利用全基因组测序解析两个肺癌细胞系大规模不同类型的的
利用纳米孔测序技术解析肿瘤基因组结构变异、非整倍性
变异及肿瘤异质性
癌症是一种基因组疾病，除了染色体数目异常变异之外，还存在数千种大规模的缺失、重复和易位等变异。
图1 两个肺癌细胞系的全基因组测序。结果显示每个样本均有不同程度的重复、缺失和易位等变异。
a)H441细胞系b)A549细胞系
利用全基因组测序解析两个肺癌细胞系大规模不同类型的的缺失、重复、易位以及非整倍性变异的基因组图谱
同一患者的肿瘤细胞中经常发现DNA重组，正常细胞中则没有发现。这些重组包括不同类型的结构变异（SV）：拷贝数变异，染色体内及染色体间重组，以及转座子和其他外源序列的插入。很多重组不会直接导致癌症扩散，但是一些关键基因的改变能够促使肿瘤形成。癌症的SV分析可以用于表征特殊肿瘤类型，从而针对性地采用不同地治疗方式。癌症SV通常是复杂的或者大规模的基因重组，并且只能通过能够完整测到整个重组基因的长度长测序来解决。为了研究纳米孔长度长测序在揭示癌症SVs中的应用，我们对两个肺癌细胞系NCI-H441和A549进行了基因组DNA提取，文库制备并在GridIONTM上完成了测序。已知这两种细胞系都有大量的结构变异。NCI-H441和 A549的测序覆盖度分别为19.5X和15X。我们用ngmlr将测序结果与人类基因组序列进行比对，并参考图1制作了覆盖度分析图。覆盖度值与这些样品已公开的核型图非常接近。
图2 对两个细胞系染色体内和染色体间重组的进一步分析
a) A549的Circos图 b) KRAS基因的 SNPs c) H441的 KRAS基因重复 d) H441的Circos图
两个肺癌细胞系均在KRAS信号转导GTP酶基因中发生点突变，此外还有染色体内和染色体间重组
为了检测SV，我们用sniffles进行比对，若5个及以上reads仍不能确定其SVs 类型则排除。我们对每个细胞系作Circos图（图2），可以看到大量的染色体内和染色体间重组。除此之外，已知这两个细胞系都在12号染色体相邻位置的KRAS基因中具有非同义突变。A549在25245351（G12S）处发生C→T碱基转换，H441在25245350（坐标hg38）处发生C→A碱基颠换。这些突变都清晰的展现在测序数据中（图2b）。我们的reads检测到H441的C→A碱基颠换的比例约为2:1，与已经公布的H441细胞系12号染色体是三倍体结果一致。图2d展示了两个细胞系在12号染色体的12p12.1区域1kb区间的标准覆盖度。与A549相比，H441的KRAS基因及其周围区域具有更高的标准覆盖度。通过纳米孔技术测序，我们可以更加清晰地发现数量更多、长度更小的基因组重复。这些结果充分显示了纳米孔长度长测序可用于肿瘤基因组DNA分析，并能够鉴定比核型图分辨率更高的SVs。
人肺癌A549细胞凋亡相关基因的表达及意义
摘要】目的比较耐顺铂的人肺腺癌细胞(A549DDP)凋亡相关基因的表达与亲代A549细胞的差异，探讨细胞凋亡与细胞耐药的发生机制。方法应用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片，检测A549和A549DDP细胞相关凋亡基因表达水平。结果A549DDP细胞表达BAD、BAG3、BFAR、CARD8、CASP6、GADD45、TNFRSF14、CD70、TRADD、TRAF1、TRAF3基因较亲代A549细胞显著增高(P<0.05),二者比值上调2倍以上。结论肺腺癌A549DDP细胞过表达上述凋亡相关基因，可能是导致细胞凋亡受抑、细胞耐药的主要原因。 【关键词】肺癌;凋亡基因;细胞凋亡;耐药 细胞耐药是导致化疗失败的主要原因。研究发现耐药的发生与细胞凋亡基因的异常表达密切相关。采用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片方法检测细胞凋亡相关基因，具有敏感性高、速度快和重复性好等优点。目前尚未见以Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片方法检测A549细胞凋亡相关基因的报道。本文采用Oligo GE Array细胞凋亡基因芯片检测人肺腺癌亲代细胞与耐顺铂细胞(A549和A549DDP)凋亡相关基因,并对检测结果的临床意义进行初步分析，进一步探讨肿瘤细胞凋亡与耐药的发生机制。 1 对象与方法 1.1 对象人肺腺癌亲代A549细胞和耐顺铂的A549DDP细胞(华西医科大学新桥医院呼吸病研究所提供)。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养人肺腺癌A549与A549DDP细胞,以含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5% CO2条件下培养,每2～3 d传代1次,初始密度为2×105/ml(2 ml/6孔板)。取对数生长期细胞进行实验。 1.2.2 凋亡基因检测按着Oligo GEArray基因芯片实验操作步骤进行(Oligo GEArray细胞凋亡基因芯片由上海康成生物科技有限公司提供)。 1.2.3 RNA 抽提Trizol一步法进行细胞总RNA的抽提。 1.2.4 RNA质量检测经变性琼脂糖凝胶电泳及紫外吸收测定法对RNA质量进行检测。 1.2.5 cRNA标记与合成首先合成cDNA，再合成cRNA，并对合成的cRNA进行标记和扩增，进而cRNA 纯化。 1.2.6 芯片杂交、化学发光检测、图象采集和数据分析。 1.3 统计学分析采用χ2检验。 2 结果 对芯片中114个与凋亡相关的基因检测时发现耐顺铂的A549DDP细胞表达凋亡相关基
肿瘤细胞株
