糖化酶固定化实验报告
啤酒糖化器实验报告单
啤酒糖化器实验报告单实验目的：本实验旨在探究啤酒糖化器的工作原理，通过对麦芽淀粉的转化过程进行观察和分析，了解啤酒生产中的糖化阶段以及相关参数的影响。
实验原理：1. 糖化过程：糖化是啤酒生产中酿造工艺的重要一步，指的是将麦芽中的淀粉转化为可溶性糖的过程。
这一过程需要利用糖化酶的作用，将淀粉分解为麦芽糖、葡萄糖和麦芽糊精等可溶性糖。
2. 糖化温度：糖化过程中，温度是一个重要的参数。
过高的温度会导致酶的变性，从而影响酶的活性；过低的温度则会抑制糖化酶的活性。
一般酿造啤酒时，糖化温度保持在58-65摄氏度。
3. 糖化时间：糖化过程需要一定的时间进行充分反应。
一般情况下，糖化时间为60-90分钟。
4. 搅拌速度：通过适当的搅拌可以促进糖化过程中酶的均匀分布，提高糖化效率。
5. pH值：糖化过程中pH值的调节对酶的活性也有一定的影响。
啤酒糖化酶对pH值在5.2-5.5的范围内较为活跃。
实验步骤：1. 准备工作：将糖化器清洗干净，确保无杂质残留。
准备所需的麦芽和糖化酶。
2. 糖化器设置：将合适量的水加入糖化器中，将糖化器预热至设定的糖化温度。
3. 加入麦芽：将适量的麦芽均匀加入糖化器中。
4. 加入糖化酶：按照糖化酶的使用说明，将适量的酶加入糖化器中。
注意酶的用量要根据麦芽的品种和质量确定。
5. 调节pH值：通过加入适量的酸或碱溶液，调节糖化液的pH值至5.2-5.5之间。
6. 开始糖化：启动糖化器的搅拌功能，开始糖化过程。
注意糖化过程中控制温度、时间和搅拌速度。
7. 取样分析：根据需要，可在糖化过程中取样分析糖化液中的糖含量及其他相关参数。
8. 糖化结束：完成糖化过程后，关闭糖化器并取出糖化液，备用于后续的酒曲发酵或其他工艺步骤。
实验结果与讨论：根据实验得知，糖化过程中的温度、时间、搅拌速度和pH值等参数的控制对糖化效果有着重要的影响。
在合适的温度范围内平衡以上参数，可以最大限度地提高糖化酶的活性，使淀粉转化为可溶性糖，从而为后续的发酵过程提供充足的营养物质。
实验一 固定化酵母酒精发酵
实验一固定化酵母酒精发酵一、实验目的掌握制备固定化细胞中最基本、最常用的方法。
掌握固定化酵母酒精发酵工艺。
掌握酒精的提取及测定方法。
二、实验原理固定化酶和固定微生物细胞的原理是将酶或微生物细胞利用物理的或化学的方法，使酶或细胞与固体的水不溶性支持物（或称载体）相结合，使其既不溶于水，又能保持酶和微生物的活性。
它在固相状态作用于底物，具有离子交换树脂那样的特点，有一定的机械强度，可用搅拌或装柱形式与底物溶液接触。
由于酶和微生物细胞被固定在载体上，使得它们在反应结束后，可反复使用，也可贮存较长时间使酶和微生物活性不变。
一般胞内酶、提纯酶在固定化中或固定化后常不稳定，而固定化微生物不仅可避免复杂的酶提取和纯化过程，同时解决了酶的不稳定性问题。
细胞固定化后，酶活较高，操作稳定性较好，可在多步酶促反应中应用并便于连续化、自动化操作。
若代谢底物及产物均为低分子物质时使用固定化微生物细胞效果更佳。
微生物细胞固定化常用载体有：1、多糖类（纤维素、琼脂、葡聚糖凝胶、藻酸钙、K一角叉胶、DEAE-纤维素等）；2、蛋白质（骨胶原、明胶等）；3、无机载体（氧化铝、活性炭、陶瓷、磁铁、二氧化硅、高岭土、磷酸钙凝胶等）；4、合成载体（聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、酚醛树脂等）。
选择载体原则以价廉、无毒、强度高为好。
微生物细胞固定化常用的方法有三大类：1．吸附法吸附法是将细胞直接吸附于惰性载体上，分物理吸附法与离子结合法。
（1）物理吸附法是利用硅藻土、多孔砖、木屑等作为载体，将微生物细胞吸附住。
（2）离子结合法是利用微生物细胞表面的静电荷在适当条件下可以和离子交换树脂进行离子结合和吸附制成固定化细胞。
吸附法优点是：操作简便、载体可再生；缺点是：细胞与载体的结合力弱、pH、离子强度等外界条件的变化都可以造成细胞的解吸而从载体上脱落。
2．包埋法是将微生物细胞均匀地包埋在水不溶性载体的紧密结构中，细胞不至漏出而废物和产物可以进入和渗出。
细胞和载体不起任何结合反应．细胞处于最佳生理状态。
