王镜岩-生物化学I-第14章 核酸的物理化学性质—第15章 核酸的研究方法

5'-CTGCA G-3,
5'-CTGCA
G-3,
3'-G ACGTC-5，
3'-G +
ACGTC-5，
(b) EcoRI切割位点,切割后形成5`-P的单链粘性末端，
5'-G AATTC-3’ 3'-CTTAA G-5’
5'-G + 3'-CTTAA
AATTC-3’ G-5’
（c）EcoRV切割位点,切割后形成平末端。
第三节 核酸的紫外吸收
• 嘌呤碱与嘧啶碱具有共轭双键，使碱基、核苷、 核苷酸和核酸在240—290nm的紫外波段有一 强烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不 同核苷酸有不同的吸收特性。所以可以用紫外 分光光度计加以定量及定性测定。
1. 核酸样品纯度和含量的鉴定
• 从A260／A280的比值即可判断样品的纯 度。
2. 核酸变性的特点
• （1）一系列物化性质也随之发生改变 ： 紫外吸光度值升高，粘度降低，浮力密 度升高，酸碱滴定曲线改变等
• （2） 变性作用发生在一个很窄的温度范 围内 。
• 通常把加热变性使DNA的双螺旋结构失 去一半时的温度称为该DNA的熔点或熔 解温度，用Tm表示。DNA的Tm值一般 在82—95℃之间
2. Cot l/2 • 衡量复性反应的速度快慢的指标 • Co为变性DNA复性时的初始浓度，以核
苷酸的摩尔浓度表示， • t为时间，以秒表示， • Cot l/2表示复性一半的Cot值
•在DNA浓度相同的情况下， Cot l/2与基因组的大小成正比
三、核酸的杂交 (hybridization)
不同构象的核酸（线形、环 形、超螺旋），密度和沉降速 率不同，用密度梯度离心可以 将不同构象DNA、RNA与蛋 白质区分开来
（一）核酸密度的测定
8M CsCl，45000rpm，16h 密度梯度：1.80g/ml→1.55g/ml 平衡时：浮力密度=CsCl密度=离心力 ρ=ρ0 +4.2ω2（r2 - r02） × 10-10
5'-GAT ATC-3’
3'-CTA TAG-5’
5'-GAT
3`-CTA
+ ATC-3’
TAG-5`
核酸内切限制酶的命名法
• （1）用属名的头一个字母和种名的头两个字母， 组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例 如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流 感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。
• 由于核苷酸含有磷酸与碱基，为两性电介 质，它们在不同pH的溶液中解离程度不同， 在一定条件下可形成兼性离子。带负电荷 的磷酸基正好与带正电荷的含氮环数目相 等，这时的pH即为此核苷酸的等电点
•
pI = (pk1’+pK2’)/2
• ppKK12’’值是是由由于于含第氮一环磷＝酸N+基H--的P0解3H离2的，解离，
（2）用一个写在右下方的标注字母代表菌株或 型，例如Ecok。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同 的限制与修饰体系，则以罗马数字表示。因此， 流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别 表示为HindI、HindII、HindIII等等。
第二节 核酸的酸碱性质
1．碱基的解离
• 核酸的碱基、核苷和核苷酸均能发生解 离，核酸的酸碱性质与此有关。
（1）. Southern印迹杂交
• 将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并 结合在适当的滤膜上，然后通过与标记 的单链DNA或RNA探针的杂交作用检测 这些被转移的DNA片段
• 由于它是由E．Southern于1975年首先设 计出来的，故叫做Southern DNA印迹转 移技术。
（2）Northern blotting
c. 因此，断裂形成的DNA片段具有互补的单 链延伸末端。
a. 识别位点：
• 能够识别由4～8个核苷酸组成的特定的 核苷酸序列；
• 切割位点的一个共同特点是，它们具有 双重旋转对称的结构形式，换言之，这 些核苷酸对的顺序是呈回文结构。
（a）Pst I切割位点 , 切割后形成3`-OH的单链粘性末端，
1979 年 ， 发 展 出 了 一 种 新 的 方 法 ， 将 RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素 滤膜或其它化学修饰的活性滤纸上，进 行核酸杂交的一种实验方法。由此可见 ，这种方法同DNA印迹杂交技术十分类 似
（3）Western blotting
• 将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝 酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标 记的特定蛋白质的抗体进行反应，这种 技术叫做Western蛋白质杂交技术。
• 纯DNA的A 260／A280应大于1.8， • 纯RNA的A 260／A280应达到2.0
• 对于纯的样品，只要读出260nm的A值即 可算出含量。通常以1A=50ug／mL双螺 旋DNA或40ug／mL单链DNA(或RNA)， 或20ug／mL寡核苷酸计算