Tca8113-P160人舌癌细胞株 TSCCA人舌鳞癌细胞株 CaES-17人食管癌细胞株 Ec109人食管癌细胞株 Hep-2人喉癌细胞株 SPC-A1人肺癌细胞株 A549人肺癌细胞株 GLC-15人肺腺癌细胞株 HAC-84人肺泡癌细胞株 ACC-M人唾液腺性肺癌高转移细胞株NCL-H446人肺癌细胞株 M14人肺癌细胞株 H460人大细胞肺癌细胞株 Calu-6人肺癌细胞系未分化癌细胞株 95-D人高转移肺癌细胞株 95-C人低转移肺癌细胞株 H292人表皮肺癌细胞株 DMS153人小细胞肺癌细胞株 PG49人肺腺癌细胞株 PG-BE1人肺巨细胞癌PG的高转移亚系PG-LH7人肺巨细胞癌PG的低转移亚系A2人肺腺癌细胞株 973人肺腺癌细胞株 LTEP-a-2人肺腺癌细胞株 Z-HL16C人胚肺成纤维细胞突变癌细胞株HS-746T人胃癌细胞株 AGS人胃腺癌细胞株 Hs746T人胃癌细胞株 MGC-803人胃腺癌细胞株 SGC7901人胃癌细胞株 BSG823人胃癌细胞株 T-24人移行细胞膀胱癌细胞株 BIU-87膀胱癌细胞株 HT-1376人膀胱癌细胞株 MG-63人成骨肉瘤细胞株 Saos-2人生骨肉瘤细胞株 HOS人骨肉瘤细胞株 U-2OS人骨肉瘤细胞株 OS-732人骨肉瘤细胞株 RPMI-8226人多发骨髓瘤 A-204人横纹肌肉瘤细胞株 HT1080人纤维肉瘤细胞株 HT-1080人纤维肉瘤细胞株 U251星形胶质瘤细胞株
DaudiBurkitts淋巴瘤细胞株 CA46Burkitts淋巴瘤细胞株 ACHN人肾癌细胞株 769-P人肾癌细胞株 A498人肾癌细胞株 786-O人肾透明细胞腺癌细胞株 SW13人肾上腺皮质瘤细胞株 Ketr-3人肾癌瘤株细胞株 RCC-krause人肾癌细胞株 SK-RC-42人肾癌细胞株 H4人脑神经胶质瘤细胞株 BT-325人脑多形性胶质母细胞瘤细胞株SGH44人脑胶质细胞瘤细胞株 TJ905人脑恶性胶质瘤细胞株 U-373MG人脑胶质瘤细胞株 SF126人脑瘤细胞株 SF17人脑瘤细胞株 SF763人脑瘤细胞株 SF767人脑瘤细胞株 SH-SY5Y人成神经细胞瘤细胞株 M17人神经母细胞瘤细胞株 LAN-5人神经母细胞瘤细胞株 SK-N-SH人神经母细胞瘤细胞株 LAN-6人神经母细胞瘤细胞株 SK-N-DZ人成神经瘤细胞-骨髓 PC-3人前列腺癌细胞株 DU145人前列腺癌细胞株 LNCaP人前列腺癌细胞株LNCaPCloneFGC人前列腺癌细胞株 Tsu-Prl人非雄激素依赖型前列腺癌细胞株22RV1人前列腺癌细胞株 PC-3M1E8人前列腺癌细胞高转移亚系PC-3M2B4人前列腺癌细胞低转移亚系SW1990人胰腺腺癌细胞株 PANC-1人胰腺腺癌细胞株 PL45人胰腺导管腺癌细胞株 HPAC人胰腺癌细胞株 Panc03.27人胰腺癌细胞株 Panc08.13人胰腺癌细胞株 Panc10.05人胰腺癌细胞株 Panc05.04人胰腺癌细胞株 Panc02.03人胰腺癌细胞株 F56人腺癌细胞株 ACC-2人诞腺腺样囊性癌细胞株
非小细胞肺癌免疫治疗进展
中国肺癌杂志2014年3月第17卷第3期 Chin J Lung Cancer, March 2014, Vol.17, No.3 ·综述· 非小细胞肺癌免疫治疗进展 何圆 尤长宣 【摘要】 肺癌是全球范围内癌性死亡的首要因素，发病率、死亡率高，预后较差，急需开发一种新的高效低毒疗法。作为术后辅助或是姑息治疗手段，免疫治疗为非小细胞肺癌患者提供了一个新的治疗方向。免疫疗法作用机理各不相同，如免疫检测点受体抑制剂（抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体）、主动性免疫疫苗（L-BLP25脂质体疫苗、Belagenpumatucel-L 疫苗、MAGE-A3蛋白疫苗）、过继性免疫疫苗（CIK 细胞）等，研究表明免疫治疗非小细胞肺癌肿瘤缓解率较前提高，前景值得期待，II 期/III 期临床试验亦在进一步探索其临床应用价值。本文就当前非小细胞肺癌免疫疗法原理、临床试验、不良反应及待解决问题作一概述。 【关键词】 肺肿瘤；免疫治疗；进展 Advances in Immunotherapies for Non-small Cell Lung Cancer Yuan HE 1 , Changxuan YOU 2 1 Graduate Student of Southern Medical University, Guangzhou 510515, China; 2Department of Oncology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China Corresponding author: Changxuan YOU, E-mail: ycx6026@https://www.360docs.net/doc/de6058916.html, 【Abstract 】 Globally, Lung cancer is the leading cause of cancer-related death of high morbidity and mortality with poor prognosis, which needs some more effective and less toxic therapies. The immunotherapies offer a novel approach for the treatment of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) in both the adjuvant and palliative disease settings. A number of promising immunotherapies based on different mechanism have now been evaluated showing an increasing response rate. Moreover, further phase II/III clinical trials will be indicated to explore its value. These include checkpoint inhibitors (anti-CT-LA4 antibody, anti-PD-1 antibody, anti-PD-L1 antibody), active vaccination (L-BLP25 liposome vaccine, Belagenpumatucel-L vaccine, MAGE-A3 protein vaccine) and adoptive vaccination (CIK cells). The purpose of this paper will draw a summary on the theory, clinical trials, toxicity and problems to be solved of the immunotherapies in NSCLC. 