两种制备大鼠胚胎成纤维细胞的方法比较
大鼠原代心肌细胞提取方法
大鼠原代心肌细胞提取方法原代心肌细胞培养是体外研究心血管疾病相关机制的主要手段和基本技术基础实验中，与细胞系相比，原代心肌细胞的形态及电生理方面更接近在体细胞，因此，培养原代心肌细胞的质量直接关系实验的进程及结果。
乳鼠原代心肌细胞分离须注意以下几点：1. 鼠龄的选择：新生1-3d龄，最好半日龄。
新生大鼠心肌细胞在出生后3 d内具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌细胞则为终末分化细胞，不再具有分裂增殖能力。
因此，大鼠出生时间越短，其心肌细胞分离后成活率越高，越容易贴壁生长。
建议选择1~3 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养。
2.消化酶的选择：胰蛋白酶和胶原酶混合使用（0.4%胶原酶:0.05%胰酶=2:1）。
常用的消化酶有2种：胰蛋白酶和胶原酶，胰蛋白酶作用较强，容易造成心肌细胞损坏，胶原酶作用较缓和，能消化细胞间质中的胶原纤维以释放细胞，对细胞损伤小。
3.消化程度的把握：组织由红转白呈半透明状态时，停止消化。
新生大鼠心肌细胞对消化酶极为敏感。
消化不足，细胞聚集成团，无法得到单层细胞，不利于观察和后续实验；消化过度可使肌原纤维出现萎缩，细胞死亡率增加或丧失贴壁能力及搏动能力；消化的适宜温度为35~37℃。
4.抑制成纤维细胞生长：加入BrdU，更换小牛血清。
分离出来的心肌细胞会伴有较多成纤维细胞，成纤维细胞具有较强增殖能力会干预心肌细胞的贴壁和增殖，需要尽量去除成纤维细胞。
成纤维细胞较心肌细胞更容易贴壁，可以通过差速贴壁去除大部分成纤维细胞，但仍有少量成纤维细胞混杂于心肌细胞之中。
溴脱氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干扰细胞的有丝分裂，故常规使用BrdU抑制成纤维细胞的生长。
由于胎牛血清所含的促细胞有丝分裂的因子较多，BrdU很难完全抑制成纤维细胞的生长.改用小牛血清则可克服这种现象的出现，获得高达90％以上的心肌细胞。
5.培养液pH值：pH范围在7.2~7.4之间。
操作过程：手持大鼠乳鼠（出生24h内），75%乙醇消毒皮肤，剪开胸部皮肤，再消毒1次，更换手术器械，弯镊提取心脏，置于盛有PBS（1:50双抗）的大皿中；将心脏表面附着的大血管剪去，剪去心房，放入5ml灭菌离心管中充分剪碎成肉泥状；加3ml左右胶原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹匀，37℃消化8 min，自然沉淀，弃上清，再加3ml左右胶原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；取上清，3000 rpm 5min，铺中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培养基（记1），剩余沉淀中加入3ml左右胶原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹匀，37℃消化10min；重复4的步骤4-5次，直至组织块消化完毕，记（2-5）放培养箱2到3小时待成纤维细胞贴壁后轻轻吹打培养基，所有的中皿上清移入离心管离心3000 rpm 5min，弃上清，加含有10%小牛血清的DMEM培养基以及Brdu（10mM）（1:80），铺中皿培养。
甲状腺成纤维细胞原代培养报告
甲状腺成纤维细胞的分离、培养和鉴定
材料和试剂：来源：SD大鼠
手术器材：手术剪（镊）、解剖镊、眼科剪（镊）、显微镊
清洗液：PBS
培养液：DMEM添加20%FBS200IU双抗
破红液：常规配方
具体操作：1、将300uL的3％戊巴比妥注入SD大鼠体内，待大鼠麻醉至昏厥状态时，将大鼠转入75%的酒精最浸泡5min。
2、在无菌条件下，将大鼠放置于泡沫板上，四肢用针头固定。
3、用左手持直头眼科镊子夹住大鼠腹部最下方的皮毛，右手拿手术剪将大鼠的皮剪开，沿着腹部下方一直剪至大鼠下颚，将下颚的皮毛去掉。
4、剪开大鼠的皮毛看见覆盖在气管上方的肌肉组织，左手换一个无菌的弯头眼科镊子，右手拿另一个无菌的手术剪，将肌肉组织剪开后即可发现气管，将气管周围的组织轻轻去除，即可看见气管及覆盖在气管周围的甲状腺组织，左手将气管下端轻轻固定，右手拿手术剪将甲状腺连着气管剪下来。