糖化力实验报告
一、实验目的1. 了解糖化力的概念和测定方法。
2. 掌握使用DNS法测定糖化力的实验操作步骤。
3. 分析不同条件下糖化力的变化规律。
二、实验原理糖化力是指在一定条件下，酶将淀粉分解成葡萄糖的能力。
DNS法（3,5-二硝基水杨酸法）是测定糖化力的常用方法，其原理是：在酸性条件下，DNS与还原糖反应生成紫红色复合物，通过测定该复合物的吸光度，可以计算出还原糖的浓度，从而计算出糖化力。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 淀粉酶- 淀粉- DNS试剂- 硫酸铜溶液- 氢氧化钠溶液- 水浴锅- 移液器- 试管- 离心机- 分光光度计2. 实验仪器：- 糖化力测定仪- 移液器- 离心机- 分光光度计四、实验步骤1. 样品制备：- 称取一定量的淀粉，加入适量的水，搅拌均匀，煮沸，冷却后备用。
- 称取一定量的淀粉酶，用适量的水溶解，备用。
2. 糖化反应：- 将淀粉溶液和淀粉酶溶液按照一定比例混合，放入水浴锅中，在适宜的温度下进行糖化反应。
3. DNS反应：- 将糖化反应后的溶液取出，加入适量的DNS试剂，混匀。
- 在沸水中加热5分钟，取出冷却。
- 加入适量的氢氧化钠溶液，混匀。
4. 吸光度测定：- 使用分光光度计测定溶液在540nm处的吸光度。
- 根据标准曲线计算出还原糖的浓度。
5. 计算糖化力：- 根据还原糖的浓度和反应条件，计算出糖化力。
五、实验结果与分析1. 标准曲线的绘制：- 使用已知浓度的还原糖溶液，按照DNS法测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 不同条件下糖化力的变化：- 在不同温度、pH值、淀粉酶用量等条件下，测定糖化力。
- 分析不同条件下糖化力的变化规律。
六、实验讨论1. 实验误差分析：- 实验过程中可能存在的误差包括：淀粉酶的活性、淀粉溶液的浓度、DNS试剂的浓度等。
2. 实验结果分析：- 根据实验结果，分析不同条件下糖化力的变化规律，探讨影响糖化力的因素。
七、结论通过本实验，我们掌握了DNS法测定糖化力的实验操作步骤，了解了不同条件下糖化力的变化规律。
海藻酸钠包埋法共固定α-淀粉酶和糖化酶的研究
左 右 ， 出用真空 泵抽 干 ， 取 测其 反 应速 率 。改变 海 藻酸
钠、 氯化钙 和酶的浓度使 固定化效果达 到最佳 。
１ ２ ２ 酶 反 应 速 率 的 测 定 ．．
取 ２ ＯｍＬ质 量体 积 比为 ２ 的可溶性 淀粉 溶液 放
人试 管 中 ， 加入缓 冲液 ５ ｍＬ， 入水 浴 中预 热 ５ｍｉ ， 放 ｎ 然后取 一定 量 的固定化 酶加 入溶 液 中 ， 反应 ５ｍｉ ， ｎ后 加人 １ｔｏ ・ 的 Ｎａ ｌ Ｌ ｏ ＯＨ ５ｍＬ， 再在 沸水 浴中加热 ５ ｍｉ ｎ灭活 。取一 定 量 离 心 后 用 ＤＮ Ｓ比色 定 糖 法 测 定 还 原糖 含量Ｌ ， 而 计算反 应速 率 。 ８进 ］ １ ２ ３ 蛋 白质含量 的测 定 ．．
摘 要 ： 海 藻酸 钠 为栽 体 ， 包 埋 法 共 固 定 口淀 粉 酶 和 糖 化 酶 双 酶 体 系， 究 了共 固 定 化 过 程 中双 酶 的 比 例 、 Ｈ 以 用 一 研 ｐ
值、 温度 对共 固 定化 后 体 系稳 定 性 的 影 响 ， 并探 讨 了 此 双酶 体 系在 热 稳 定性 、 藏稳 定性 、 续使 用稳 定 性 方 面 的效 果 。 储 连 关 键 词 ： 淀粉 酶 ； 化酶 ； 藻 酸 钠 ； 固 定化 糖 海 共 中 图 分 类 号 ： Ｑ ２ ． Ｔ ９５ １ 文献 标 识 码 ： Ａ 文章 编 号 ： ６ ２ ５ ２ （ ０ ６ ０ —０ ２ — ０固定化 酶 技 术 问世 以来 ， 食 在 品 与发酵 工业 、 机合成 等领 域得 到 了广泛 的应用 ， 有 并 显示 出很强 的优越 性口 。近年 来在单 一酶 固定化 技 术 ］
逐渐成 熟 的基础上 又 建立 了多 酶 共 固定 化 技 术 ， 而 从
第九章固定化酶