【Key words 】 Lung neoplasms; Immunotherapies; Progress This study was supported by the grants from National Natural Science Foundation of China (No.81071847), Guangdong Natural Science Foundation (No.S2011010003881), Guangdong Provincial Science and Technology Project (No.2012B031800394), Wu Jieping Medical Foundation Funded Special Clinical Research Projects (No.320.6799.1118)(all to Changxuan YOU). DOI: 10.3779/j.issn.1009-3419.2014.03.17 本研究受国家自然科学基金项目（N o.81071847）、广东省自然科学基金项目（No.S 2011010003881）、广东省科技项目（No.2012B031800394）和吴阶平医学基金会临床科研专项资助项目（No.320.6799.1118）资助 作者单位：510515 广州，南方医科大学2013级研究生（何圆）；510515 广州，南方医科大学南方医院肿瘤科（尤长宣）（通讯作者：尤长宣，E-mail: ycx6026@https://www.360docs.net/doc/de6058916.html, ） 肺癌是全球范围内首个癌症相关性死亡因素，非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC ）约占肺癌总数80%-85%，吸烟、环境污染（厨房油烟、煤炭燃烧、汽车尾气）等构成肺癌发病的主要原因。早期接受治疗NSCLC 患者超过40%会出现肿瘤复发，因此晚期 NSCLC 患者5年生存率不到15%，预后较差[1]。以铂类为基础的标准化疗方案治疗NSCLC ，患者肿瘤缓解率仅为20%-35% ，中位生存期（median overall survival, mOS ）为10个月-12个月，分子靶向治疗与化疗方案相比，可延长NSCLC 患者无疾病生存期（progression-free survival, PFS ），但患者mOS 未获益[2]。因此标准治疗或因严重不良反应（恶心、呕吐、骨髓毒性等）或因经济学毒性（分子靶向药物价格较昂贵）已使其处于治疗瓶颈水平，急需开发一种新的NSCLC 疗法。目前免疫治疗NSCLC 在I 期/II 期临床试验中结果良好：肿瘤缓解率提高、毒副作用小、患者易耐受，这将为NSCLC 治疗开发新领域。
晚期非小细胞肺癌的靶向治疗(综
晚期非小细胞肺癌的靶向治疗(综述)题库
晚期非小细胞肺癌的靶向治疗（综述） 2015-03-10 来源：丁香园作者：张波 曾几何时，晚期非小细胞肺癌（NSCLC）患者只能接受化疗。但是，其疗效已经到了一个瓶颈期，无法再进一步。可喜的是，随着人们对分子遗传学认识的不断增强，NSCLC 被细分为各种不同的分子亚型，并由此诞生了各类分子靶向治疗药物。靶向药的应用，明显改善 了 NSCLC 患者的预后。 带有表皮生长因子受体（EGFR）突变和间变性淋巴瘤激酶（ALK）重排的肿瘤患者的一线治疗中，化疗并没有一席之地，除非该患者的“可药化驱动基因（druggable driver oncogene）”缺失。2015 年 2 月17 日Kumarakulasinghe 等在respirology 上发布综述，全面讨论临床相关的驱动基因突变的情
况、肺腺癌和鳞癌的最新分子分型、分子靶向药物在治疗中的地位及其耐药机制。 肺癌是肿瘤世界的头号杀手。在 2014 年，预计将有 224210 名新确诊的肺癌患者，而且其中大部分为晚期NSCLC。在很长一段时间里，人类面对晚期 NSCLC 只能使用“含铂类药物 的化疗”这一招。这招与最佳支持治疗相比，虽然一定程度上增加了患者总生存期（OS），但它的上限也仅限于 20% 的反应率和 8-10 个月的中位生存期。 随着分子遗传学研究的不断进展，人们慢慢尝试识别导致 NSCLC 的关键基因突变。这些存在于癌基因上的遗传变异能编码调控细胞增殖 和存活的信号蛋白。癌基因依赖这个概念应运而生，而它存在的基础，是“肿瘤的生存非常依赖
非小细胞肺癌免疫治疗研究进展
Medical Diagnosis 医学诊断, 2016, 6(1), 15-20 Published Online March 2016 in Hans. https://www.360docs.net/doc/de6058916.html,/journal/md https://www.360docs.net/doc/de6058916.html,/10.12677/md.2016.61004 Advances in Immune Therapy for Non Small Cell Lung Cancer Xinhui Jiang1, Weizhen Shou2 1Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Baoshan Branch, Shanghai 2Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Chinese Medicine, Shanghai Received: Feb. 24th, 2016; accepted: Mar. 15th, 2016; published: Mar. 18th, 2016 Copyright ? 