5、在无菌条件下，左手拿直头显微镊子将气管轻轻固定，右手拿弯头显微镊，除去连在气管及甲状腺外壁的结缔组织，然后用动脉剪将甲状腺从气管上剪下来，尽量不要剪刀气管，用预冷的PBS 清洗3次。
6、左手拿直头显微镊子将分离的甲状腺轻轻固定，右手用动脉剪剪成1mm³大小的组织块后，再用PBS清洗2-3次。
7、将组织块植入6孔板，组织块之间的间隙在3mm³左右，用枪头吸取多余的液体，将6孔板倒扣在培养箱中2小时，加入培养液1mL静置培养5天，5天即可观察到食管外膜成纤维细胞爬出，如图所示。
8、5天后移去组织块，待细胞长满6孔板后，用时差贴壁法纯化细胞，细胞纯度达90%以上后，可冻存保种。
图1.用Vimentin抗体鉴定甲状腺成纤维细胞
武汉云克隆诊断试剂研究所。
miR-29c对矽肺纤维化中成纤维细胞COL1A1表达的影响
miR-29c对矽肺纤维化中成纤维细胞COL1A1表达的影响王发选;许红霞;张昱辉;周健【摘要】目的探讨miR-29c在矽肺纤维化中的作用.方法原代培养大鼠肺成纤维细胞,分为阴性对照组(A组)、巨噬细胞培养液刺激组(B组)、miR-29c mimic+巨噬细胞培养液刺激组(C组)和miR-29c无义序列+巨噬细胞培养液刺激组(D组)4组,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞中COL1A1 mRNA表达水平,Western blot法检测COL1A1蛋白表达水平.结果与A组比较,B组COL1A1基因与蛋白表达水平均增加(P均<0.05);与B组和D组相比较,C组COL1A1基因与蛋白表达水平明显降低(P均<0.01).结论 miR-29c可以减少巨噬细胞刺激液诱导的大鼠肺成纤维细胞COL1A1表达,对矽肺纤维化过程有潜在干预作用.【期刊名称】《宁夏医科大学学报》【年(卷),期】2018(040)012【总页数】5页(P1390-1394)【关键词】miR-29c;大鼠;Ⅰ型胶原蛋白;成纤维细胞;矽肺【作者】王发选;许红霞;张昱辉;周健【作者单位】宁夏医科大学公共卫生与管理学院职业与环境卫生学系,银川750004;宁夏医科大学公共卫生与管理学院职业与环境卫生学系,银川 750004;兰州铁路局疾病预防控制所,兰州 730000;宁夏医科大学公共卫生与管理学院职业与环境卫生学系,银川 750004【正文语种】中文【中图分类】R135.2矽肺是严重危害人类健康的职业病，目前公认的发病机制是游离二氧化硅通过呼吸道进入机体，肺泡巨噬细胞吞噬游离二氧化硅颗粒，受到刺激的巨噬细胞分泌各种细胞因子，趋化成纤维细胞，造成细胞外基质（ECM）成分的大量积聚，但确切机制尚未阐明[1]。
在ECM中，胶原占11%，尤其以Ⅰ型和Ⅲ型胶原为主。
能否通过分子生物学手段阻止这些胶原的产生和积聚，是干预乃至治疗矽肺纤维化研究的热点。
丹参酮ⅡA通过NLRP3Caspase-1信号通路对心肌成纤维细胞的保护作用
基金项目：国家自然科学基金项目（８１７０１８８７）———ＰｒｏｔｅｃｔｉｎＤＸ调节中性粒细胞活化在脓毒症致急性肺损伤中的作用及其机制研究；湖北省自然科学基金项目（２０２０ＣＦＢ５７７）作者简介：郑鹏（１９８６ １０—），男，博士，主治医师，研究方向：脓毒症，Ｅ ｍａｉｌ：ｚｈｐ２０１４ｄ＠１２６ ｃｏｍ通信作者：冯俊（１９７８ ０７—），男，博士，副主任医师，研究方向：脓毒症，Ｅ ｍａｉｌ：ａｎｄｙｔｅｒｒｙ５５５＠１６３ ｃｏｍ丹参酮ⅡＡ通过ＮＬＲＰ３／Ｃａｓｐａｓｅ １信号通路对心肌成纤维细胞的保护作用郑 鹏１ 王俊帅１ 占大钱１ 王 敏１ 夏海发２ 刘旭东１ 明晓青１ 周代星１ 冯 俊１（１华中科技大学同济医学院附属同济医院急诊内科，武汉，４３００００；２华中科技大学同济医学院附属协和医院麻醉科，武汉，４３００００）摘要 目的：探讨丹参酮ⅡＡ对心肌成纤维细胞损伤的保护作用及可能机制。
方法：分离和培养大鼠心肌成纤维细胞（ＣａｒｄｉａｃＦｉｂｒｏｂｌａｓｔ，ＣＦｓ）。
以脂多糖（ＬＰＳ）刺激ＣＦｓ建立脓毒症心肌损伤体外模型，以不同浓度丹参酮ⅡＡ预处理ＣＦｓ３０ｍｉｎ后，给予ＬＰＳ刺激，设对照组，ＬＰＳ模型组，ＬＰＳ＋不同浓度ＴＳＡ（２μｍｏｌ／Ｌ、１０μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ）组；采用蛋白质免疫印迹试验法（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）检测ＣＦｓ的ＮＬＲＰ３和Ｃａｓｐａｓｅ １蛋白表达水平，酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测细胞上清中ＩＬ １β和ＩＬ １８的含量。
