medical University,
Chongqing 40010, China
Chen Yu☆ , Doctor, Attending physician, Department of Orthopedics, Ninth
People’s Hospital of Chongqing,
Chongqing 400700, China
chenyu@ Correspondence to: Deng Zhong-liang, Doctor, Professor,
Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,
Chongqing 40010, China
deng7586@
gmail. com
Supported by: the National Natural
Science Foundation of China, No.
30772211*
Received: 2011-06-10 Accepted: 2011-07-30
不同转移潜能MG63骨肉瘤细胞亚株裸鼠肺转移模型的建立
第３７卷第４期第５３２页
２ＯＯ８年８月 华中科技大学学报（医学版）
Ａｃｔａ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ Ｓｃｉ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｈｕａｚｈｏｎｇ ＶｏｌＪ ３７ Ｎｏ．４ Ｐ．５３２
Ａｕｇ． ２００８
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不同转移潜能ＭＧ６ ３骨肉瘤细胞亚株
裸鼠肺转移模型的建
祝文涛 袁 林 郭风劲 许 涛 立＊
陈安民
华中科技大学同济医学院附属同济医院 骨外科 康复科，武汉４３００３０
摘要 目的建立不同转移潜能的骨肉瘤ＭＧ６３细胞亚株裸鼠肺转移模型，为探讨骨肉瘤发生发展机制奠定实验
基础。方法ＭＴＴ法检测不同转移潜能的人骨肉瘤ＭＧ６３细胞亚株Ｍ８、Ｍ６细胞增殖情况，将生长良好的细胞制成２
×１０ ／ｍｌ细胞悬液注射裸鼠尾静脉，第４周起处死裸鼠，肉眼及镜下观察肺部转移灶形成情况，肺组织经过石蜡包埋切
片后行苏木精一伊红染色观察病理变化，并采用免疫组化方法检测肿瘤相关指标Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ１和Ｂｃｌ～２的表达。结果 高转
移潜能细胞Ｍ８组细胞增殖能力强于Ｍ６组。尾静脉注射瘤细胞后，Ｍ８组２Ｏ只裸鼠除２只死亡外，有１７只发生肺转
移；低转移潜能Ｍ６组２Ｏ只裸鼠仅１只发生肺转移。免疫组化结果显示Ｍ８组裸鼠肺组织Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ１和Ｂｃｌ一２表达呈阳
性，而Ｍ６组未见阳性细胞表达。结论采用尾静脉注射人骨肉瘤细胞亚株Ｍ８、Ｍ６可成功建立高、低转移潜能的骨肉
瘤裸鼠肺转移模型，为深入研究骨肉瘤侵袭和转移机制及寻求有效治疗方法提供了实验平台。
关键词骨肉瘤；转移潜能；动物模型
中图法分类号 Ｑ９３９．４７ ＤＯＩ：１０．３８７０／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２—０７４１．２００８．０４．０３３
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｎｕｄｅ Ｍｏｕｓｅ Ｍｏｄｅｌ ｏｆ ＭＧ６３ Ｏｓｔｅｏｓａｒｅｏｍａ Ｃｅｌｌ
Ｓｕｂｌｉｎｅｓ ｗｉｔｈ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
人肺癌不同转移潜能细胞株的建立及其特性分析 荚德水,闫