2016 by authors and Hans Publishers Inc. This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY). https://www.360docs.net/doc/de6058916.html,/licenses/by/4.0/ Abstract At present, lung cancer has become the leading cause of death in various types of cancer, the inci-dence and mortality rate is rising. In recent years, although non small cell lung cancer patients survival rate prolongs the combination therapy with chemotherapy, patients and the overall 5- year survival rate is very low, and due to the additional damage of radiotherapy and chemothera-py, the patient’s quality of life and the actual survival rate did not significantly change. In recent years, with the further development and improvement of tumor immunology and molecular biol-ogy, immune therapy of lung cancer has been widely concerned, and provides a new direction for the treatment of non-small cell lung cancer patients. This review summarizes the current research progress in the treatment of non small cell lung cancer. Keywords Non Small Cell Lung Cancer, Immunotherapy, Progress 非小细胞肺癌免疫治疗研究进展 江鑫辉1，寿伟臻2 1上海中医药大学附属曙光医院宝山分院，上海 2上海中医药大学附属龙华医院，上海
热疗对人肺癌细胞凋亡的影响
·论著· 热疗对人肺癌细胞凋亡的影响 蒋东 李芳 葛锦峰 郑世营 【摘要】 目的 探讨热疗对人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞生长与凋亡的影响。方法 ＭＴＴ法检测热疗对人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞生长的抑制作用；流式细胞术观察热疗对人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞周期和凋亡的影响；ＲＴ－ＰＣＲ检测凋亡相关基因ｐ５３及Ｃａｓｅｐａｓｅ－３的表达。结果 热疗对人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９两种细胞的生长均有抑制作用。热疗可以明显改变人肺癌Ａ５４９细胞生长周期的分 布，Ｇ０／Ｇ１期细胞明显减少；但对人肺癌Ｈ１２９９细胞生长周期的分布影响不大。热疗能使Ａ５４９细胞ｐ ５３蛋白的表达明显增强，但不能诱导Ｈ１２９９细胞ｐ５３蛋白的表达。热疗能同时诱导Ａ５４９、Ｈ１２９９两种细胞Ｃａｓｐａｓｅ－３蛋白表达的增强，并且以Ａ５４９细胞的表达尤为明显。结论 热疗对两种肺癌细胞的生长均有抑制作用，可以增加细胞凋亡。ｐ５３基因可能在热疗诱导肺癌细胞凋亡和周期分布改变的过程中起主导作用。 【关键词】 热疗；肺癌细胞；ｐ ５３基因；凋亡【中图分类号】 Ｒ７３４ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 ０２５３－３６８５（２０１２）１５－１７３７－０３Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ＪＩＡＮＧ Ｄｏｎｇ，ＬＩ Ｆａｎｇ，ＧＥ Ｊｉｎｆｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｕｒｇｕｒｙ，Ｆｉｒｓｔ Ａｆｆｉｌｉａｔｅｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｏｏｃｈｏｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｓｕｚｈｏｕ２１５００６，ＣＨＩＮＡ【Ａｂｓｔｒａｃｔ】 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ，ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆｈｕｍａｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ａ５４９ａｎｄ Ｈ１２９９．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｎＡ５４９ａｎｄ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＭＴＴ，ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｏｆ Ａ５４９ａｎｄ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＦＡＣＳ，ａｎｄ ＲＴ－ＰＣＴ ｗａｓ ａｄｏｐｔｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ ｏｆ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓｏｆ ｐ５３ａｎｄ Ｃａｓｐａｓｅ－３．