结果：ＬＰＳ刺激２４ｈ后，ＣＦｓ的ＮＬＲＰ３蛋白的表达水平最高。
ＬＰＳ模型组ＮＬＲＰ３和Ｃａｓｐａｓｅ １蛋白的表达较对照组明显升高（Ｐ＜０ ０１）。
与ＬＰＳ模型组比较，丹参酮ⅡＡ（１０μｍｏｌ／Ｌ、５０μｍｏｌ／Ｌ）处理组ＮＬＲＰ３和Ｃａｓｐａｓｅ １蛋白的表达均明显降低（Ｐ＜０ ０５）；丹参酮ⅡＡ处理组的ＩＬ １β和ＩＬ １８水平均明显低于ＬＰＳ模型组（Ｐ＜０ ０５）。
ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备
ICR小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养及饲养层制备方驰华;胡海北;郝建志;陈霞【摘要】背景:小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层能有效促进胚胎干细胞及诱导多能性干细胞增殖并维持其未分化特性和多潜能性,且效果优于无饲养层单独添加一些细胞因子,而且可以为上述两种细胞提供类似的胚胎发育环境.目的:建立稳定高效的ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系,用于培养人胚胎干细胞及诱导多能性干细胞.方法:使用胰蛋白酶消化法分离ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察不同的胰蛋白酶水平及消化时间对获取小鼠胚胎成纤维细胞的量及其增殖活性的影响;利用不同质量浓度丝裂霉素C处理小鼠胚胎成纤维细胞1,1.5,2,2.5,3,3.5 h制备饲养层细胞,MTT法检测其增殖活性,探索其制备饲养层的最佳条件.结果与结论:分离ICR小鼠胚胎原代成纤维细胞最佳胰蛋白酶浓度为0.05%,消化时间为12～15 min,丝裂酶素最佳作用质量浓度和时间为10 mg/L作用2.5 h,成纤维细胞饲养层可以维持8～12 d.0.05%胰蛋白酶消化15～20 min效果优于0.15%,0.25%胰蛋白酶消化;10 mg/L丝裂霉素C处理胚胎成纤维细胞2.5 h能有效抑制其增殖,表明该条件下的饲养层细胞能很好的支持胚胎干细胞及诱导多能性干细胞生长.【期刊名称】《中国组织工程研究》【年(卷),期】2010(014)023【总页数】4页(P4299-4302)【关键词】胚胎成纤维细胞;丝裂霉素C;饲养层;胚胎干细胞;诱导多能性干细胞【作者】方驰华;胡海北;郝建志;陈霞【作者单位】南方医科大学附属珠江医院肝胆一科,广东省广州市,510180;南方医科大学附属珠江医院肝胆一科,广东省广州市,510180;南方医科大学附属珠江医院肝胆一科,广东省广州市,510180;南方医科大学附属珠江医院超声诊断科,广东省广州市,510180【正文语种】中文【中图分类】R394.20 引言胚胎干细胞(embryonic stem cell，ESC)来源于囊胚的内细胞团细胞和原始生殖细胞[1-2]；诱导多能性干细胞(induced pluripotent stem cells，iPS)是由成体细胞逆转而成的具有与 ESC类似全能性的细胞，二者均有无限增殖、自我更新和多向分化潜能，能够向不同的组织细胞分化[3-4]。
单体、寡聚体及纤维状Aβ毒性作用的比较研究
单体、寡聚体及纤维状Aβ毒性作用的比较研究孔繁军;陈强;周亮;崔德华【摘要】目的采用Alzheimer’sdisease(AD)动物模型，阐明单体与寡聚体Aβ对神经细胞毒性作用。
方法本实验孵育获得寡聚体及纤维状Aβ，采用核黄素标记光度法测定Aβ凝聚度。
采用寡聚体Aβ损伤大鼠海马CA1区来制备AD大鼠模型，并采用流式细胞术法检测AD大海马细胞凋亡情况。
结果寡聚体Aβ神经毒性比单体及纤维化Aβ组，海马含亚G1期细胞百分数明显增多；寡聚体Aβ组与单体及纤维化Aβ组相比较具有显著性差异。
结论寡聚体Aβ神经毒性比单体及纤维状Aβ更加显著，寡聚体Aβ可导致神经细胞凋亡，神经细胞凋亡参与了AD的发病。