• 对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳 分离出区带后，经溴化乙锭染色在紫外
核酸限制内 3 种 不 同 的 单一的成份 切酶的蛋白 亚基 质结构
2种不同的 亚基
切割位点
在距特异性位 点 至 少 1000bp 的地方可能随 机地切割
Hale Waihona Puke 位于特异性位 点或其附近距特异性位点3， 端24~26bp处
甲 基 化 作 用 的 特异性的位点 位点
特 异 性 的 位 点 ； 特异性的位点 一般为A或C
(3) 限制性内切酶
限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割 DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原 核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科 全书》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一 项迄今就已从各种不同的微生物当中，分离出 了2300种以上。
第15章 核酸的研究方法
一、核酸的分离、提纯和定量测定
制备天然核酸必需采用温和的条件， 防止过酸、过碱，避免剧烈搅拌，尤其 重要的是防止核酸酶的作用
（一）DNA分离纯化
真核DNA以核蛋白（DNP）形式存在，DNP 溶于水或高盐溶液（1mol/L NaCl），但不 溶于低盐溶液（0.14mol/L NaCl
二、复性 (renaturation)
• 变性DNA在适当条件下，又可使两条彼此分开 的链重新缔合成为双螺旋结构，这过程称复性
• 1. DNA复性的特点： • （1）许多物化性质又得到恢复 • （2）将热变性的DNA骤然冷却时，DNA不可
能复性 • （3）DNA的片段越大，复性越慢。 • （4）DNA的浓度越大，复性越快。
磷酸三酯
H2O
三、酶水解
• 专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶 （nuclease) ；水解核酸的酶种类很多
• 1．核酸酶的分类 • (1) 按底物专一性分 • 核糖核酸酶(RNase)：作用于RNA • 脱氧核糖核酸酶(DNase)：作用于DNA。 • (2)按对底物作用的方式 • 核酸内切酶(endonuclease) • 核酸外切酶(exonuclease) • 既可内切，也能外切 的核酸酶
识别未甲基化 能
能
能
的序列进行核
酸内切酶切割
序 列 特 异 的 切 不是
是
是
割
DNA 克 隆 中 的 无用 用处
十分有用
用处不大
Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
它具有三个基本特性：
a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位， 切割DNA分子产生链的断裂；
b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布，通 常不是彼此直接相对的；
• 复性后ε(P)值又降低，这现象称减色效应。 • 测定核酸的ε(P)可判断DNA制剂是否发生变性
或降解。
第四节 核酸的变性、复性及杂交
一、核酸的变性(denaturation)
• 变性指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链， 并不涉及共价键的断裂。
1. 引起核酸变性的因素
• （1）温度；加热到80～100℃ • （2）酸碱度改变 • （3）化学试剂：尿素 、甲醛
灯下粗略地估计其含量。
有时核酸溶液的紫外吸收以摩尔磷吸光系 数来表示： ε(P)=A/c l
• 一般天然DNA的ε(P)为6 600，RNA为7 700—7 800。单链多核苷酸的ε(P)值比双螺旋结构多 核苷酸的ε(P)值要高。
• 核酸发生变性时，ε(P)值升高，此现象称为 增色效应。（这是因为双螺旋结构使碱基对的 π电子云发生重叠，因而减少了对紫外光的吸 收）
3．脱氧核糖核酸酶类
• (1)牛胰脱氧核糖核酸酶（DNasel) ：此 内切酶切断双链DNA或单链DNA成为以 5’-磷酸为末端的寡聚核苷酸。需镁离子 (或Mn2+，Co2+)，最适pH 7-8。
•
• (2)牛脾脱氧核糖核酸酶（DNaseⅡ) ：此 酶降解DNA成为3’-磷酸末端的寡聚核 苷酸。最适pH 4～5，需0.3 mol／L钠离 子激活，镁离子可以抑制此酶。
第14章 核酸的物理化学性质
第一节 核酸的水解
核酸的水解
核酸
水
核苷酸
解
磷酸
核苷
戊糖
碱基
一、酸水解
• 水解特点：
• 1.糖苷键和磷酸酯键都能被酸水解 • 2.但糖苷键比磷酸酯键更易被酸水解 • 3.嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸
更不稳定
二、碱水解
• 水解特点： • 1. RNA的磷酸酯键易被碱水解；而DNA对碱稳定
• 1. 定义： • 将不同来源的DNA放在试管里，经热变
性后，慢慢冷却，让其复性。若这些异 源DNA之间在某些区域有相同的序列， 则复性时，会形成杂交DNA分子。 • DNA与互补的RNA之间也可以发生杂交。 是分子生物学和分子遗传学的研究中应 用极广的技术。