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ａ５４９ａｎｄ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｏｆ Ａ５４９ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｃｈａｎｇｅｄ ｂｙ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｉｎ Ｇ０／Ｇ１ｐ ｈａｓｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｏｆ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｎｏｔ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ｉｎ Ａ５４９ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｗｈｉｃｈ ｉｎ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓ ｗａｓ ｎｏｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｃａｓｐａｓｅ－３ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ Ａ５４９ａｎｄ Ｈ１２９９ｃｅｌｌｓ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｉｎ Ａ５４９ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｈａｓｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｃｉｒｃｌｅ ａｎｄ ｃａｎ ｉｎｄｕｃｅ ｔｈｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，ｉｎｗｈｉｃｈ ｐ５３ｇｅｎｅ ｍａｙ ｔａｋｅ ａ ｒｏｌｅ．【Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ】 Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｉａ；Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ；ｐ５３ｇｅｎｅ；Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ａｕｇ ｕｓｔ ２０１２，３８（１５）：１７３７－１７３９．］ 基金项目： 江苏省社会发展重大课题资助项目（ＢＳ２００５０４７）作者单位：２１５００６ 江苏省，苏州大学附属第一医院心胸外科（蒋东、葛锦峰、郑世营）；苏州大学基础医学与生命科学学院人体解剖与组织胚胎系（李芳） 通讯作者：郑世营 Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｙｚｈｅｎｇ８８＠ｖｉｐ ．ｓｉｎａ．ｃｏｍ 近年来肿瘤热疗已成为继手术、 化疗、放疗、生物治疗之后的对肿瘤的第五类有效治疗手段。肺癌目前的发病率和死亡率在我国男性中较高，约６５％的肺癌患者确诊时已属晚期，失去手术机会，因而包括热疗在内的综合治疗在晚期肺癌的治疗中占有重要的地位。本研究以我们培养的Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞为实验对象，主要观察不同温度加热处理对ｐ５３表达情况不同的两种肺癌细胞生长、细胞周期和凋亡的影响，探讨热疗促肺癌细胞凋亡的机制。 材料与方法 一、材料 人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞株由苏州大学分子生物实验室提供。ＲＰＭＩ１６４０培养基（Ｇｉｂｃｏ），小牛血清（杭州四季青），逆转录试剂盒、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（立陶宛Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司），引物由南京金思特科技有限公司合成。 二、方法 １．细胞培养 人肺癌Ａ５４９、Ｈ１２９９细胞常规在含１０％小牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液中，３７．０℃、５％ＣＯ２培养箱中培养，待细胞生长汇合达８５％时，用０．２５％胰酶消化， 按１∶３传代。实验时选取对数生长期细胞。 · ７３７１·江苏医药２０１２年８月第３８卷第１５期 Ｊｉａｎｇｓｕ Ｍｅｄ Ｊ，Ａｕｇｕｓｔ ２０１２，Ｖｏｌ ３８，Ｎｏ．１５
细胞凋亡在癌症治疗中的应用
细胞凋亡在癌症治疗中的应用 班级：08制药工程2班学号：20086868 姓名：王本竹 关键词：细胞凋亡肿瘤癌症抗癌药物抗药性 摘要生物体内各种组织细胞通过增殖与凋亡来维持数量的平衡。一旦这种平衡被打破就会导致一些疾病的产生，如癌症。细胞凋亡与癌症之间的关系为癌症的治疗提供了新思路。抗癌药物的研究经历了一个漫长的发展过程，尽管已对许多抗肿瘤药物的细胞目标有了一定了解，但对于药物与肿瘤作用后如何导致细胞死亡的确切机制尚不清楚。近年来的研究发现细胞凋亡是各种抗癌药物引发细胞死亡的主要方式，从而使得细胞凋亡与癌症之间的关系及细胞凋亡在癌症治疗中的作用成为抗肿瘤研究的新焦点。 1细胞凋亡 细胞死亡一般有两种方式，即细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死通常发生在一群接触的细胞中，是由各种非生理因素，如局部缺血等引起的难以控制的一种破坏现象。它通过干扰细胞能量代谢，引起细胞渗透压不平衡，细胞质肿胀，最终由溶酶体酶导致细胞结构的不可逆性破坏并诱发局部的炎症反应。 细胞凋亡这一概念是1972年由Kerr和Wyllie等提出的。它是一种主动的、固有的程序化现象，故又称程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD)。许多生理性、非生理性的因素都可以引起细胞凋亡，如射线、高温、毒素及各种抗癌药物等。