【期刊名称】《中国实验诊断学》【年(卷),期】2012(000)009【总页数】3页(P1569-1571)【关键词】阿尔茨海默病;凋亡;单体Aβ;寡聚体Aβ;纤维状Aβ【作者】孔繁军;陈强;周亮;崔德华【作者单位】北京海淀医院神经内科,北京100080;宁波市北仑宗瑞医院神经内科;北京大学医学部神经科学研究所;北京大学医学部神经科学研究所【正文语种】中文【中图分类】Q255阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）是一种发生于老人的最常见的神经退行性疾病，其主要病理学特征则是在脑中形成大量的老年斑和神经原纤维缠结以及出现弥漫性脑萎缩［1］。
其病因发病机制的研究1984年，Glenner and Wong从老年斑中纯化和分离得到Aβ并解读得到其蛋白序列［1］，才开始有了显著的进展。
随后的研究表明老年斑的主要成分是β－淀粉样蛋白（β－amyloid peptide，Aβ），由β－淀粉样蛋白前体（amyloid precursor protein，APP）裂解产生，Aβ的寡聚体和纤维化是AD患者脑内重要的病理改变，在凝聚形成Aβ纤维的过程中，具有过氧化损伤，引起炎症反应，损伤突触功能等多种神经毒性，对AD的病理进程起关键作用［2］。
艾灸血清对实验性RA大鼠滑膜成纤维细胞体外增殖及TRAF6表达的影响
艾灸血清对实验性RA大鼠滑膜成纤维细胞体外增殖及TRAF6表达的影响戴历群;曹媛媛;周海燕;刘鳐;马文彬;李轩漾;刘旭光;王蕾【摘要】目的研究两种艾灸血清对实验性类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)大鼠滑膜成纤维细胞体外增殖及滑膜成纤维细胞肿瘤坏死因子受体相关因子6( TRAF6)表达的影响,探究艾灸血清对实验性RA大鼠抗炎效应的作用机制.方法将36只SD大鼠随机分为3组,即模型组、直接灸组、隔姜灸组,每组12只,每组大鼠制备RA模型.造模成功后,模型组不予以任何治疗,直接灸组、隔姜灸组分别给予直接灸法、隔姜灸法刺激RA模型大鼠的"肾俞"、"足三里".疗程结束后,取腹主动脉血并离心取血清,用含有各组血清培养基培养RA模型滑膜成纤维细胞48 h,用EdU试剂盒检测各组血清培养的滑膜成纤维细胞增殖情况并用Western blot 检测培养48 h时各组细胞TRAF6的表达量.结果艾灸血清培养的RA滑膜成纤维细胞的增殖与模型组血清培养的RA滑膜成纤维细胞相比,细胞体外增殖受到抑制,细胞TRAF6表达量明显下降,以隔姜灸效果更为显著.结论艾灸血清可能通过抑制细胞TRAF6表达从而抑制RA滑膜成纤维细胞的增殖,发挥其抗炎作用.%Objective To explore the anti-inflammatory effect of moxibustion serum on experimental RA rats by investigation of its influence on synovial fibroblast proliferation and TRAF6 expression in vitro. Methods Thirty-six SD rats were randomly divided into three groups including the model group, direct moxibustion group and ginger moxibustion group. After RA rat models were successfully established, the model group did not receive any treatment. The direct moxibustion group and ginger moxibustion group were stimulated with the "Shenshu" and "Zusanli", respectively.After treatment, abdominal aorta blood was taken and serum was collected by centrifugation. RA model synovial fibroblasts were isolated and cultured with each group of serum media for 48 h. The