人肺癌不同转移潜能细胞株的建立及其特性分析
荚德水，闫明霞，刘蕾，王晓敏，孔韩卫，吴一迁，姚明
（上海交通大学肿瘤研究所实验病理研究室，上海200032）
\[摘要\]目的：建立人肺癌不同转移潜能细胞株，并对其转移特性进行初步研究，为肺癌转移机制的研究提
供模型。 方法：采用有限稀释单细胞克隆培养的方法，从已建立的人肺癌高转移细胞株SPC-A-1sci中分
离出的不同单克隆细胞，通过体外损伤愈合、迁移与侵袭实验，体内皮下移植瘤自发性转移实验，比较分
离出的不同细胞株之间以及与亲代高转移细胞株SPC-A-1sci之间运动、迁移、侵袭及转移能力的差异。 结
果：从SPC-A-1sci细胞株中成功分离出3株单克隆细胞（命名为SPC-A-1sci-C5、SPC-A-1sci-F3、
SPC-A-1sci-C2），均具有特异性形态学特征；与亲代高转移细胞株SPC-A-1sci相比，SPC-A-1sci-C5细
胞株的体外侵袭能力明显增强，其他2株细胞的体外侵袭能力则明显降低；3株单克隆细胞在细胞形态和
体外侵袭能力方面存在明显差异，SPC-A-1sci-C5的体外侵袭能力明显高于其他2株细胞。体内皮下移植
瘤自发性转移试验显示，SPC-A-1sci-C5细胞不仅转移发生时间较早，而且肺转移程度（包括转移灶数量
及大小）亦较其他2株细胞增多。结论：成功建立了具有相同遗传背景、不同转移潜能的3株人肺癌细胞，
为肺癌转移的进一步研究提供了理想模型。
原位异种移植性骨肉瘤的动物模型及生物学特性的初步观察
原位异种移植性骨肉瘤的动物模型及生物学特性的初步观察
李艳;向理科;罗娟;王智彪
【期刊名称】《重庆医科大学学报》
【年(卷),期】2006(31)2
【摘 要】目的:建立大鼠UMR106骨肉瘤细胞株的裸鼠原位移植模型。方法:采用完整瘤组织块原位移植到裸鼠右胫骨骺端,分不同时期处死,观察其生长及转移特性。结果:肿瘤原位移植成功率为100%,移植后1￣2w从髓内向髓外生长,3w已侵犯髓外软组织并有明显骨皮质破坏,4￣5w有肺转移,6w左右裸鼠出现恶病质,且双肺广泛转移,最终全身衰竭死亡。结论:该模型成功率高,模拟了人类骨肉瘤临床发病和发展过程,可作为研究骨肉瘤较理想的模型。
【总页数】4页(P137-140)
【关键词】骨肉瘤;裸鼠;原位移植
【作 者】李艳;向理科;罗娟;王智彪
【作者单位】重庆医科大学附属儿童医院病理科;重庆医科大学病理学教研室;浙江省肿瘤医院病理科;重庆医科大学生物医学工程系
【正文语种】中 文
【中图分类】R730.59
【相关文献】
1.人非小细胞肺癌原位动物模型生物学特性研究 [J], 陈艳;王熙才;周永春;伍治平;金从国;刘馨;姚乾;胡红艳;徐珑峰 2.胰腺癌神经转移原位移植瘤动物模型的构建及其生物学特性研究 [J], 孟令新;丁兆军;陈希平;张红;王丰松;迟玉华
3.裸大鼠人肝癌原位模型的建立及其生物学特性的初步观察 [J], 沈艳;彭秀华;徐春华;周文江
4.LJH-OS人骨肉瘤裸鼠原位移植模型的建立及其生物学特性 [J], 师长宏;施新猷;朱德生
5.大鼠原位移植性骨肉瘤模型的建立及生物学特性观察 [J], 李艳;向理科;罗娟;王智彪
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大鼠原位移植性骨肉瘤模型的建立及生物学特性观察
２００６年１１月 第ｌ６卷第１１期 中国比较医学杂志 ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＣＯＭＰＡＲＡＴＩＶＥ ＭＥＤＩＣＩＮＥ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２００６ Ｖ０１．１６ Ｎｏ．１ｌ
大鼠原位移植性骨肉瘤模型的建立
及生物学特性观察