而坏死实质上是由于细胞周围环境产生严重的损伤性变化所诱发的，所以这两种过程在发生机制、形态学和生物化学等诸方面都不相同。凋亡的细胞由于失去细胞间相互联系而与邻近细胞分离，随后细胞表面释放出信号分子被吞噬细胞识别，因此凋亡不损伤周围的细胞。凋亡一般伴有明显的形态学特征，以细胞核的变化为主，表现为核浓缩、细胞浆中细胞器密集、胞膜突出、体积缩小、DNA断裂及形成凋亡小体。 在生物体的每种细胞中，细胞数量的控制都是通过增殖与死亡之间的平衡来完成的，细胞增殖是受到高度调控的。但是直至最近人们才认识到细胞死亡的调控与细胞增殖的调控一样复杂，而且多细胞组织中不同细胞似乎都是通过活化一种内部编程的自杀程序而导致凋亡的（1）。尽管不同的细胞之间有共同的死亡机制，但各种细胞发生凋亡的诱导信号各不相同。各种不同细胞甚至同一细胞不同阶段对凋亡诱导的难易程度、速度也各不相同，如静止期的T细胞在X光照射后迅速凋亡，而活化后的T细胞则不同，与胸腺中蛋白质紧密结合的未成熟T 细胞株对凋亡更为敏感（2）。 是什么导致了这些不同?越来越多的工作表明对凋亡的敏感性主要由Bcl-2、p53两种基因调控。p53基因位于17号染色体短臂上，长14～24 kb，编码一个由393个氨基酸组成的53 kD的蛋白质。p 53蛋白是细胞周期的“分子警察”，也是在DNA损伤后诱导凋亡的因子。p 53蛋白通过上调p 21蛋白来介导细胞周期停滞，p 21蛋白是各种细胞周期蛋白、CDK5(细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶)及细胞周期蛋白-CDK5复合物的抑制剂，细胞周期停滞可以为DNA修复赢得时间，另一方面，如果细胞内损伤已无法修复，则p 53蛋白促进细胞凋亡。Bcl-2基因发现于人类滤泡性淋巴瘤的14、18位染色体转换点，它可以阻断细胞的凋亡而不影响细胞增殖。它是Bcl-2家族中的一员，该家族中一些成员促进凋亡，
肺癌组织凋亡相关基因的表达意义(一)
肺癌组织凋亡相关基因的表达意义(一) 作者：王述民，马颖艳，程庆书 【关键词】肺肿瘤；癌基因；TUNEL；免疫组织化学；基因表达 【Abstract】AIM:TodiscusstheexpressionsoftheapoptosisrelatedoncogenesFas,Bcl2,Baxandp53inlungcancertis suesandtheirsignificance,inordertoprovidethetheoreticalbasisforthemolecularbiologicalstudy.ME THODS：Theexpressionsofp53,Bcl2,BaxandFasproteinsin57casesoflungcancerweredetectedbytheimmuno histochemicaltechniqueandTUNEL.RESULTS：TheexpressionratesofBcl2,p53,Bax,Fasproteinsinlungcancertissueswere33%,69%,70%and28%,res pectively,andtheexpressionrateofeachapoptosisrelatedoncogenewasdifferentinlungcancertissues ofthedifferentpathologictypes.Therewasnodefiniterelationshipbetweenthelymphnodemetastasis andtheapoptosisrelatedoncogenes （P0.05）.Withtherisingofthepathologicstagingofthetumor,theexpressionsofp53andFasproteinsi ncreased,whiletheexpressionofBcl2decreased.Thereseemedtobenodefiniterelationshipbetweent heexpressionofBaxproteinandthepathologicalstaging（P0.05）.CONCLUSION：Therearetheapoptosisrelatedoncogeneexpressionsinlungcancertissues,andtheirexpressiondegree isrelatedwiththeirpathologicaltypes.Theoverexpressionsofp53andFasproteinsmaybeassociatedwit hthebadprognosisoflungcancer. 【Keywords】lungneoplasms;oncogenes;TUNEL;immunohistochemistry;geneexpression 【摘要】目的：探讨肺癌组织中凋亡相关基因Fas，Bax，p53，Bcl2蛋白的表达意义，为进行肺癌的分子生物学研究提供理论依据.方法：应用原位末端DNA片段标记法（TUNEL），结合免疫组化技术对57例肺癌切除标本进行Fas，Bax，p53及Bcl2蛋白检测.结果：在肺癌组织中凋亡相关基因阳性率分别为：Fas28%，Bax70%，p5369%，Bcl233%，各基因在肺癌不同病理类型中表达率亦不同，且肺癌的淋巴结转移与调亡相关基因表达无明显关系（P0.05）.其中，p53，Fas随肺癌病理分期的升高而增加，Bcl2则随病理分期的升高而减少，而Bax 则与病理分期无明显关系(P0.05).结论：肺癌组织有调亡相关基因表达，其表达程度与肺癌的病理类型有关，p53,Fas表达可能与不良预后有关. 【关键词】肺肿瘤；癌基因；TUNEL；免疫组织化学；基因表达 肺癌的发病率逐年升高，从分子水平进一步阐明肺癌的发生和发展，对其防治具有一定的意义.Fas，Bax，p53及Bcl2均为凋亡相关基因，在肺癌组织中的表达情况报道尚少.我们应用原位末端DNA片段标记法（TUNEL），结合免疫组化技术，检测了57例肺癌石蜡包埋组织中Fas，Bax，p53，Bcl2蛋白的表达情况，探讨其彼此之间的关系及其与临床分期、预后的关系，为进一步进行肺癌的凋亡研究提供理论依据. 1材料和方法 1.1材料第四军医大学唐都医院胸外科手术切除标本57（男43，女14）例，年龄36~73（53.4±1.8）岁.其中小细胞肺癌14例，腺癌21例（低分化腺癌11例，高分化腺癌10例），鳞癌22例（低分化鳞癌10例，高分化鳞癌12例）.根据手术病理诊断按国际抗癌联盟分期：Ⅰ期5例，Ⅱ期13例，Ⅲa期17例，Ⅳb期12例，Ⅴ期10例.SABC试剂盒购自广州华美公司，兔抗Fas多克隆抗体，鼠抗Bcl2mAb，兔抗Bax多克隆抗体及p53mAb均购自Doka公司，TUNEL试剂盒购自Sigma公司.常规100g/L甲醛固定，石蜡包埋，选取典型病变蜡块作为研究对象.肺癌组织学类型按WHO标准分类〔1〕. 1.2方法Fas，Bcl2，Bax，p53蛋白的表达均采用肺癌组织石蜡切片免疫组化染色SABC法〔2〕.TUNEL染色按试剂盒说明操作.光镜下从染色强度和阳性细胞比例两方面评价染色结果.