proliferation of synovial fibroblasts was detected by EdU kit, and the expression of TRAF6 was detected by western blot. Results Compared with the model group serum, the proliferation of synovial fibroblasts and the expression of TRAF6 were significantly decreased in two moxibustion serum groups, especially in ginger moxibustion serum group. Conclusion Moxibustion serum may exert an anti-inflammatory effect through inhibiting the TRAF6 expression and synovial fibroblast proliferation.【期刊名称】《广东药学院学报》【年(卷),期】2018(034)003【总页数】4页(P380-383)【关键词】类风湿性关节炎;艾灸;滑膜成纤维细胞;肿瘤坏死因子受体相关因子6【作者】戴历群;曹媛媛;周海燕;刘鳐;马文彬;李轩漾;刘旭光;王蕾【作者单位】四川大学华西基础医学与法医学院组织胚胎学和神经生物学教研室,四川成都 610041;四川大学华西基础医学与法医学院组织胚胎学和神经生物学教研室,四川成都 610041;成都中医药大学针灸推拿学院,四川成都610075;四川大学华西基础医学与法医学院组织胚胎学和神经生物学教研室,四川成都 610041;成都中医药大学针灸推拿学院,四川成都610075;四川大学华西基础医学与法医学院组织胚胎学和神经生物学教研室,四川成都 610041;成都中医药大学针灸推拿学院,四川成都610075;四川大学华西基础医学与法医学院组织胚胎学和神经生物学教研室,四川成都 610041【正文语种】中文【中图分类】R392类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是普遍存在的全球性健康问题，给病人带来沉重的经济负担与严重的生理折磨。
高考生物真题加练习题 专题32胚胎工程
高考生物真题加练习题专题32 胚胎工程考点胚胎工程考向胚胎工程[2019浙江五校联考,32(二)]回答有关胚胎工程的问题。
(1)“二娃”政策实施后,一些高龄夫妇选择“试管婴儿”技术孕育二胎。
要使精子和卵细胞在体外成功融合,首先须采集到成熟的卵细胞,最常用的方法是卵巢经处理后,使用超声监视器确定卵泡的位置,插入穿刺针吸取卵泡液,取出,在体外进行人工培养,促进其成熟。
同时对于男方提供的精子,须经系列处理与培养,以达到状态。
受精卵形成后,经人工培养至阶段,借助胚胎移植技术将其回输至女方体内,经过自然孕育,即得“试管婴儿”。
(2)胚胎干细胞研究发展前景诱人,其具有发育全能性和二倍体核型。
培养胚胎干细胞的培养基中,必须加入胰岛素、葡萄糖、等成分,并且要将干细胞接种在饲养层上,用于饲养层的细胞一般是。
(3)下列有关胚胎移植的说法错误的是( )A.供体与受体是同一物种的雌性B.受体与供体保持相同的生理状态C.来自供体的胚胎与受体子宫建立正常的生理和组织联系D.多胚胎移植在提高妊娠率的同时,常可获得性状完全相同的孩子答案(1)超数排卵卵母细胞获能8细胞以上的胚胎(2)动物血清胚胎成纤维细胞(3)D方法试管动物与克隆动物的比较[2019浙江十校联考,32(二)]在畜牧生产中,人们利用克隆技术和试管动物技术促进优良畜群繁育并取得了显著成绩,回答以下问题: (1)克隆高产奶牛:从供体高产奶牛体内获得体细胞后,对其进行的初次培养称为;用于核移植的供体细胞一般选用传代10代以内的细胞,原因是10代以内细胞能保持正常;将供体细胞核注入,形成重组细胞,并促进其发育成早期胚胎,之后将胚胎移入代孕母牛体内,从而获得与(填“供体奶牛”或“受体奶牛”)遗传物质基本相同的犊牛。
(2)试管牛的培育:将体外培养成熟的卵母细胞与经处理的精子在体外受精后,应将受精卵移入一系列含不同成分的培养液中继续培养,通常将胚胎培养至期,取细胞做DNA分析和性别鉴定,并将胚胎移入同种的、生理状态相同的其他雌牛体内,使之继续发育为新个体。