（游离α--氨基，lys—ζ—NH2, Arg胍基，-COOH, Asp—γ--羧基Glu--羧基， 酚羧基，巯基，咪唑基) 但是，载体、酶分子上的基团是不能直
接反应，功能基团要活化，
第九章 固定化酶
1)重氮化
芳香氨基载体
方法特点：
载体先用亚硝酸处理成重氮盐衍生物， 在温和条件和酶分子上相应基团直接偶联。
现有多孔物质包络法，超过滤法 等。实际上用包埋法最多
第九章 固定化酶
各种固定化方法的优、缺点比较
吸附法
固定化方法 物理吸附法 离子吸附法 包埋法 共价键结合法 交联法
制备难易
易
易
较难
难
较难
结合程度
弱
中等
强
强
强
活力回收 高,酶易流失 高
高
低
中等
再生
可能
可能 不能 不能
不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
第九章 固定化酶
2)微囊型包埋 常用微囊型包埋剂有尼龙膜、火棉胶、
醋酸纤维素等。
用半透膜将酶包埋在里面， 半透膜容许底物和产物自由出入膜囊，
囊的表面积相对体积的比值大， 底物和产物的交换进行迅速。
第九章 固定化酶
例子：尼龙膜界面聚合包埋
(酶+己二胺水溶液)+庚二酰氯有机溶剂(氯仿)
混合
乳化，二种单体(己二胺和庚二酰氯) 在水相、有机相交界处聚合
芳香族重氮化具疏水性，倾向于进入分子 中Tyr等集中的疏水区偶联而导致失效。
a.当载体为电中性或疏水性时，这种倾向 性越大。
b.当载体用亲水极性物质时，这种疏水区 的特性就大大减小了。
酶的实验报告
一、实验名称：酶的专一性实验二、实验目的1. 了解酶的专一性原理及其在生物体内的作用。
2. 掌握验证酶专一性的实验方法。
3. 通过实验，加深对酶活性、温度、pH值等影响酶活性的因素的理解。
三、实验原理酶是一种具有催化功能的蛋白质，具有高度的底物专一性，即一种酶只能对某一种底物或一类底物起催化作用，对其他底物无催化反应。
本实验以唾液淀粉酶对淀粉和蔗糖的作用为例，说明酶的专一性。
四、实验材料与仪器1. 实验材料：唾液、淀粉溶液、蔗糖溶液、班氏试剂、试管、试管架、恒温水浴器、滴管等。
2. 实验仪器：显微镜、烧杯、酒精灯、试管夹、滴定管等。
五、实验步骤1. 将唾液滴入试管中，加入淀粉溶液，混匀后放入恒温水浴器中，水浴温度控制在37℃。
2. 10分钟后，取出试管，加入班氏试剂，观察现象。
3. 另取一个试管，加入唾液、蔗糖溶液，重复步骤2。
4. 将两组试管分别放入沸水浴中加热，观察现象。
六、实验现象1. 第一步实验中，淀粉溶液在唾液淀粉酶的作用下，生成具有还原性的麦芽糖，加入班氏试剂后，出现砖红色沉淀。
2. 第二步实验中，蔗糖溶液在唾液淀粉酶的作用下，未发生明显变化，加入班氏试剂后，无砖红色沉淀产生。
3. 将两组试管分别放入沸水浴中加热后，第一步实验中，砖红色沉淀逐渐消失；第二步实验中，无变化。
七、实验结果分析1. 唾液淀粉酶对淀粉具有专一性，能够催化淀粉的水解反应，生成具有还原性的麦芽糖。
2. 唾液淀粉酶对蔗糖无催化作用，不能催化蔗糖的水解反应。
3. 加热后，酶活性受到破坏，导致反应停止。
八、结论本实验结果表明，酶具有高度的专一性，只能催化特定的底物。
唾液淀粉酶对淀粉具有专一性，而对蔗糖无催化作用。
此外，温度、pH值等因素也会影响酶的活性。
九、讨论1. 酶的专一性是酶催化反应的重要特性，有助于提高生物体内化学反应的效率。
2. 酶的专一性受到底物结构、酶结构等因素的影响。
3. 温度、pH值等环境因素会影响酶的活性，进而影响酶催化反应的效率。
糖化酶的生产工艺
糖化酶的生产工艺糖化酶是一种催化糖化反应的酶，可以将淀粉、纤维素等多糖分解成简单的糖类。
由于其广泛的应用于食品、饲料、制糖、生物燃料等领域，糖化酶的生产工艺变得越来越重要。
糖化酶的生产工艺一般分为以下几个步骤：1. 酶源的筛选和培养糖化酶可以从多种微生物中获得，如真菌、细菌、酵母等。
首先需要筛选出具有高效酶活性的酶源，并进行毒力测试排除可能的有害物质。
接着，将所选的酶源进行大规模培养，为后续酶的提取和纯化做准备。
2. 酶的提取和纯化培养出的菌液会经过离心等操作将酶从菌体中分离出来。
接下来，可以利用重组工程技术将酶基因引入适当的宿主细胞进行表达和分泌。
经过多次过滤、层析、浓缩等步骤，可以获得纯化后的糖化酶产品。