非小细胞肺癌治疗新靶点及其靶向治疗研究进展
非小细胞肺癌治疗新靶点及其靶向治疗研究进展 CSCO教育文集2014-09-13 发表评论分享 作者：周彩存李嘉瑜同济大学附属上海市肺科医院 肺癌是患病率和死亡率均较高的恶性肿瘤之一，主要由NSCLC(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小细胞肺癌（small cell lung cancer, SCLC）组成，其中NSCLC占到肺癌80％以上。在过去的几十年里，随着基因测序技术的不断发展和肿瘤相关信号通路研究的不断深入，越来越多的NSCLC已经被证实在分子水平存在驱动基因突变，从而导致肿瘤的发生,包括AKTI, ALK, BRAF, EGFR, HER2, KRAS, MEK1, MET, NRAS, PIK3CA, RET, ROS1等。这些驱动基因突变会激活相关信号蛋白从而导致肿瘤的发生发展。这种驱动基因突变几乎可以在所有组织学类型的NSCLC中找到（包括腺痛、鳞癌、大细胞癌），但很少同时发生于同一肿瘤。不吸烟腺癌患者发生EGFR, HER2, ALK, RET和ROS1突变的概率相对较高。 根据大量临床试验及NCCN指南推荐：Cefitnib、Erlotinib和Afatinib等表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGFR）的酪氨酸激酶抑制剂（Tyrosine kinase inhibitors, TKI）作为EGFR突变NSCLC患者的一线治疗，Crizotinib作为ALK重排患者的一线治疗已毋庸质疑。更为重要的是，很多针对其他少见基因突变的小分子靶向药物已被研发进入临床或临床前研究，这对于一部分肺癌患者来说无疑是令人鼓舞的消息。 尽管近几年来针对肺腺癌的驱动基因的探索及相应靶向药物的研发和临床应用研究进展很大，但对于肺鳞癌的驱动基因，我们知道得少之又少。肺腺癌的驱动基因如EGFR, ALK, ROS1, RET等，很少或者还未在鳞癌中检测到，针对这些靶点的药物因而也无法应用于鳞癌患者，而鳞癌却在NSCLC中占25％左右。为了能找到肺鳞癌更好的治疗策略，研究者们一直没有放弃对肺鳞癌驰动基因的探索和验证：随着测序技术的发展，近期研究发现肺鳞癌中存在着与肺腺癌不同的驱动基因，这些基因包括FGFRI, DDR2和PIK3CA等。本文将对除EGFR和ALK以外较少见的NSCLC驱动基因，携带这些驱动基因患者的临床特征及其可能的靶向治疗研究进展作一综述。 一、肺腺癌的驱动基因 EGFR突变是NSCLC最常见的驱动基因，约10%的高加索NSCLC患者和30-40％的东亚NSCLC的患者存在EGFR突变，EGFR突变在不吸烟腺癌患者中发生率较高。大量临床研究已经证实以EGFR-TKI一线治疗EGFR突变的晚期NSCLC患者的疗效优于化
肺癌组织和肿瘤细胞系中BRG1的表达分析
肺癌组织和肿瘤细胞系中ＢＲＧ1的表达分析 摘要：BRGJ(brahma-related gene 1)是进化上高度保守的SWI／SNF染色质重塑复合物的成员之一，研究表明：BRGI具有抑瘤基因的特征，可能与肿瘤的发生发展有关,我们采用RT—PCR、NortherR杂交和Westemblotting证实：肺腺癌细胞系A549和鼻咽癌细胞系HNE2、HNE3、CNE1中无BRG1的表达，而肺鳞癌细胞系NCI—H520、永生化正常人支气管上皮细胞系HBE和鼻咽癌细胞系HONE1、HNE1、CNE2中有BRGJ的表达，同时，通过RT—PCR检测10例肺癌组织标本，发现60％(6/10)的肺癌组织中日BRG1的mRNA水平明显下调，而配对正常肺组织中BRG1，的mRNA表达未见改变,对29例肺癌组织和10例配对正常肺组织切片进行免疫组化染色，结果显示：肺癌组织中BRG1蛋白表达的阳性率为37.9％(11/29)，配对正常肺组织中BRG1蛋白表达的阳性率为90％(9/10)，两者的差异有显著性(P＜0.05)，这提示BRG1确实在肺癌组织及多种肿瘤细胞系中表达下调或缺失，在肺癌发病过程中可能起一定的作用。 关键词：BRG1；表达；肺癌；肿瘤细胞系 肺癌是目前全球发病率最高的恶性肿瘤，严重威胁人类的健康和生命,近年来我国肺癌的发病率和死亡率迅速上升，有人预计中国将成为21世纪的肺癌大国，肺癌一般分为4种主要的组织学类型：鳞癌、腺癌、大细胞癌和小细胞癌，前三者统称为非小细胞肺癌(NSCLC)，约占肺癌总数的75％，后者称小细胞肺癌(SCLC)，约占25％，肺癌的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程，其中瘤基因和抑瘤基因发挥着至关重要的作用，已有研究显示，肺癌在临床前期就有大约10个分子事件，包括瘤基因myc、K-ras、EGFR、Her-2/neu、Bcl-2的激活与抑瘤基因p53、Rb、FHIT、p16的失活等，但这些基因在多种肿瘤中都普遍存在改变，还不足以完全解释肺癌发生发展的机制，因此有必要继续寻找和鉴定新的肺癌相关基因。 Girard等利用399个微卫星标记对肺癌细胞系及组织标本进行全基因组等位基因分析(allelotyping)，发现NSCLC中19p13区域存在高频率的杂合性丢失(LOH)，已知定位于19p13.3的抑瘤基因LKB1/STK11，在约30％-50％有19p LOH 的肺腺癌中失活，但定位于该区域的其他基因仍可能是肺癌的候选抑瘤基因，因为LKB1/STK11的突变目前只发现于肺腺癌中，而占NSCLC大多数的鳞癌中并未检测到LKB1/STK11的突变。 BRGl是1993年Khavari等利用果蝇的Brm(Brahma)DNA片段为探针，筛选Hela细胞cDNA文库而分离得到的一个人类基因，属于进化上高度保守的SWI/SNF染色质重塑复合物的成员之一，它由35个外显子和34个内含子组成，其转录本的大小约为5kh.BRG1蛋白由1613个氨基酸组成，共有4个结构域：I 脯氨酸富集区、Ⅱ电荷富集区、Ⅲ依赖DNA的ATP酶区、IV溴化区，其相对分子质量为205kD，是一种磷酸化核蛋白，主要以ATP依赖的方式通过破坏组氨酸一DNA的接触而调节基因的表达，通过放射杂交图谱分析，已将BRGl定位于19p13，