李 艳 ，向理科 ，罗 娟 ，王智彪 、 、 ｅ； 研究报告 （ 、 ＿＇、、 ；＿１、、 ；＿１、 ；；、
（１．重庆医科大学附属儿童医院病理科，重庆４０００１４；２．重庆医科大学病理学教研室，重庆４０００１６；
３．浙江省肿瘤医院病理科，杭州３１００２２；４．重庆医科大学生物医学工程系，重庆４０００１６）
【摘要】 目的 建立大鼠ＵＭＲＩ￣骨肉瘤细胞株的同种异体原位移植模型。方法 采用完整瘤组织块原位移
植到大鼠右胫骨骺端，分不同时期处死，观察其生长及转移特性。同时检测其血清中ＡＬＰ水平的变化。结果 肿
瘤原位移植成功率为９１．６７％，移植后１ ２周肿瘤从髓内向髓外生长，３周骨皮质破坏侵犯软组织但无肺转移，４周
肺部可见少量小转移灶，５周骨皮质破坏更加明显，肺转移灶明显增加，６—７周大鼠双肺广泛转移因呼衰而死亡。
ＡＬＰ水平１ ２周逐渐升高，３周时达最高峰，４ ６周逐渐下降，７周接近一平台期，但仍高于同期正常水平。结论
该模型成功率高，成本低，实用性强，模拟了人类骨肉瘤临床发病和发展过程，可作为研究骨肉瘤较理想的模型。
【关键词】原位移植；骨肉瘤；大鼠
【中图分类号】Ｒ７３０．５９ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１６７１—７８５６（２００６）ｌ１－０６４５．０４
Ｍｏｄｅｌ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｎ Ｒａｔ Ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ Ｕｓｉｎｇ Ｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｎ Ｉｔｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ＬＩ Ｙａｎ ，ＸＩＡＮＧ ｌＪｉ．ｋｅ：，ＬＵＯ Ｊｕａｎ ，ＷＡＮＧ Ｚｈｉ．ｂｉａｏ４
大鼠移植性骨肉瘤模型的建立
大鼠移植性骨肉瘤模型的建立
谈志龙;胡永成;王林森;于顺禄;李兰萍;王瑞琳;卢勇
【期刊名称】《天津医药》
【年(卷),期】2005(33)2
【摘 要】目的:建立大鼠移植性骨肉瘤模型.方法:采用大鼠骨肉瘤细胞系UMR106接种Wistar大鼠后肢股骨远端或胫骨近端的骨髓腔中,成瘤后,进行影像学、病理组织学观察及血清生化检查.结果:本方法致瘤率为86.7%,肺转移率为96.2%.影像学可见骨膜反应,溶骨变化.病理组织学可见骨组织、骨骺板和软骨被肿瘤细胞所侵蚀、破坏,核分裂多见,瘤组织血管丰富,可见坏死、颗粒状钙化、新生类骨质样组织.大鼠血清碱性磷酸酶明显高于对照组(P＜0.01).结论:该方法建立的大鼠骨肉瘤模型,其恶性生物学行为接近临床骨肉瘤患者实际情况,为临床骨肉瘤实施新疗法与基础实验研究提供了良好的动物模型.
【总页数】2页(P96-97)
【作 者】谈志龙;胡永成;王林森;于顺禄;李兰萍;王瑞琳;卢勇
【作者单位】300211,天津医院骨研所;300211,天津医院骨研所;300211,天津医院骨研所;300211,天津医院骨研所;300211,天津医院骨研所;300211,天津医院骨研所;300211,天津医院骨研所
【正文语种】中 文
【中图分类】R738
【相关文献】 1.移植性人骨肉瘤OS-732裸鼠模型的建立 [J], 刘巍峰;郭卫;牛晓辉;袁润英;张清;徐海荣;陈大福
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4.大鼠原位移植性骨肉瘤模型的建立及生物学特性观察 [J], 李艳;向理科;罗娟;王智彪
5.可移植性鼠骨肉瘤肿瘤模型的建立 [J], 潘海涛;杨述华;刘勇;叶树楠
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