3. 酶活力的测试和调整酶的活力是衡量其催化能力的重要指标，因此需要对纯化后的酶进行活力测定。
如果发现酶活力较低或不稳定，可以通过改变培养条件、酶提取和纯化过程中的参数来进行调整，如改变pH值、温度、金属离子浓度等。
4. 酶的固定化处理（可选）为了提高酶在反应体系中的稳定性和重复使用性，可以将酶固定在某种载体上，如多孔陶瓷、聚合物凝胶或生物膜等。
固定化酶可以增加酶的使用寿命和催化效率，减少废液处理的复杂性。
5. 酶活性的保存和包装为了保持酶活性和延长保存期限，酶产品通常会经过冷冻干燥或冷藏等工艺进行保存。
同时，酶产品还需要进行适当的包装，以便在运输和储存过程中保护酶的完整性和稳定性。
总结起来，糖化酶的生产工艺包括酶源的筛选和培养、酶的提取和纯化、酶活力的测试和调整、酶的固定化处理以及酶活性的保存和包装等步骤。
每个步骤都需要进行精确控制，以确保酶产品的质量和稳定性。
随着科技的发展，糖化酶的生产工艺也在不断改进，可以预见未来糖化酶的生产将更加高效、环保和经济。
糖化酶
酶活测定方法
▪ 亚碘酸盐法（碘量法） ▪ 费林法 ▪ 3，5—硝基水杨酸法（DNS法） ▪ 葡萄糖氧化酶发（NOVO法分光光度测定
淀粉葡萄糖苷酶） ▪ （补）用萃取化学公司法测定淀粉葡萄糖
苷酶
参 酶 酶 其生 影 糖 发 目 国 菌 概 考 活 的 应淀 响 化 酵 前 内 株
本
文 测 分 用粉 酶 酶 生 的 外 的 念 节
献 定 离 的糖 活 的 产 用 研 发 方 和 研化 力 一 工 途 究 现 和 法 纯 究酶 的 般 艺 （ 情 及
内 容
（ 化 （菌 因 性 （ 了 况 生 特
了 了种 素 质 了 解 （ 产
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） ）育
） 解用
（ 回 顾
、 性 质 及
参考文献：
• ５．郑集 陈钧辉 著，普通生物化学（第 三版），高等学校教材，（２００３）
• ６．王镜岩 朱圣庚 徐长法 著，生物化 学（第三版 上），高等教育出版社， （２００４）
糖化酶的酶活
在40℃，PH5.5条件下，1小时分解可溶性 淀粉产生1毫克葡萄糖所需的酶量定义为一个 糖化酶酶活力单位，以mg/g.h表示。
糖化酶的一般性质
1、最适pH为4-Байду номын сангаас；最适反应温度为50-60℃ 2、根据不同来源的糖化酶水解淀粉限度分为
根霉型糖化酶： 可以水解淀粉至100%，属于这种糖化酶产生菌
如
德氏根霉（Rh.delemar）、拟内孢霉等。
黑白霉型糖化酶：水解淀粉至80%便终止作用，属于这种糖化酶 产生菌如黑曲霉、宇佐美曲霉、泡胜曲霉、米 曲霉、河自根霉等。
原理：糖化酶可以水解淀粉１,4-α-糖苷键或
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1、实验用乳化机WL500CY、注射用筒50mL6号针头、冰箱、其他实验常用玻璃仪器
2、糖化酶、海藻酸钠、明胶
四、试剂配方
1、2%可溶性淀粉
称取可溶性淀粉碎2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至100ml，此溶液需当天配制。
（3）我们测定酶活的方法是采用滴定硫代硫酸钠法，由于我们操作的不够熟练，在滴定的过程中会多滴一两滴，这使我们的一些数据会偏大。
（4）测固定化酶活与固定化酶的回收率，没有在同一天做，固定化酶放置了一天，这使固定化酶的回收率测定出现偏差。
⑵计算
酶活(mg/ml)=(A-B)*N*90.05*V1/V2
A—空白所消耗的Na2S2O3的毫升数；
B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数；
90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数；
V1—反应液总体积(32.20毫升)；
V2—吸取反应液样品体积(5毫升)；
N—Na2S2O3的当量浓度(0.1mol/L)。
五、实验步骤
1、酶活测定
⑴操作步骤