利用全基因组测序解析两个肺癌细胞系大规模不同类型的的
利用纳米孔测序技术解析肿瘤基因组结构变异、非整倍性 变异及肿瘤异质性 癌症是一种基因组疾病，除了染色体数目异常变异之外，还存在数千种大规模的缺失、重复和易位等变异。 图1 两个肺癌细胞系的全基因组测序。结果显示每个样本均有不同程度的重复、缺失和易位等变异。 a)H441细胞系b)A549细胞系 利用全基因组测序解析两个肺癌细胞系大规模不同类型的的缺失、重复、易位以及非整倍性变异的基因组图谱 同一患者的肿瘤细胞中经常发现DNA重组，正常细胞中则没有发现。这些重组包括不同类型的结构变异（SV）：拷贝数变异，染色体内及染色体间重组，以及转座子和其他外源序列的插入。很多重组不会直接导致癌症扩散，但是一些关键基因的改变能够促使肿瘤形成。癌症的SV分析可以用于表征特殊肿瘤类型，从而针对性地采用不同地治疗方式。癌症SV通常是复杂的或者大规模的基因重组，并且只能通过能够完整测到整个重组基因的长度长测序来解决。为了研究纳米孔长度长测序在揭示癌症SVs中的应用，我们对两个肺癌细胞系NCI-H441和A549进行了基因组DNA提取，文库制备并在GridIONTM上完成了测序。已知这两种细胞系都有大量的结构变异。NCI-H441和 A549的测序覆盖度分别为19.5X和15X。我们用ngmlr将测序结果与人类基因组序列进行比对，并参考图1制作了覆盖度分析图。覆盖度值与这些样品已公开的核型图非常接近。
图2 对两个细胞系染色体内和染色体间重组的进一步分析 a) A549的Circos图 b) KRAS基因的 SNPs c) H441的 KRAS基因重复 d) H441的Circos图 两个肺癌细胞系均在KRAS信号转导GTP酶基因中发生点突变，此外还有染色体内和染色体间重组 为了检测SV，我们用sniffles进行比对，若5个及以上reads仍不能确定其SVs 类型则排除。我们对每个细胞系作Circos图（图2），可以看到大量的染色体内和染色体间重组。除此之外，已知这两个细胞系都在12号染色体相邻位置的KRAS基因中具有非同义突变。A549在25245351（G12S）处发生C→T碱基转换，H441在25245350（坐标hg38）处发生C→A碱基颠换。这些突变都清晰的展现在测序数据中（图2b）。我们的reads检测到H441的C→A碱基颠换的比例约为2:1，与已经公布的H441细胞系12号染色体是三倍体结果一致。图2d展示了两个细胞系在12号染色体的12p12.1区域1kb区间的标准覆盖度。与A549相比，H441的KRAS基因及其周围区域具有更高的标准覆盖度。通过纳米孔技术测序，我们可以更加清晰地发现数量更多、长度更小的基因组重复。这些结果充分显示了纳米孔长度长测序可用于肿瘤基因组DNA分析，并能够鉴定比核型图分辨率更高的SVs。
非小细胞肺癌几种常见基因突变类型的治疗简述
非小细胞肺癌几种常见基因突变类型的治疗简述 在我国肺癌病死率已居肿瘤死亡率首位，其中非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌的80%以上，且多数患者确诊时已属晚期，因此内科治疗仍是肺癌的主要治疗方法。但近十年来以化疗为主的治疗手段并未使非小细胞肺癌的疗效获得突 破性进展。20世纪90年代以来，关于肺癌的分子靶向治疗研究不断深入，其中 以表皮生长因子受体（EGFR）和血管内皮生长因子（VEGF）作为靶点的药物为主，部分药物已经在晚期NSCLC治疗中显示出较好的临床疗效。21世纪分子靶向治疗已取得了飞跃的进展，许多新的靶向性治疗研究为NSCLC治疗提供新的治疗途径，如RAS抑制剂、ALK抑制剂等。下面就几种常见的基因突变来进行简单介绍： 1、EGFR突变：吉非替尼(Gefitinib，Iressa)和厄洛替尼(Erlotinib，Tarceva)是目前最常用的EGFR-TKI，是专门针对表皮细胞生长因子受体(EGFR) 的小分子化合物。由于分子靶向治疗药物和化疗药物是作用机制截然不同的药物，前者的治疗效果不受患者以前是否曾使用过化疗药物的影响。因此，在治 疗非小细胞肺癌中，分子靶向治疗药物常被作为二线、三线甚至是四线药物使用。而化疗药物在二线使用时疗效往往已经下降。例如，最常使用的化疗药物 泰索帝或培美曲赛(Alimta)，其二线治疗的有效率只有9%。需要注意的是，在 肿瘤出现KRAS基因突变的情况下，EGFR-TKI是不适用的，很多研究证明了EGFR-TKI治疗KRAS突变是无效的。 2、VEGF突变：贝伐单抗是首个进入临床的抑制血管生成的药物。它所针对的是血管内皮生长因子(VEGF)，它通过与VEGF结合，阻止和减弱VEGF与血管内 皮细胞表面受体的结合，从而抑制内皮细胞增殖和新生血管生成，进而起到抗 肿瘤作用。 3、ALK突变：ALK具有代表性的抑制剂为克唑替尼，用于治疗EML4-ALK融合基因阳性的非小细胞肺癌。EML4-ALK阳性者中，年轻患者、男性患者比例较高，不吸烟或轻度吸烟患者较多，绝大多数组织学检查结果为腺癌，且大部分为印 戒细胞亚型。当然，ALK抑制剂也存在一些不足，例如EML4-ALK融合基因突变发生率低，在肺腺癌中仅为5%左右。 4、RAS突变：RAS基因分为3种亚型，即KRAS、HRAS、NRAS。在非小细胞肺 癌中主要为KRAS基因突变，但一直以来都没有研制出一种针对性的药物，临床 治疗也只能是依靠化疗或EGFR-TKI来勉强支持。后来又研究学者发现，化疗及EGFR-TKI并不能使KRAS突变的患者得到有效的治疗。由于KRAS突变的患者多为