取2％可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40℃恒温水浴中预热5－10分钟加入待测酶液2毫升(空白以蒸馏水代替酶液)准确计时1小时。取出加入4滴20％NaOH终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1 mol/LNaOH 10毫升，摇匀暗处静置15分钟。加入2N硫酸2毫升。用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。其与空白消耗硫代硫酸钠毫升数的差值应在4~6之间，否则要适当调整酶液的稀释倍数。
3、糖化酶的固定化
将酶液15ml游离酶与3%的海藻酸钠150ml混合，然后加入3%的明胶溶液150ml混合乳化约10min，调pH为4，慢速搅拌并降温至5～10℃，通过6号注射针头将上述冷却液以5cm的高度注进1%氯化钙溶液中，立刻形成光滑的微球，然后保持温度为4℃，球在氯化钙溶液中被硬化30min，固定化酶被贮存在0～5℃冰箱。
2、1mol/LpH4.5醋酸钠缓冲液
取无水醋酸钠8.024g，先在少量水中溶解，定容至1000ml。取分析纯冰醋酸5.78ml定容至1000ml。以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求的缓冲液。
3、0.05 mol/L碘液：
称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升贮存于棕色瓶中。
4、固定化酶的酶活测定
⑴操作步骤
取2％可溶性淀粉溶液25毫升加pH4.5醋酸缓冲液5毫升混匀于比色管，在40℃恒温水浴中预热5－10分钟加入固定化酶5g(空白以蒸馏水代替固定化酶)准确计时1小时。取出过滤终止酶反应，冷却至室温。取上述反应液5毫升于定容瓶中，先加入0.05mol/L碘液10毫升，再加0.1 mol/LNaOH 10毫升，摇匀暗处静置15分钟。加入2N硫酸2毫升。用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。
图1Line weaver-Burk双倒数曲线图
3、
表3固定化酶酶活测定
编号
空白消耗体积
样品消耗体积
酶比活力u/g
平均比活力u/g
管1
9.05
7.85
7.85
7.85
管2
9.00
7.80
7.85
4、固定化酶回收率的计算：
100ml胶酶溶液相当的酶活力u＝总的固定化酶质量×固定化酶比活力
＝45.6×7.85=357.96(u)
A
B
酶活力 u/g
Lg 活力
0
5
9.05
7.85
7.85
0.895
24
5
9.00
8.15
5.56
0.745
由下图得：t1/2=ln2/0.0068=110h（4天零14小时）
图2 固定化酶半衰期的测定
七．结果与讨论：
本实验采用包埋法对糖化酶进行固定化并对其Km，半衰期t2/1重要参数进行测定，随着人们对天然高分子载体的不断挖掘和探究,对其进行改性,或利用超临界技术、纳米技术、膜技术等来固定化酶,同时,开发新型、高效固定化酶反应器,进一步提高转化和生产能力是固定化酶技术发展的趋势。
34.79532
63.79142
69.59064
84.08869
153.6793
200.0731
1/v
0.0287
0.0157
0.0144
0.0119
0.0065
0.0050
以1/[S]为横作标，以1/v（反应初速度）为纵坐标，做Line weaver-Burk双倒数曲线图，其斜率即为米氏常数。Km=0.0004/0.0015=0.267
糖化酶固定化实验报告
学号：********0
******
专业：微生物工程
其他组员：黄志成、李盟、苏温培
*******
实验时间：2008.11.5—2008.11.7
一、目的要求
本实验为酶工程综合实验，由学生自行设计实验方案，培养学生独立实验的能力；并掌握酶活测定方法，米氏常数测定，学习固定化酶的常用方法及固定化酶的表征。
以上实验得出实验数据如下：
项目
游离酶活
Km
固定化酶活
固定化酶半衰期
固定化酶活力回收
数据
19312U/g
0．267mg/ml
7．85 U/g
110h
38．9%
误差分析：
（1）实验中要求采用的硫代硫酸钠溶液需放置三天才能使用，而我们没有做到这一点，这使结果发生偏差。
（2）由于在测固定化酶的活力过程中，固定化酶微球会浮在反应液表面，要使它们能与反应液均匀接触，要在反应过程中不断搅拌反应液，我们是隔一段时间去搅拌一次，而不是使它一直保持搅拌状态，所以测的结果有偏差。
二、基本原理
游离酶可通过各种固定化方法，增加其稳定性并且有利于连续化生产和重复使用。酶固定化后可用各种理化性质的变化来表征其效果。
酶活测定原理：糖化酶（即淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶）有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-葡萄糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用次碘酸钾法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。
315ml胶酶溶液相当于15ml酶溶液活力u＝
=357.96/100×315=1127.57u
15ml酶溶液的总活力u＝
＝19312/100*15=2896.8u
固定化酶的回收率ω％＝
＝1127.57/2896.8×100％＝38.9%
5、固定化酶半衰期的测定
表4 固定化酶的半衰期测定表格
时间
质量g
2—反应30min,换算成1h的酶活力系数所得的结果表示至整数；
N—Na2S2O3的当量浓度(0.1mol/L)。
2、米氏常数的测定
取1ml游离酶，分别以0.20%，0.30%，0.40%，0.50%，1.00%，2.00%浓度的可溶性溶液为底物，在40℃下反应10min，采用以上的方法测定游离酶活，做Line weaver-Burk双倒数曲线图，即以1/[S]为横作标，以1/v（反应初速度）为纵坐标。其斜率即为米氏常数。
0.40%
0.50%
1.00%
2.00%
空白滴定体积ml
8.9
9.0
9.0
8.95
9.05
8.9
样品滴定体积ml
8.3
7.9
7.8
7.5
6.4
5.45
[S]mg/ml
0.016
0.024
0.032
0.039
0.0780.1551/[S]64.441.67
31.25
25.76
12.88
6.44
Vmg/min
4、0.1 mol/L氢氧化钠溶液：
称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。
5、1 mol/L硫酸：
吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。
6、0.1 mol/L硫代硫酸钠：
称取26克硫代硫酸钠和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。
本次固定化酶使用的方法是包埋法，将酶、细胞或原生质体包埋在各种多孔载体中，使其固定化的方法成为包埋法。包埋法制备固定化酶、固定化细胞或固定化原生质体时，根据载体材料和方法的不同，可分为凝胶包埋法和半透膜包埋法两大类。以各种多孔凝胶为载体，将酶、细胞或原生质体包埋在凝胶的微孔内的固定化方法为凝胶包埋法。本次实验中具体使用的方法为海藻酸钙凝胶包埋法。
5、固定化酶活力回收测定
固定化酶活力回收=固定化酶总活力/溶液酶总活力X100%
6、固定化酶半衰期测定
六、实验数据与数据处理
1、
表1糖化酶酶活测定
空白硫代硫酸钠溶液消耗体积ml
9.4
样品硫代硫酸钠溶液消耗体积ml
4.5
酶的比活力u/g
19312
2、
表2糖化酶米氏常数测定HHHH
底物浓度
0.20%
0.30%
⑵计算
酶活(mg/ml)=(A-B)*N*90.05*V1/V2/V3*2
A—空白所消耗的Na2S2O3的毫升数；
B—样品所消耗的Na2S2O3的毫升数；
90.05—1毫升1N的Na2S2O3相当的葡萄糖毫克数；
V1—反应液总体积(32.20毫升)；
V2—吸取反应液样品体积(5毫升)；
V3-吸取酶液毫升数(2毫升)；